-25可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。
[0041 ] 3、16srDNA序列同源性分析
[0042] 常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株頂C-25，提取菌株的总DNA作 为基因扩增模板，采用通用引物27f:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492r:5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'扩增细菌16SrRNA基因保守区。25yL扩增体系包 括：1XPCR反应缓冲液，200ymol/LdNTPs，上游及下游引物各0.2ymol/L，lUTaqDNA 聚合酶，lyL模板DNA。反应条件：94°C预变性5min;94°C变性3〇8,55°(：退火4〇8,721€ 延伸30s，共25个循环；72°C延伸10min。PCR产物用1%凝胶电泳检测，阳性结果用27f: 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，1492r:5，-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ' 进行双向测 序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息 中心NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。
[0043] 菌株頂C-25的16srDNA的序列详见序列表中序列1。
[0044] 经过上述鉴定，頂C-25于2015年9月9日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为 CGMCCN0. 11344,分类命名为弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)。
[0045] 实施例2、弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25的功能分析
[0046] 1、弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25 抗菌能力检测
[0047] 活化过夜培养的頂C-25乳杆菌按10%的比例分别接种于10mLMRS液体培养基中 并置于37°C培养16h，然后再于37°C、220r/min摇床上培养3h，发酵液过滤除菌后存于4°C 备用。
[0048]金黄色葡萄球菌（StaphylococcusaureusCGMCC1. 1361) (0D600 = 0· 208) 100 倍 稀释后取100μL均匀涂布于MRS固体平板上于4°C备用。抑菌活性检测：取250μL过滤 除菌的发酵液分别加入放置在涂有指示菌平板上的牛津杯中，37°C、5%C02孵箱中过夜培 养。
[0049] 抑菌成分分析：有机酸抑菌作用检测，过滤除菌的发酵液用蛋白酶K(终浓度 0.18/1)和过氧化氢酶（终浓度0.58/1)处理。!1202抑菌作用检测，中和发酵液？!1(?!16.3) 并用蛋白酶Κ(终浓度0.lg/L)处理。细菌素样复合物抑菌作用检测，中和发酵液ρΗ(ρΗ 6. 3)并用过氧化氢酶（终浓度0. 5g/L)处理。将处理好的发酵液各取250μL分别加入置 于涂有指示菌平板上的牛津杯中，置于37°C、5%C02孵箱中过夜培养，观察照相。
[0050] 抑菌实验结果表明頂C-25乳杆菌对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，对金葡 菌的抑菌圈直径大于15毫米，具有较强的抑菌能力（图1)。将乳杆菌发酵液用蛋白酶K和 过氧化氢酶处理后，仅保留有机酸性物质，其抑菌效果与初始发酵液的抑菌效果稍弱，而未 用蛋白酶K和过氧化氢酶处理，仅调整发酵液pH时乳杆菌发酵液对金葡菌无抑菌作用，表 明頂C-25乳杆菌抑制金葡菌生长的主要成分是有机酸。
[0051] 2、弯曲乳杆菌对阴道上皮细胞的粘附作用
[0052] 阴道上皮脱落细胞取自于20余例健康（临床检测显示无生殖系统感染）育龄期 妇女，各细胞样品标号后分别加入MEM培养基（pH4. 0)，120g离心10分钟，再重复离心2 次，洗掉表面细菌，用MEM培养基调整阴道上皮脱落细胞浓度为105个/mL;活化过夜培养 弯曲乳杆菌（Lactobacillus.crispatusnMC-25CGMCCNo. 11344使其浓度为（10sCFU/mL) 〇 阴道上皮脱落细胞与所述弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25各500μL等体 积混合后置于37°C摇床（转速为100r/min，旋转半径为2. 54cm)孵育lh，然后用0. 8μηι滤 膜过滤，去掉游离弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25,并将滤膜轻压于盖玻片 上，固定细胞进行革兰氏染色后油镜观察，分别计数三个细胞粘附细菌数，计算每个细胞平 均粘附细菌数。
[0053]同时将另外一株同样采用实施例1的方法分离鉴定得到的，但与阴道上皮细胞粘 附定植力较弱的弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)作为负对照。
[0054] 结果显示，弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25对分离自20余例健康 育龄期妇女的阴道上皮细胞均具有较强的粘附作用。图2图左为分离于健康育龄期妇女的 阴道上皮脱落细胞；图右为阴道上皮脱落细胞与弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus) nC-25)较强的粘附作用。从20余例中，随机选取4例，进行统计分析，计算得到每个阴道 上皮细胞平均粘附弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25的数量达75个。
[0055] 表2阴道上皮细胞粘附弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25的数量统 计
[0056]
[0057] 综合实施例1和实施例2的结果，本发明的弯曲乳杆菌（Lactobaci1lus. crispatus)IMC-25既具有较强的抗菌能力（可有效抑制病原菌和其他条件致病菌的生 长），又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用（保证了菌株在阴道上皮的定植），这就使 得弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25成为有效防治泌尿生殖道感染的候选 益生菌菌株。
【主权项】
1. 一株弯曲乳杆菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25,其保藏号CGMCCNO. 11344。2. 权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备预防和/ 或治疗泌尿生殖道感染产品中的应用。3. 权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备抗菌产 品中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述菌为细菌，所述细菌具体为金黄色葡 萄球菌。5. 权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备粘附阴 道上皮细胞产品中的应用。6. -种预防和/或治疗泌尿生殖道感染产品，其活性成分为权利要求1所述的弯曲乳 杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。7. -种抗菌产品，其活性成分为权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵产物或其菌悬 液或其培养液。8. 根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述菌为细菌，所述细菌具体为金黄色葡 萄球菌。9. 一种粘附阴道上皮细胞产品，其活性成分为权利要求1所述的弯曲乳杆菌或其发酵 产物或其菌悬液或其培养液。10. 根据权利要求2-5中任一所述的应用或权利要求6-9中任一所述的产品，其特征在 于：所述产品为药物或菌剂。
【专利摘要】本发明公开了用于防治妇女泌尿生殖道感染的弯曲乳酸杆菌。本发明所提供的弯曲乳杆菌具体为弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-25，本发明的弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-25具有较强的抗菌能力，可有效抑制外来的病原菌和其他条件致病菌的生长；同时又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用，保证了菌株在阴道上皮的定植。本发明所提供的弯曲乳杆菌(Lactobacillus.crispatus)IMC-25在泌尿生殖道感染防治方面具有一定的应用前景。CGMCC No.1134420150909
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/225, A61K35/74, A61P31/04
【公开号】CN105349474
【申请号】CN201510954618
【发明人】朱宝利, 张瑞芬, 律娜, 王黎明, 李晶
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月17日