一组与种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低相关的snp位点及其应用

一组与种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低相关的snp位点及其应用
【专利摘要】本发明涉及一组用于筛选和检测种公牛畸形率和冻精解冻后活力高低的SNP分子标记。具体的，SNPs位点位于ARID4A基因第53位和826位碱基，两个SNPs位点在种公牛群体中有多种基因型组合，通过提取种公牛冻精的基因组DNA，检测其ARID4A基因的基因型组合，预测种公牛的畸形率及冻精解冻后活力。本发明成功筛选出种公牛ARID4A基因的SNPs，首次阐明了种公牛ARID4A基因单核苷酸多态性与种公牛畸形率和冻精解冻后活力的相关性，提供了用于检测种公牛畸形率和冻精解冻后活力的简便、高效方法，并开发出相应的检测试剂盒。该试剂盒具有成本低、可靠性稳定、效率高等优点，可以用于早期优质种公牛的筛选。
【专利说明】
一组与种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低相关的SNP位点 及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一组与种公牛冻精解冻后活力和 畸形率高低相关的SNP位点及其应用，尤其是涉及通过分子标记技术检测与种公牛畸形率 和冻精解冻后活力高低相关的ARID4A基因的SNPs位点，提供检测种公牛畸形率和冻精解冻 后活力高低的方法及试剂盒，应用于优良家畜繁殖性状的早期选育。
【背景技术】
[0002] 牛奶营养价值极高，是我们日常生活中不可或缺的食品。中国荷斯坦奶牛是国内 饲养范围最广，产奶量最多的一个品种。在人工授精及冷冻精液等技术被广泛推广的今天， 种公牛已经成为现代奶牛改良体系中最重要的一环，其精液品质优劣是牛群能否可以快速 稳定发展的指示标。公牛的采精量、鲜精活力、冻精解冻后活力、鲜精密度和精子畸形率是 国际公认的衡量种公牛精液品质的重要指标。一项权威数据表明，我国的荷斯坦公牛年均 冻精生产量仅仅为2.18万份，但在国外，最高的生产水平是一头公牛年产冻精25万份。这种 巨大的差距，直接表明了我国奶牛行业的实际水平还处在起步阶段，未来还有较长路要走。 因此，如何提高公牛整体遗传素质，解决公牛冻精质量差的问题，并进而培育大量良种公牛 已迫在眉睫。然而，种公牛精液品质属于数量性状，遗传力极低，过去的常规育种手段很难 在较短时间内发挥作用。
[0003] 近年来，随着分子遗传技术的不断发展，候选基因法(Candidate Gene Approach) 在遗传育种中得到了广泛应用。通过筛选候选基因上的多态位点，分析多态位点与精液品 质的相关性，从而鉴定出与精子质量相关的分子标记，进而为标记辅助选择（marker assisted selected，MAS)提供理论指导。目前，多个研究通过全基因组关联分析鉴定了与 精液品质密切相关的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点，发 现这些SNPs位点可能影响精子活力、密度、畸形率以及受精后的胚胎发育。
[0004] 基因任何构件的改变都会影响基因表达及其功能活性，单核苷酸多态性(SNP)是 最普遍的基因突变方式，主要是指DNA序列上单个碱基突变，包括单个碱基的转换、颠换、插 入及缺失等。编码区SNP(coding SNP，cSNP)可能对蛋白质的结构和功能产生有害的影响， 在遗传性疾病的研究中具有重要意义。启动子区SNP，尤其是有转录因子结合的SNP位点，影 响启动子活性，进而调控基因的表达水平。近年来研究发现，某些基因启动子区SNPs可以改 变影响公牛精液品质和繁殖力的主效基因启动子区调控元件的结合位点，改变了基因的表 达模式，从而影响了公牛精液性状和繁殖力。例如，本课题组Zhang等(2014)在前期研究中 发现KATNAL1基因的一个启动子SNP(c.l63-210T>C)与中国荷斯坦公牛精子畸形率密切相 关。Pan等（2013)研究发现PLCz基因启动子区的SNP(g.2456G>A)影响中国荷斯坦公牛的畸 形率。再如，Dai等(2009)分析了3个品种公牛的FSffi基因上游调控区，发现5'端侧翼区的突 变改变了转录因子的结合位点，该突变可导致精液中FSH浓度的改变，解释了 FSH0突变基因 型个体精子密度较低和顶体完整性较差的可能机理。相比于探究单个位点核苷酸多态性与 生物性状的相关性，研究多个多态位点之间形成的单倍型组合更有意义，因为这可以同时 考虑到多态位点之间的相互作用。
[0005] ARID4A(之前也被称为RBBP1或RBP1)是一个肿瘤抑制相关的有重要功能的蛋白， 可以和肿瘤抑制因子RB特异性结合。ARID4A属于ARID基因家族，调控染色质重塑、基因表 达、细胞发育过程中的分化和增殖以及癌症。Wu等（2013)发现，AR-和RB-应答通路基因是 ARID4A的下游靶标，ARID4A主要在睾丸支持细胞中表达，并且Ar 的小鼠在 初级精母细胞和单倍体精子细胞中表现出精子发生的阻滞，ARID4A可以通过AR和RB途径调 节生精细胞的减数分裂。由此可以看出，ARID4A在调节种公牛的繁殖发挥重要的作用。然 而，Bos Taurus中ARID4A基因目前已知的SNP位点就多达2246个，不同SNP位点其关联的性 状也往往不同，如何筛选出可用于检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低的SNP分子标 记，是本领域技术面临的主要难题。现有技术中影响种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低 的ARID4A基因的SNPs及其基因型组合的鉴定检测试剂盒，目前仍未有报道。

【发明内容】

[0006] 本发明针对现有种公牛冻精解冻后活力和畸形率检测技术的不足，开发相应的检 测试剂盒，筛选冻精解冻后活力高和畸形率低的种公牛，为种公牛繁殖育种提供技术指导。
[0007] 本发明的目的是提供一组用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高 低的SNP位点，并提供一种通过ARID4A基因 SNPs检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低 的方法，以及研发相应的检测试剂盒应用于种公牛繁殖。首先检测ARID4A基因的SNPs位点， 确定个体中SNPs位点间的基因型组合，并进行基因型组合与种公牛精液品质的关联分析， 从而鉴定出畸形率和冻精解冻后活力高的基因型组合。
[0008] 为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：
[0009] 本发明的第一方面，提供一组与种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低相关的SNP 位点：g. 53G>T和g. 826G>A，两个SNPs分别位于ARID4A基因第53位和826位碱基（以ARID4A基 因转录起始位点的第一个碱基G为+1)。
[0010] 上述SNP位点用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低的应用也 是本发明的保护范围。本领域技术人员应当明了，本申请所述SNP位点用于筛选和检测种公 牛精子畸形率和冻精解冻后活力高低的应用，其是筛选和/或检测得到精子畸形率较低、冻 精解冻后活力相对高的基因型的种公牛，其目的是指导种公牛的早期筛选和辅助育种，其 不属于疾病的诊断和/或治疗方法。
[0011] 上述SNP位点在种公牛的标记辅助育种中的应用也是本发明的保护范围。
[0012] 本发明的第二方面，提供一组与种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低相关的含有 SNP位点的DNA片段，其核苷酸序列分别如序列表中SEQIDN0.1和SEQIDN0.4所示;其中， SEQ ID N0.1所示序列包含ARID4A基因第53位核苷酸，SEQ ID勵.4所示序列包含41?104八基 因第826位核苷酸。
[0013] 本发明的第三方面，提供一种非诊断目的的筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活 力和畸形率高低的方法，根据上述SNP位点，鉴定待测种公牛ARID4A基因第53位和826位 SNPs位点的基因型，根据两个SNPs位点基因型的组合，预测种公牛冻精解冻后活力和畸形 率高低。
[0014] 上述方法中，ARID4A基因第53位SNP位点包括3种基因型，分别为GG、GT和TT; ARID4A基因第826位SNP位点包括3种基因型，分别为GG、GA和ΑΑ;根据两个SNP的基因型构建 出6种基因型组合，分别为HlHl(GGGG)，H1H3(GGGA)，H1H4(GTGA)，H3H3(TTGG)，H3H4(TTGA)， H4H4(TTAA)，当基因型组合为TTAA时，该组合的种公牛个体畸形率低，当基因型组合为GGGG 时，该组合的种公牛冻精解冻后活力最高。
[0015] 上述方法中，所述鉴定待测种公牛ARID4A基因第53位和826位SNPs位点的基因型 包括：以种公牛精液DNA为模板，设计引物分别扩增包含两个SNPs位点的DNA序列的步骤和 对扩增产物进行基因分型的步骤；
[0016] 所述引物分别如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示，可 以分别特异性地扩增包含ARID4A基因第53位（如SEQ ID NO. 1所示）和826位核苷酸（如SEQ ID NO.4所示)序列。
[0017] 所述对扩增产物进行基因分型的步骤可以为:对扩增产物进行酶切，将酶切产物 进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果区分基因型。
[0018] 具体的，所述酶切选用的酶为FastDigest限制性核酸内切酶Mst I和Sac II，其 中，F a s t D i g e s t限制性核酸内切酶M s t I可以识别A RID 4 A基因的第5 3位S N P位点， FastDigest限制性核酸内切酶Sac II用于识别ARID4A基因的第826位SNP位点。
[0019] 酶切产物分别用3%和2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳的结果区分基因 型。对于ARID4A基因的第53位SNP位点：若酶切后产物片段为283bp和25bp是GG基因型；片段 为308bp、283bp和25bp是GT基因型；片段为308bp是TT基因型。对于ARID4A基因的第826位 SNP位点：若酶切后产物片段为485bp和294bp是GG基因型；片段为779bp、485bp和294bp是GA 基因型；片段为779bp是AA基因型。根据两个SNP的基因型构建出6种基因型组合，其中H1H1 (GGGG)和HI H3 (GGGA)基因型组合种公牛个体的畸形率高于H4H4 (TTAA)，HI HI (GGGG)基因型 组合种公牛个体的冻精解冻后活力高于H1H3(GGGA)。
[0020] 所述对扩增产物进行基因分型的过程亦可采用其他常规方法，如对PCR产物直接 测序法，获得所述SNP位点对应的基因型。
[0021] 上述所需的种公牛精液DNA均是通过高盐法从种公牛的冻精中提取，并且利用核 酸蛋白分析仪检测基因组DNA的浓度和纯度，最终将DNA稀释到50ng/yL，4°C保存备用。
[0022] 需要说明的是，上述方法是用于种公牛的早期筛选和辅助育种，并不属于疾病的 诊断和/或治疗方法。
[0023]本发明的第四方面，提供一种用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形 率高低的引物组，包括扩增含有ARID4A基因第53位核苷酸的引物对，其序列分别如SEQ ID NO .2和SEQ ID NO .3所示；
[0024] 扩增含有ARID4A基因第826位核苷酸的引物对，其序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID Ν0· 6所示。
[0025] 上述引物组在制备用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低的试 剂盒中的应用也是本发明的保护范围。
[0026] 本发明的第五方面，提供一种用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形 率高低的试剂盒，包括:扩增位于ARID4A基因第53位和826位碱基的两个SNPs : g. 53G>T和 g. 826T>G的引物;PCR扩增试剂。
[0027] 优选的，上述引物为扩增包含ARID4A基因第53位核苷酸的基因组片段所用的上游 引物（如SEQIDN0.2所示）和下游引物（如SEQIDN0.3所示），扩增包含ARID4A基因第826 位核苷酸的基因组片段所用的上游引物(如SEQ ID N0.5所示）和下游引物（如SEQ ID N0.6 所示）。
[0028] 更优选的，一种筛选和检测种公牛畸形率和冻精解冻后活力高低的试剂盒，试剂 盒的保存在_20°C，试剂盒的组成成分如下所示：
[0029] FastDigest限制性核酸内切酶Mst I;
[0030] FastDigest限制性核酸内切酶Sac II;
[0031] 10XFastDigest buffer；
[0032] 2XTaq PCR MasterMix；
[0033] ddH20；
[0034] 2000bp DNA Ladder Marker
[0035] 扩增包含ARID4A基因第53位核苷酸的基因组片段所用的上游引物（如SEQ ID NO.2所示）和下游引物（如SEQ ID NO.3所示）
[0036] 扩增包含ARID4A基因第826位核苷酸的基因组片段所用的上游引物（如SEQ ID NO.5所示）和下游引物（如SEQ ID NO.6所示）。
[0037] 本发明的有益效果：
[0038] (1)在中国荷斯坦公牛ARID4A基因中，通过筛选获得一组可用于筛选和检测种公 牛畸形率和冻精解冻后活力高低的SNP分子标记，其中SNP位点g.53G>T和g.826T>G与公牛 畸形率和冻精解冻后活力高低相关为首次公开。
[0039] (2)本发明利用SNP分子标记技术辅助育种，这种筛选方法可以避免常规育种周期 长、效率低等局限性，具有准确性高、高效灵敏、成本低等优势。本发明鉴定出1种有效地 ARID4A基因基因型组合TTAA，该组合的种公牛个体畸形率低，以及GGGG基因型组合冻精解 冻后活力最高，可以进行辅助育种。
[0040] (3)本发明提供了一种新型的应用性检测试剂盒，利用ARID4A基因第53位和826位 SNP位点筛选种公牛精子活力高低的个体。
[0041] (4)本发明在实践中应用广泛，通过对种公牛进行早期筛选，可以减少种公牛饲养 的盲目性，降低成本，增加牧场经济效益。
【附图说明】
[0042] 图1:中国荷斯坦牛ARID4A基因第53位和826位的SNP反向测序结果；
[0043]图2:中国荷斯坦牛ARID4A基因第53位和826位SNP位点琼脂糖凝胶电泳分型图。
【具体实施方式】
[0044] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0045] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0046]下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]实施例1:牛ARID4A基因的SNP位点及基因型组合的鉴定
[0048] 本发明采用直接测序、CRS-PCR和PCR-RFLP的手段对牛ARID4A进行SNP鉴定。
[0049] 1.1实验材料
[0050] 本发明用的公牛选自国内两大种公牛站:北京奶牛中心(85头)和山东奥克斯种公 牛站(130头）。公牛冻精储存于液氮中备用。
[0051 ] 1.2冻精基因组DNA的提取
[0052]采用高盐法提取冻精基因组DNA，利用核酸蛋白分析仪检测DNA样品的纯度和浓 度，最终稀释成50ngAU，4°C保存备用。
[0053] 1.3引物的设计
[0054] 根据NCBI提供的牛ARID4A基因序列（登录号：AC_000167. 1)，利用Primer Premi er5.0软件设计引物，所设计的两对引物的序列如下所示：
[0061 ] 1.4PCR扩增反应
[0062] 25yL 的 PCR 反应体系：2XPower Taq PCR MasterMix 12·5μ1;上下游引物各 0·5μ 1，10μηιο1/1;模板ΙμL，50ng/yl ;ddH2〇补足到25μ1。
[0063] PCR反应程序：预变性95°C，5min;变性9 5°C，30sec，退火59°C，30sec，延伸72°C， 65sec，经过35个变性-退火-延伸循环;72°C终延伸lOmin。
[0064] 1.5SNP 的检测
[0065] 用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确定是目的条带后，将PCR扩增产物送北京六 合华大基因科技股份有限公司双向测序。测序结果用DNAMAN与GenBank上ARID4A基因的参 考序列进行序列比对，结合测序峰图，确定目的片段中的SNP位点分别为:g. 53G>T和g. 826T >G〇
[0066] 1 · 6PCR-RFLP 基因分型
[0067] FastDigest限制性核酸内切酶Mst I可以识别ARID4A基因的第53位SNP位点。
[0068] FastDigest限制性核酸内切酶Sac II用于识别ARID4A基因的第826位SNP位点。 [0069]检测PCR产物为目的片段后，用相应的限制性内切酶将PCR产物消化一个小时（3 7 °C )。酶切反应体系（30μ1) :PCR产物ΙΟμΙ;限制性内切酶ΙμL，iou/μL; 10 X buffer 2μ1; ddH20补足到30μ1。酶切产物分别用3%和2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。根据电泳得到的条 带区分统计不同的基因型。g.53G>T被限制性核酸内切酶Mst I识别后，片段大小为283bp和 25bp是GG基因型；片段为308bp、283bp和25bp是GT基因型；片段为308bp是TT基因型。g.826T >G被限制性核酸内切酶Sac II识别后，片段大小为485bp和294bp是GG基因型；片段为 779bp、485bp和294bp是GA基因型；片段为779bp是AA基因型。
[0070] 1.7单倍型构建
[0071] 在试验群体中鉴定出三种单倍型:H1(GG)，H3(TG)，H4(TA)。在群体中共发现6种基 因型组合：HlHl(GGGG)，H1H3(GGGA)，H1H4(GTGA)，H3H3(TTGG)，H3H4(TTGA)，H4H4(TTAA)。
[0072] 本发明的引物设计思路还不同于现有技术中常规的引物设计，本申请利用的是创 造酶切位点的方法，设计出特异性引物，使牛ARID4A基因第53位SNP位点g. 53G>T可以被 FastDigest限制性核酸内切酶Mst I识别；使牛ARID4A基因第826位SNP位点g.826G>A可以 被FastDigest限制性核酸内切酶Sac II识别。以种公牛基因组DNA为模板，分别利用上述特 异性的引物(53F、53R和826F、826R)进行PCR扩增，PCR扩增产物分别经FastDigest限制性核 酸内切酶Mst I和FastDigest限制性核酸内切酶Sac II切割后，在琼脂糖凝胶凝胶电泳中 予以分型，通过电泳条带对分型结果进行判定。
[0073] 本发明在试验过程中还以常规方法设计了多组对照引物，其中部分引物如下：
[0082]以上述对照引物进行PCR扩增反应，结果发现，上述对照引物的扩增效率明显低于 SEQIDN0.2、SEQIDN0.3和SEQIDN0.5、SEQIDN0.6两对引物，而且有些扩增产物不能 被FastDigest限制性核酸内切酶Mst I和FastDigest限制性核酸内切酶Sac II识别，无法 通过电泳实现基因分型。
[0083]实施例2:牛ARID4A基因单倍型组合与种公牛精子活力的关联分析
[0084] 采用SAS 9.0,比较牛ARID4A基因不同基因型组合与畸形率和冻精解冻后活力的 相关性。其模型为：
[0085] Υ：?」??=1τ?+6?+Υ」+Η??+θ：?」??
[0086] Yljk为公牛畸形率或精子活力性状的观察值;μ为群体平均值:单倍型组合的固 定效应;Yj:季节的固定效应;Hk:场次的固定效应;eijk:随机残差效应。
[0087]单倍型组合关联的结果显示:6种基因型组合中，H4H4基因型公牛个体的畸形率显 著低于H1H1和H1H3基因型个体公牛(P〈0.05);H1H1基因型组合公牛个体的冻精解冻后活力 显著高于H1H3(P〈0.05)基因型个体公牛(表1)。
[0088]表1牛ARID4A基因不同基因型组合与精子活力的相关性分析
[0089]
[0090] 注:!11=66;!13 = 了6;!14 = 了4;同列中具有不同小写字母(3，13，(3，(1)上标的平均值间 差异显著(P〈0.05)。
[0091] 运用SAS软件分析ARID4A不同基因型组合与中国荷斯坦公牛精液品质性状的相关 性。结果表明（表1)，H4H4基因型公牛个体的畸形率显著低于H1H1和H1H3基因型个体公牛(P <0.05);H1H1基因型组合公牛个体的冻精解冻后活力显著高于H1H3(P〈0.05)基因型个体公 牛。因此，可以将TTAA基因型作为判断种公牛畸形率高低的分子标记，GGGG基因型作为判断 种公牛精子解冻后活力高低的分子标记。
[0092] 用于低畸形率和高冻精解冻后活力个体的筛选。在育种工作者实际对种公牛进行 选育的过程中，如果发现某个公牛个体携带这种基因型组合，那么此个体与其他个体相比 期望有更加高的畸形率和冻精解冻后活力性状。因此，该项技术可以指导种公牛的早期筛 选，减少奶牛饲养的盲目性，降低养殖成本，增加牛场的经济效益。这种牛ARID4A的SNP分子 标记辅助育种的技术在以后的应用前景极其广泛。
[0093]实施例3检测试剂盒
[0094] 如实施例1所述，牛ARID4A基因第53位的G>T以及第826位的G>A均与种公牛的畸形 率和冻精解冻后活力密切相关。因此，可以发明一种适用于筛选种公牛畸形率和冻精解冻 后活力高低的ARID4A基因 SNP分子标记检测试剂盒，即根据这两个SNP位点设计牛ARID4A基 因的特异性引物进行扩增及检测。
[0095] 制备用于种公牛精子活力高低检测的试剂盒，详细成分如表2所示：
[0096] 表2种公牛精子活力高低检测的试剂盒成分
[0097]
[0098] 我们首先采集了种公牛的精液，于液氮储存备用，利用高盐法提取冻精总DNA。利 用上述试剂盒中的成分以提取的冻精DNA为模板进行PCR扩增。然后按照实施例1所述的PCR 体系和条件进行反应。25yL的PCR反应体系：2XPower Taq PCR MasterMix 12·5μ1;上下游 引物各0.5μ1，10μπιο1/1;模板ΙμL，50ngAU ; ddH20补足到25μ1 JCR反应程序:预变性95 °C， 5min;变性9 5°C，30sec，退火59°C，30sec，延伸72°C，65sec，经过35个变性-退火-延伸循 环;72 °C终延伸lOmin。利用CRS-PCR和PCR-RFLP方法对PCR扩增产物进行分型。具体酶切的 条件及体系同实施例1所述。酶切反应体系（30μ 1): PCR产物1 Ομ 1;限制性内切酶1 μ 1，1 OU/μ l;10Xbuffer2μl;ddH20补足到30μl，37°C消化酶切体系lh。酶切产物分别用3%和2.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0099] 根据实施例1中所述：g . 53G>T被限制性核酸内切酶Mst I识别后，片段大小为 283bp和25bp是GG基因型；片段为308bp、283bp和25bp是GT基因型；片段为308bp是TT基因 型。g.826T>G被限制性核酸内切酶Sac II识别后，片段大小为485bp和294bp是GG基因型；片 段为779bp、485bp和294bp是GA基因型；片段为779bp是AA基因型。再按实施例1中所述方法 分析各基因型组合个体的畸形率和冻精解冻后活力的高低，决定留种与否。
[0100] 在此，虽然直接测序可以检测出牛ARID4A基因 g. 53G>T以及g. 826G>A的两个突变。 但直接测序的方法成本较高，且周期长，不适用于大批量样品的检测。该试剂盒则可以很好 的弥补直接测序的缺陷，为种公牛的早期培育提供技术及理论指导。
[0101]本发明具有实用性的例证：
[0102] 1)本发明提供了一种通过鉴定牛ARID4A基因单核苷酸多态性，间接检测种公牛畸 形率和冻精解冻后活力的方法。该方法适用于分析牛ARID4A基因上的2个SNP位点与种公牛 畸形率和冻精解冻后活力的相关性，进一步可以作为种公牛畸形率和冻精解冻后活力的早 期诊断的依据，为高品质的种公牛选育提供技术及理论指导。
[0103] 2)本发明中高效检测牛ARID4A基因多态性和种公牛畸形率和冻精解冻后活力相 关位点方法，可类似的在种公牛畸形率和冻精解冻后活力相关基因诊断的试剂盒中得以应 用。
[0104] 综上所述，牛ARID4A基因的多态性位点g.53G>T以及g.826G>A均与种公牛畸形率 和冻精解冻后活力高低的显著相关，并根据这种相关性，研发检测试剂盒，在实践中应用到 基因诊断中。
[0105] 本发明提供了一种通过鉴定牛ARID4A基因单核苷酸多态性间接检测种公牛畸形 率和冻精解冻后活力高低的方法。根据本发明，我们只需要极其少量的种公牛基因组DNA就 可以高效鉴定出牛ARID4A基因的SNP位点，通过构建基因型组合，分析这些基因型组合对种 公牛畸形率和冻精解冻后活力高低的影响。本发明又提供了一种适用于检测种公牛畸形率 和冻精解冻后活力高低的试剂盒。最终，本发明提供了一种利用ARID4A基因 SNP分子标记检 测种公牛畸形率和冻精解冻后活力高低的方法及试剂盒。
[0106] 本发明与常规的测序手段进行分型相比，具有费用更低、耗时更少及效率更高等 优点，符合现代科学发展的理念，可以在未来种公牛遗传育种中被广泛的使用。
[0107]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一组与种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP 位点为种公牛ARID4A基因第53位的g.53G>T和第826位碱基的g.826G>A。2. 权利要求1所述的SNP位点用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低 的应用;或者在种公牛的标记辅助育种中的应用。3. -组与种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低相关的含有SNP位点的DNA片段，其核苷 酸序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.4所示；其中，SEQ ID NO. 1所示序列包含ARID4A基 因第53位核苷酸，SEQ ID NO.4所示序列包含ARID4A基因第826位核苷酸。4. 一种非诊断目的的筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低的方法，其 特征在于，鉴定待测种公牛ARID4A基因第53位和826位SNPs位点的基因型，根据第53位和 826位两个SNPs位点基因型的组合，预测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，根据ARID4A基因第53位和826位SNPs位点的 基因型，构建出6种基因型组合，分别为GGGG，GGGA，GTGA，TTGG，TTGA，和TTAA;当基因型组合 为TTAA时，该组合的种公牛个体畸形率低，当基因型组合为GGGG时，该组合的种公牛冻精解 冻后活力最高。6. 如权利要求4或5任一项所述的方法，其特征在于，所述鉴定待测种公牛ARID4A基因 第53位和826位SNPs位点的基因型包括：以种公牛精液DNA为模板，设计引物分别扩增包含 两个SNPs位点的DNA序列的步骤和对扩增产物进行基因分型的步骤； 引物序列为：扩增含有ARID4A基因第53位核苷酸的引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所 示;扩增含有ARID4A基因第826位核苷酸的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。7. -种用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低的引物组，其特征在 于，包括扩增含有ARID4A基因第53位核苷酸的引物对，其序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO. 3所示； 扩增含有ARID4A基因第826位核苷酸的引物对，其序列分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。8. 权利要求7所述的引物组在制备用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形 率高低的试剂盒中的应用。9. 一种用于筛选和/或检测种公牛冻精解冻后活力和畸形率高低的试剂盒，其特征在 于，包括:权利要求7所述的引物组和PCR扩增试剂。10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：限制性核酸内切酶 Mst I;限制性核酸内切酶Sac II和酶切缓冲液。
【文档编号】C12Q1/68GK105886639SQ201610321653
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】孙艳, 刘娟, 李秋玲, 王长法, 杨春红, 姜强, 王秀革, 鞠志花, 张燕, 黄金明, 仲跻峰
【申请人】山东省农业科学院奶牛研究中心