军团菌菌体制备氨基酸构型转换试剂的应用的制作方法

本发明涉及一种利用军团菌菌体及其代谢产物将D-L型氨基酸转换成L-型氨基酸的方法。

背景技术：

自然界中，构成蛋白质的氨基酸通常为L构型。氨基酸合成的方法通常包括化学合成法、微生物发酵法和酶法。化学合成法可获得的氨基酸种类多，但是合成的外消旋体（D-L氨基酸）需要经过对映体拆分才能获得单一构型的氨基酸，而这一过程成本十分昂贵。发酵法是一种利用微生物具有合成自身所需各种氨基酸的能力，通过发酵工艺制备氨基酸的一种常用方法。该法尽管原料廉价，但制备的氨基酸产品单一，纯度不高，有伴生氨基酸产生，并且发酵菌种的选育较为麻烦也不易控制。酶法是借助多种活性酶将有机物转变成所需的氨基酸的一种方法。此法尽管可获得100 %纯度的L型氨基酸，但过程中必然会导致酶的失活，而酶再生成本依然昂贵。本发明直接利用经过营养筛选的军团菌菌体湿品，无需精细的分离纯化，即可高效实现氨基酸外消旋体选择性构型拆分，用生物的方法解决了化学合成法后期对映体拆分难、成本高的问题。

技术实现要素：

技术问题：

为弥补现有氨基酸合成技术成本昂贵，工业生产价值低的不足，本发明提供了一种利用军团菌菌体湿品作为氨基酸构型转换试剂，直接对化学合成得到的D-L型氨基酸进行构型转换，制备高纯度的L-氨基酸。该法工艺简单、成本较低、获得的产品纯度高，具备广阔的工业化应用前景。

技术方案：

本发明人根据现代生物学理论，运用工业微生物关键技术及现代分析检测技术，从而完成本发明。

本发明的目的是提供一种能将D-L型氨基酸转化为L型氨基酸的一种生物方法。具体工艺过程如下：

1.细菌的培养条件

按照以下方法制备适合军团菌快速生长的液体培养基。称取10g N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid; ACES buffer)；10g 酵母抽提物 (Yeast extract) 溶解至800mL双蒸水中，调节pH值至6.9-7.0后，高压蒸汽灭菌，冷却备用。另外分别称取5g 小牛血清蛋白 (Bovin serum albumin), 0.4g L-半胱氨酸盐酸盐(L-cysteine hydrochloride), 0.25g 焦磷酸亚铁 (Ferrous pyrophosphate), 充分溶解于200 mL双蒸水中，通过0.22μm孔径的微孔滤膜抽滤除菌后，加入到上述已灭菌备用的溶液中，混合即得。该菌在固体琼脂中的生长所用的平板采用BCYE琼脂平板（已有商品）。

2.菌种的营养适应性筛选

将嗜肺军团菌标准菌种ATCC33152（购自美国菌种保藏中心）接种于另外添加有10 % D-L型半胱氨酸的上述液体培养中，于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，每隔7日，吸取1mL传代至新鲜的上述培养基中继续培养，重复上述操作10次以上，即可获得具有较高氨基酸构型转换效率的菌种。将该突变菌株妥善保藏于-70 ℃ 冰箱备用。

3.细菌的传代与增殖

将上述经营养适应性筛选的菌种活化后，接种于新鲜的不含D-L型半胱氨酸的液体培养基 (工艺1中所述) 中，置于37 ℃恒温轨道培养箱中，200rmp震荡培养48 h, 向培养液中加入等体积的3mol/L的硫酸铵，使其中的蛋白或酶沉淀到底部，再将其于10000 rmp离心 30 min，菌体及其中的蛋白或酶均沉淀于管底，将沉淀湿体收集起来，保藏于-70 ℃ 冰箱备用。

4.氨基酸构型转换与产品回收

向化学合成得到的外消旋体D-L型半胱氨酸配制成水溶液，并向其中加入上述湿体沉淀物（包含菌体及代谢产物中的蛋白成分或其它成分），加入量为100 mg/mL, 将溶液置于37 ℃，200 rmp的摇床中震荡培养24 h。再向溶液中加入等体积的3 mol/L硫酸铵，10000 rmp离心 30 min后，弃去沉淀，将上清液通过离子交换法进行处理，可收获纯度达97%以上的L型半胱氨酸。

有益效果：

本发明所涉及的外消旋体拆分方法，与现有技术相比具有如下优势：

1、本发明首次发现经过嗜肺军团菌ATCC33152具有D-L型氨基酸进行构型转换，可以制备高纯度的L-氨基酸。

2、本发明涉及的方法属于生物方法，无需使用有毒化学品，对人体和环境几乎无危害。

3、本发明涉及的方法工艺简单，成本低廉，适合工业化生产，可解决氨基酸产品价格过于昂贵的问题。

以下通过实施例进一步阐述本发明内容，本发明保护范围不以实施例为限。本发明在本技术领域具有多种公知的替代或变形，在不脱离本发明实质意义的前提下，均在本发明的保护范围之内。

附图说明：

图1：经营养适应性筛选的嗜肺军团菌的菌落形态。

图2：L型半胱氨酸电化学差分脉冲伏安（DPV）曲线。曲线1：0.125mg/ml浓度的L型半胱氨酸溶液；曲线2：同法配制的不含L型半胱氨酸的阴性对照溶液。

图3：L型半胱氨酸电化学检测标准曲线（Ipmax vs Cmg/ml）。

图4：电化学方法监测L型半胱氨酸的含量。

图5：营养适应性筛选频次对L-半胱氨酸转换收率的影响。

具体实施方式

实施例1

本发明涉及的氨基酸构型转换方法如下：

1. 细菌的培养条件

按照以下方法制备适合军团菌快速生长的液体培养基。称取10g N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid; ACES buffer)；10g 酵母抽提物 (Yeast extract) 溶解至800mL双蒸水中，调节pH值至6.9-7.0后，高压蒸汽灭菌，冷却备用。另外分别称取5g 小牛血清蛋白 (Bovin serum albumin), 0.4g L-半胱氨酸(L-cysteine hydrochloride), 0.25g 焦磷酸亚铁 (Ferrous pyrophosphate), 充分溶解于200 mL双蒸水中，通过0.22μm孔径的微孔滤膜抽滤除菌后，加入到上述已灭菌备用的溶液中，混合即得。

2. 菌种的营养适应性筛选

将嗜肺军团菌标准菌种ATCC33152（购自美国菌种保藏中心）接种于另外添加有10 % D-L型半胱氨酸的上述液体培养中，于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，每隔7日，吸取1mL传代至新鲜的上述培养基中继续培养，重复上述操作10次以上，即可获得具有较高氨基酸构型转换效率的菌种。将该突变菌株妥善保藏于-70 ℃ 冰箱备用。

3. 细菌的传代与增殖

将上述经营养适应性筛选的菌种活化后，接种于新鲜的不含D-L型半胱氨酸的液体培养基 (工艺1中所述) 中，置于37 ℃恒温轨道培养箱中，200rmp震荡培养48 h, 向培养液中加入等体积的3mol/L的硫酸铵，使其中的蛋白或酶沉淀到底部，再将其于10000 rmp离心 30 min，菌体及其中的蛋白或酶均沉淀于管底，将沉淀湿体收集起来，保藏于-70 ℃ 冰箱备用。

4. 氨基酸构型转换与产品回收

向化学合成得到的外消旋体D-L型半胱氨酸配制成水溶液，并向其中加入上述湿体沉淀物（包含菌体及代谢产物中的蛋白成分或其它成分），加入量为100 mg/mL, 将溶液置于37 ℃，200 rmp的摇床中震荡培养24 h。再向溶液中加入等体积的3 mol/L硫酸铵，10000 rmp离心 30 min后，弃去沉淀，将上清液通过离子交换法进行处理，可收获纯度达97%以上的L型半胱氨酸。

实施例2

按照上述工艺（工艺2所述）进行菌种的营养适应性筛选，所获得的嗜肺军团菌菌株在BCYE琼脂平板上的菌落生长形态，见图1。

实施例3

电化学分析法监测转换过程中L-半胱氨酸的含量

1. L型半胱氨酸在金盘电极上的电化学行为

1.1. 实验方法：配制一定浓度的L型半胱氨酸，定性检测其在三电极体系（工作电极：金盘电极φ=5mm；参比电极：饱和甘汞电极；对电极：铂丝）中的电化学行为。

1.2. 结果与结论：见图2，DPV结果表明L-半胱氨酸在金盘电极表面有电化学信号响应，故有望构建该物质的含量定量分析方法。

型半胱氨酸含量测定标准曲线

2.1. 实验方法：分别配制0.5，0.25，0.125，0.0625，0.0313，.......等2倍稀释的L型半胱氨酸水溶液，按照上述方法进行电化学测定，并记录最大峰电流（Ip_max）值。以物质浓度为横坐标，Ip _max 为纵坐标，制作标准曲线。

2.2. 结果与结论：见图3，由标准曲线可以看出Ip _max 与L型半胱氨酸的浓度呈线性关系。此法可用以检测样品中L型半胱氨酸物质的含量变化。

根据电化学DPV Ip_max值检测工艺中L型半胱氨酸的含量变化

3.1. 实验方法：根据工艺，将化学合成获得的外消旋体D-L型半胱氨酸配制成水溶液，并向其中工艺所述的湿体100 mg/mL, 置于37 ℃，200 rmp的摇床中震荡培养24 h。不同时间段分别取样进行电化学DPV检测, 将检测得到的Ip_max 值

代入线性方程：Ip _max=32.468C+0.37642; 计算出溶液中不同反应时间点的L型半胱氨酸的含量。

3.2. 结果与结论：见图4，转化实验过程中，L型半胱氨酸物质的含量在不断增加，表明了DL型半胱氨酸正逐渐转换成单一L型构象，当达到18小时后，基本无增加，表明转换反应基本完成。

实施例4

菌种的营养适应性筛选实验对L-半胱氨酸转换收率的影响

3.1. 实验方法：根据工艺2，将不同传代筛选频次( 0,1,2...10,11,12) 分别收获菌种，然后按照工艺3和4进行氨基酸转换实验，再根据实例所需的方法计算L型半胱氨酸的含量，通过计算得到不同传代频次的13个批次（Batch）产品的收率（Yield）百分比。

3.2. 结果与结论：见图5，由曲线可以看出，L型半胱氨酸的收率百分比随着传代频次的增加而增长，达到10次传代以后，收率百分比达到较高水平，随后的增长幅度很低。因此，工艺选择传代至少10次。