一种类海胆肽口服液的制备方法与流程

文档序号:11145198阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种类海胆肽口服液及其制备方法,其特征在于:经过下列工艺步骤:

(1)、海胆黄细胞RNA的提取

(1.1)、匀浆处理

称取100~200mg海胆黄组织在液氮中磨碎,加入1~2ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理;

(1.2)、静置

将步骤(1.1)中得到的匀浆后的混合物在室温条件下静置3~5min,使核酸蛋白复合物完全分离;

(1.3)、离心去杂质

将步骤(1.2)中得到的静置后的混合物于2~8℃条件下,10000g离心8~10min,收取上清液;

(1.4)、抽提

将步骤(1.3)中得到的上清液中加入其体积10%~20%的氯仿,剧烈振荡15~20s,室温静置2~3min;

(1.5)、离心

将步骤(1.4)中得到的室温静置后的混合物于2~8℃条件下,10000g离心10~15min;样品分为三层:有机相、水相和中间层;

(1.6)、沉淀

将步骤(1.5)中的水相层转移到新试管中,按体积比1:1~2的比例加入异丙醇,室温静置8~10min,于2~8℃条件下,10000g离心8~10min,管侧和管底出现胶状沉淀,移去上清液,即得RNA沉淀;

(1.7)、洗涤

向步骤(1.6)中得到的RNA沉淀中加入1~1.5ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤,再于2~8℃条件下,6000~7500g离心3~5min,弃上清液,得洗涤后的RNA沉淀;

(1.8)、干燥

将步骤(1.7)中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥5~10min,然后加入25~200μl无RNase的水,用枪头吸打混匀,于55~60℃条件下静置8~10min,使RNA溶解,-70℃保存,备用;

(2)、反转录

将步骤(1.8)中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法,利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录,获得海胆黄细胞的cDNA;

(3)、构建表达载体

将步骤(2)中得到的海胆黄细胞的cDNA以反转录产物为模板,利用大量随机引物:引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收,酶切后,回收产物与pET32(a)载体连接,转化大肠杆菌DH5α,得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌,挑取菌落,接种入LB液体培养基,待菌液浓度为OD值接近1.0时,向其中加入菌液体积10%~15%的甘油,-70℃保存,得到转化入表达载体的菌株;

(4)、蛋白表达

挑取步骤(3)中保存的菌株,接种体积为10ml LB液体培养基,37℃振荡培养8~12h;将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中,37℃振荡培养8~12h;将500ml菌液接种至50~80L发酵罐中,跟踪菌体生长指标,待OD600≈0.4~0.6,向其中加入IPTG至终浓度为0.3~0.4mM,继续振荡培养6h;开罐取菌液,12000g离心30~60s,用发酵液体积10%~20%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬,混匀,冰上超声破碎;12000g离心30~60s,取上清液,即为海胆黄RNA随机原核表达粗产物;

(5)、酶切

将步骤(4)中的海胆黄RNA随机原核表达粗产物采用复合蛋白酶进行充分酶切,得到类海胆酶切溶液;其中,所述的复合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶中的两种或多种;复合蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的1%~2.5%;

(6)、超滤浓缩

将步骤(5)中得到的类海胆酶切溶液利用2000Kd的超滤管进行超滤,收集滤过液,即得2000Kd以下的2~6个氨基酸大小的类海胆肽溶液;

(7)、调配

称取步骤(6)中得到的类海胆肽溶液加入其质量6%~6.5%的枸杞提取液、1%~1.5%的薄荷提取液、0.00015~0.00018%的乳酸链球菌素混合均匀,得调配液;

(8)、灭菌

将步骤(7)中得到的调配液经精滤膜精滤后,进行高温瞬时灭菌;

(9)、灌装

将步骤(8)中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按预设重量进行分瓶真空灌装,封口,获得类海胆肽口服液。

2.根据权利要求1所述的一种类海胆肽口服液及其制备方法,其特征在于:所述的枸杞提取液其是称取枸杞采用去离子水冲洗后,按照料液比1:30~40添加去离子水,浸泡2~3h,蒸煮20~30min,过滤,收集滤液后进行抽滤,澄清透过液即得枸杞提取液。

3.根据权利要求1所述的一种类海胆肽口服液及其制备方法,其特征在于:所述的薄荷提取液其称取薄荷采用去离子水冲洗后,按照料液比1:30~40添加去离子水,浸泡2~3h,打浆,蒸煮20~30min,过滤,收集滤液后进行抽滤,澄清透过液即得薄荷提取液。

4.根据权利要求1所述的一种类海胆肽口服液及其制备方法,其特征在于:所述的匀浆后的混合物静置时的室温控制为15~30℃。

5.根据权利要求1所述的一种类海胆肽口服液及其制备方法,其特征在于:所述的高温瞬时灭菌的灭菌温度为120~140℃,灭菌时间为4~6s。

6.根据权利要求1所述的一种类海胆肽口服液及其制备方法,其特征在于:所述的真空灌装的真空度为0.04~0.05Mpa,灌装温度控制在60~75℃。

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