用于检测bmpr1b基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测BMPR1B基因突变的引物组，包括BMPR1B基因第1至第10外显子区、3’UTR、5’UTR和启动子对应的PCR扩增引物组和PCR测序引物。本发明还公开了所述引物组的用途、以及包含所述引物组的试剂盒。所述的引物组可以专一性鉴别BMPR1B基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。
【专利说明】
用于检测BMPR1B基因突变的引物组、该引物组的用途及包含 该引物组的试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及引物，具体涉及用于检测BMPR1B基因突变的引物组，本发明还涉及该 引物组的用途，以及包含该引物组的试剂盒。
【背景技术】
[0002] BMPRlB(bone morphogenetic protein receptor, type IB)属于转化生长因子β (TGF-β)受体超家族中的一员，为跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶受体。TGF-β超家族的信号传 导系统具有多种生物学的功能，包括细胞功能能调节和组织细胞分化等。
[0003] 肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)^25mmHg的一组临床病理生理综合征。肺动脉高压 可以作为一种疾病而独立存在，更常见的是很多疾病进展到一定阶段的病理生理表现。由 于肺血管重塑引起肺循环血流动力学改变，最终可导致右心衰竭，甚至死亡。这是一种极度 恶性的疾病，七成多患者是年轻人，几乎每个人都知道癌症愈后差，但没有人知道肺动脉高 压是一种极度恶性疾病，它的病因复杂、发病率高、误诊率高、危害性强，其愈后是灾难性 的，可以说，这种病就是心血管疾病中的癌症。这种疾病平均发病年龄是36岁，75%患者集中 于20-40岁年龄段，还有15%患者年龄在20岁以下，几岁的孩子也会发病。世界上该病的发病 率在1 X 10_5~1 X 10_6之间，其中约32%为遗传性的。BMPR1B作为细胞表面的受体之一如果 发生异常突变，可以导致其参与的下游的信号通路阻断，导致肺血管壁的相关细胞增殖失 控，进而引起肺动脉高压。因此，采用基因扩增、测序，检测BMPR1B基因是否突变以及寻找突 变位点，有助于识别家系中高风险的成员，以及评估未出生孩子的患病风险，这对提高人口 素质，优生优育有重要的意义。并且对医生指导用药，基因评估具有重要的意义。目前，传统 上采用荧光定量PCR的方式检测突变，这个方法局限性很大，它只能检测已经知道的突变位 点，并且一次荧光定量PCR只能检测一个点的突变，且准确率不高。BMPR1B基因突变对不同 的人突变的位置和方式是不一样的，用荧光定量PCR方法不能达到检测的目的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是提供一种用于检测BMPR1B基因突变的引物组。
[0005] BMPR1B基因第1到第10外显子区、3'17^、5'17^和启动子中的任意一个区域在结构 上发生碱基对组成或排列顺序的改变，都视为BMPR1B基因发生了突变。因而，根据BMPR1B基 因第1至第10外显子区、3'17^、5'17^和启动子分别设计出能专一性鉴别810^18基因是否突 变的特异性引物组，可通过PCR扩增和测序测定BMPR1B基因上述区域是否发生改变，以鉴定 BMPR1B基因是否发生突变，因此，本发明的用于检测BMPR1B基因突变的引物组可以是 BMPR1B基因第1至第10外显子区、3'UTR、5'UTR和启动子分别对应的引物组中的一组或两组 以上的组合。
[0006] 本发明第一个目的提供的用于检测BMPR1B基因突变的引物组，包括BMPR1B基因第 1到第10外显子区，3 ' UTR、5 ' UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组，即选自BMPR1B基因第 1到第10外显子区、3 ' UTR、5 ' UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组，具体地，所述引物组 选自BMPR1B基因的第1外显子区(Exonl)的PCR扩增引物组、第2外显子区(Exon2)的PCR扩增 引物组、第3外显子区(Exon3)的PCR扩增引物组、第4外显子区(Exon4)的PCR扩增引物组、第 5外显子区(Exon5)的PCR扩增引物组、第6外显子区（Exon6)的PCR扩增引物组、第7外显子区 (Exon7)的PCR扩增引物组、第8外显子区(Exon8)的PCR扩增引物组、第9外显子区(Exon9)的 PCR扩增引物组、第10外显子区（ExonlO)的PCR扩增引物组、3 ' UTR的PCR扩增引物组、5 ' UTR 的PCR扩增引物组和启动子的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的组合，所述的上述各 PCR扩增引物组为表1所示。
[0007] 本发明所述的引物组还包括BMPR1B基因第1到第10显子区、3 ' UTR、5 ' UTR和启动子 分别对应的PCR测序引物组中的一组或两组以上的组合。
[0008] 本发明所述的PCR测序引物组如表2所示。
[0009] 本发明的目的之二是提供使用上述PCR扩增引物组和PCR测序引物在制备通过PCR 扩增自生物样品获得核酸样品检测BMPR1B基因是否突变的试剂中的用途。
[0010]本发明的目的之三是提供一种用于检测BMPR1B基因突变的试剂盒，以方便采用 DNA测序技术检测导致肺动脉高压发病的BMPR1B基因是否突变。具体地，该用于检测BMPR1B 基因突变的试剂盒，包括BMPR1B基因的第1至第10显子区、3'UTR、5'UTR和启动子分别对应 的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的组合，PCR扩增引物组为表1所示。
[0011] 本发明所述的试剂盒还包括如表2所示的BMPR1B基因的第1至第10显子区、3'UTR、 5 ' UTR和启动子分别对应的PCR测序引物组中的一组或两组以上的PCR测序引物组。
[0012] 本发明还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。
[0013] 所述的PCR扩增试剂包括dNTP、Taq DNA聚合酶等。
[0014] 所述的PCR产物纯化试剂包括SAP酶、Exo頂每等。
[0015] 所述的DNA测序试剂包括BigDye mix、EDTA溶液、HIDI溶液等。
[0016] 本发明的有益效果： (1)本发明根据BMPR1B基因第1至第10显子区、3'UTR、5'UTR和启动子，共13区域序列 设计特异性引物组，可以专一性鉴别BMPR1B基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯 一性。与传统的荧光定量PCR检测单点突变的方法相比，其可以检测13个区域范围的所有的 BMPR1B基因是否发生突变，适用的范围广泛，并且它使用的是测序比对的方法进行突变检 测，出错率会低于荧光定量PCR的检测方法，且造价也低于荧光定量PCR检测法。
[0017] (2)本发明提供的引物组及试剂盒用于检测肺动脉高压的致病基因 BMPR1B基因 的突变体，可以快速的检测患者的基因是否突变，以便肺动脉高压的疾病病因诊断。同时还 可以用于BMPR1B SNP位点与基因功能之间关系的科学研究上。
[0018] (3)本发明每个引物扩增的条件类似，可以13个区域分别进行扩增测序，也可以 同时进行扩增测序。这样的测序的方法检测突变比通常荧光定量PCR的方法要更准确，同时 检测范围更广泛，测序范围内的任何一个位置突变或插入碱基都能从测序图谱中发现，而 荧光定量PCR只能检测目的位点的突变，局限性很大，且准确性不高。
[0019] (4)本发明的引物组可以检测BMPR1B基因是否突变以及寻找突变位点，有助于 识别家系中高风险的成员，以及评估未出生孩子的患病风险，这对提高人口素质，优生优育 有重要的意义，并且对医生指导用药，基因评估具有重要的意义。
【附图说明】
[0020] 图1是血液基因组DNA的1%的Agarose电泳图； M:DNA DL15000 maker，1、2:外周血基因组DNA。
[0021] 图2是本发明实施例五中的血液样本中的BMPR1B基因的测序峰图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0023] 实施例一 依据NCBI Gene Bank(NG_009245)公开的BMPR1B基因的第1到第10外显子区、3'UTR、5' UTR和启动子序列，设计出用于检测BMPR1B基因是否发生突变的引物组，该引物组包括对应 于以上区域的PCR扩增引物组和PCR测序引物组，结果见表1和表2。
[0024] 实施例二 用于检测BMPR1B基因突变的试剂盒，包括BMPR1B基因第1到第10显子区、3'UTR、5'UTR 和启动子序列分别对应的PCR扩增引物组与PCR测序引物组，共24每条引物10D，各对引物序 列参见表1和表2。
[0025]本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。
[0026] 实施例三 用于检测BMPR1B基因突变的试剂盒，包括： (l)BMPRlB基因第1到第10显子区、3'UTR、5'UTR和启动子序列的PCR扩增引物组与PCR 测序引物组，共24对，每条引物10D，各对引物序列参见表1和表2。
[0027] (2)PCR扩增试剂：2.5mM dNTP混合液 40μ1、5X扩增缓冲液（含Mg2+)100yl、 5Units/ul Taq DNA聚合酶 5μ1。
[0028] (3) PCR产物纯化试剂：1 U/ul SAP酶 20yl、10U/ul Exo頂每 10μ1。
[0029] (4)PCR测序试剂：BigDye 3.1 π?χ50μ1、0·125Μ EDTA 溶液 50μ1、无水乙醇lml、 75% 乙醇溶液 1 · 5mL、HIDI 溶液500μ1。
[0030] 本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。
[0031] 实施例四 一人份检测BMPR1B基因突变的试剂盒的使用步骤： (1)一份病人的血液lmL，提取血液基因组DNA，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(250) Cat.no.51104提取基因组DNA。1% Agarose凝胶电泳，结果见图1。
[0032] (2)PCR扩增:24对引物共进行24个PCR反应，每个反应体系总体积为20ul， 150ng/yl 基因组 DNA 1 μL 2.5 mM dNTP 1 μL 上游引物（10 μΜ) 0.5 μL 下游引物（10 μΜ) 0.5 μL 5Χ扩增缓冲液（含Mg2+) 4 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μΙ) 0.2 μL dd Η2Ο up to 20μ1〇 PCR扩增反应条件：
(3)PCR产物纯化:共进行24个PCR纯化反应，每个反应体系总体积20μ1，其中， PCR产物 8 μL SAP酶（1 U/μΙ) 1 μL Exonucleses(lOU/μΙ) 1 μL dd Η2Ο up to 10μ1 PCR反应条件为:37 °C孵育60min，70 °C 10 min。
[0033] (4) DNA测序反应:共进行24个测序反应。每个反应的体系为2μ1 BigDye3.1 mix， 2μ1测序引物（0·4μΜ)，加入2μ1纯化的PCR产物。反应条件:96 〇C lmin;96 〇C 10s，50 0C 5S，60 〇C 4min，28个循环反应。
[0034] (5)反应结束后纯化测序产物，即每管加入ΙμL 0.125M的EDTA和15μ1的乙醇，常温 放置15min，4°C lOOOg/min离心30min，小心倒去上清，加入75%乙醇溶液，4 °C lOOOg/min 离心15min，小心倒去上清;室温放置20min。瞭干后在管中加入Hi-Di去离子甲酰胺10μ1，放 入测序仪中。测序产物上ABI3130XL测序仪，测序文件用Polyphred软件分析，并结合人工校 对记录后整理出结果。如果所得测序结果中，BMPR1B基因第1到第10外显子区、3'UTR和启动 子序列中任意一个区域的结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，认为BMPR1B基因发生 了突变，反之则没有发生突变。
[0035] 实验结果： 此样本的BMPR1B基因并未发生突变。
[0036] 实施例五 与实施例四不同的是： (2)PCR扩增:24对引物共进行24个PCR反应，每个反应体系总体积为20ul，包含基因组 DNA(10ngAU)lyl、dNTP混合液（2.5mM each)lyl、5X扩增缓冲液（含Mg2+)4yl、上下游引 物（10μΜ)各0.5μ1，Taq DNA聚合酶(5υ/μ1)0.2μ1，去离子水12.8μ1。反应条件为反应条件 为:98°C反应5min;98°C反应15 s，60°C反应40 s，72 °C反应lmins，共35个循环反应；最 后72〇C延伸反应2 min。
[0037] 测序结果如图2所示，箭头指出的位置有明显双峰，说明是此样本在外显子5的这 个位点有突变，即突变碱基为c. 479G>A氨基酸突变为p. Serl60Asn。
[0038] 本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据 本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技 术方案的范围内。
【主权项】
1.用于检测BMPRlB基因突变的引物组，其特征在于，包括BMPRlB基因第1至第10外显子 区、3 ' UTR、5 ' UTR和启动子对应的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组包括： (1) 所述启动子的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的引物PFl和 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列所示的引物PRl的引物组、SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列 所示的引物PF2的引物组和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物PR2的引物组、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物PF3的引物组和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的引物PR3的 引物组； (2) 所述5'UTR的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的引物 SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的引物PR4的引物组、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引 物PF5和SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列的引物PR5的引物组、SEQ ID NO. 11所示的核苷 酸序列的引物PF6和SEQ ID NO. 12所示的核苷酸序列的引物PR6的引物组； (3) 所述Exonl的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO. 13所示的核苷酸序列的引物PF7和 SEQ ID NO. 14所示的核苷酸序列的引物PR7的引物组； (4) 所述Exon2的PCR扩增引物组：SEQ ID NO. 15所示的核苷酸序列的引物PF8和SEQ ID NO. 16所示的核苷酸序列的引物PR8的引物组； (5) 所述Exon3的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO. 17所示的核苷酸序列的引物 SEQ ID NO. 18所示的核苷酸序列的引物PR9的引物组； (6) 所述Exon4的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO. 19所示的核苷酸序列的引物PFlO和 SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列的引物PRlO的引物组； (7) 所述Exon 5的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列的引物PFll 和SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的引物PRll的引物组； (8) 所述Exon6的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物PF12和 SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列的引物PRl2的引物组； (9) 所述Exon7的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物PF13和 SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的引物PRl3的引物组； (10) 所述Exon8的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO. 27所示的核苷酸序列的引物PF14 和SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的引物PR14的引物组； (11) 所述Exon9的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列的引物PF15 和SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列的引物PRl5的引物组； (12) 所述ExonlO的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的引物PF16 和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列的引物PR16的引物组； (13) 所述3'UTR的PCR扩增引物组:包括SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列的引物PF17 和SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的引物PR17的引物组、SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列 的引物PF18和SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的引物PR18的引物组、SEQ ID NO.37所示的 核苷酸序列的引物PF19和SEQ ID NO. 38所示的核苷酸序列的引物PR19的引物组、SEQ ID NO. 39所示的核苷酸序列的引物PF20和SEQ ID NO. 40所示的核苷酸序列的引物PR20的引物 组、SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列的引物PF21和SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列的引物 PR21的引物组、SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列的引物PF22和SEQ ID NO.44所示的核苷酸 序列的引物PR22的引物组、SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列的引物PF23和SEQ ID NO.46所 示的核苷酸序列的引物PR23的引物组、SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列的引物PF24和SEQ ID NO. 48所示的核苷酸序列的引物PR24的引物组。2. 用于检测BMPRlB基因突变的引物组，其特征在于，还包括BMPRlB基因第1至第10外显 子区、3 ' UTR、5 ' UTR和启动子对应的PCR测序引物，所述的PCR测序引物包括： (14) 所述启动子的PCR测序引物包括SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的引物PFl、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列所示的引物PF2和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物PF3; (15) 所述5'UTR的PCR测序引物包括SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列的引物PF4、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引物PF5、SEQ ID NO. 11所示的核苷酸序列的引物PF6; (16) 所述Exonl的PCR测序引物组包括SEQ ID NO. 13所示的核苷酸序列的引物PF7; (17) 所述Exon2的PCR测序引物组包括SEQ ID NO. 15所示的核苷酸序列的引物PF8; (18) 所述Exon3的PCR测序引物组包括SEQ ID NO. 17所示的核苷酸序列的引物PF9; (19) 所述Exon4的PCR测序引物组包括SEQ ID NO. 19所示的核苷酸序列的引物PF10; (20) 所述Exon5的PCR测序引物组包括SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列的引物PFll; (21) 所述Exon6的PCR测序引物组包括SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物PF12; (22) 所述Exon7的PCR测序引物组包括SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物PF13; (23) 所述Exon8的PCR测序引物组包括SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列的引物PF14; (24) 所述Exon9的PCR测序引物组包括SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列的引物PF15; (25) 所述ExonlO的PCR测序引物组包括SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的引物PF16; (26) 所述3'UTR的PCR测序引物组包括SEQ ID N0.33所示的核苷酸序列的引物PF17、 SEQ ID NO. 35所示的核苷酸序列的引物PF18、SEQ ID NO. 37所示的核苷酸序列的引物 PF19、SEQIDN0.39所示的核苷酸序列的引物PF20、SEQIDN0.41所示的核苷酸序列的引 物PF21、SEQIDN0.43所示的核苷酸序列的引物PF22、SEQIDN0.45所示的核苷酸序列的 引物PF23、SEQ ID从).47所示的核苷酸序列的引物??24。3. 权利要求1所述的BMPRlB基因第1至第10外显子区、3'17^、5'17^和启动子对应的卩0? 扩增引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测BMPRlB基因是否突变的试剂 中的用途。4. 包含权利要求1的引物组的用于检测BMPRlB基因突变的试剂盒，其特征在于，包含权 利要求1所述的BMPRlB基因第1至第10外显子区、3'17^、5'17^和启动子对应的？0財广增引物 组。5. 根据权利要求4所述的用于检测BMPRlB基因突变的试剂盒，其特征在于，还包含权利 要求2所述的BMPRlB基因第1至第10外显子区、3'17^、5'17^和启动子对应的?0?测序引物。6. 根据权利要求4或5所述的用于检测BMPRlB基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括 常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。
【文档编号】C12N15/11GK105886635SQ201610306419
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】卢文菊, 张晨婷, 王健
【申请人】广州医科大学附属第医院, 广州医科大学附属第一医院