E亚型、B亚型、B'亚型、CRF07_BC亚型、 CRF08_BC亚型或C亚型；
[0039] 所述耐药突变位点均位于HIV-I基因组的Pol基因，包含蛋白酶基因区1-99位氨 基酸编码子和逆转录酶基因区1-300位氨基酸编码子；
[0040] 所述耐药突变位点为 I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、LlOI、L10V、L74V、 V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、 G190S、G190A、T69A/T 或 T69D/N。
[0041] 本发明还有一个目的是提供上述成套引物的用途。
[0042] 本发明提供了上述成套引物在制备检测或辅助检测待测HIV-I基因组的基因型 或耐药突变位点的产品中的应用。
[0043] 本发明还有一个目的是提供上述试剂盒的用途。
[0044] 本发明提供了上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测HIV-I基因组的基因型或 耐药突变位点的产品中的应用。
[0045] 本发明最后一个目的是提供一种检测待测HIV-I基因组的基因型或耐药突变位 点的方法。
[0046] 本发明提供的检测待测HIV-I基因组的基因型或耐药突变位点的方法包括如下 步骤：
[0047] 1)用上述成套引物中引物1和引物2对待测HIV-I的基因组RNA进行一步法 RT-PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0048] 2)用上述成套引物中的引物3、引物4、引物5、引物6、引物7和引物8分别对所述 PCR扩增产物进行测序，得到6条原始测序结果；
[0049] 3)将所述6条原始测序结果拼接后提交至本地耐药数据库，得到待测HIV-I基因 组的基因型及耐药突变位点。
[0050] 上述方法中，所述步骤1)中，若所述PCR扩增产物的产量达不到测序要求，可以所 述PCR扩增产物为模板，采用上述引物3和引物8再次进行PCR扩增，得到第二轮PCR扩增 产物。
[0051] 上述方法中，所述本地耐药数据库由斯坦福大学HIV耐药数据库（HIVDB，http:// sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra ? action = sequencelnput)、 国 际艾滋病协会数据库（IAS, http://www. iasusa. org)、法国国家艾滋病研宄署数据库 (ANRS, http://hivfrenchresistance. org/index. htm)和相关 HIV 耐药文献报道耐药数据 组成。
[0052] 上述方法中，所述待测HIV-I来源于离体的血浆或血清。
[0053] 上述成套引物或试剂盒或方法中，所述基因型为CRF01_AE亚型、B亚型、B'亚型、 CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型或C亚型；
[0054] 所述耐药突变位点均位于HIV-I基因组的Pol基因，包含蛋白酶基因区1-99位氨 基酸编码子和逆转录酶基因区1-300位氨基酸编码子；
[0055] 所述耐药突变位点为 I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、LlOI、L10V、L74V、 V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、 G190S、G190A、T69A/T 或 T69D/N。
[0056] 上述成套引物或上述试剂盒或上述方法在鉴定HIV-I的耐药性中的应用也属于 本发明的保护范围。
[0057] 上述I84V耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第84位 氨基酸由异亮氨酸（I)突变成缬氨酸（V);
[0058] 上述A62V耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第62 位氨基酸由丙氨酸（A)突变成缬氨酸（V);
[0059] 上述A71V耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第71位 氨基酸由丙氨酸（A)突变成缬氨酸（V);
[0060] 上述A71T耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第71位 氨基酸由丙氨酸（A)突变成苏氨酸（T);
[0061] 上述KlOlE耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第101 位氨基酸由赖氨酸（K)突变成谷氨酸（E);
[0062] 上述KlOlH耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第101 位氨基酸由赖氨酸（K)突变成组氨酸（H);
[0063] 上述LlOI耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第10位 氨基酸由亮氨酸（L)突变成异亮氨酸（I);
[0064] 上述LlOV耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第10位 氨基酸由亮氨酸（L)突变成缬氨酸（V);
[0065] 上述L74V耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第74 位氨基酸由亮氨酸（L)突变成缬氨酸（V);
[0066] 上述V75M耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第75 位氨基酸由缬氨酸（V)突变成甲硫氨酸（M);
[0067] 上述V90I耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第90 位氨基酸由缬氨酸（V)突变成异亮氨酸（I);
[0068] 上述V106M耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第106 位氨基酸由缬氨酸（V)突变成甲硫氨酸（M);
[0069] 上述V106I耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第106 位氨基酸由缬氨酸（V)突变成异亮氨酸（I);
[0070] 上述Vl79D耐药位点位于HIV-I基因组的Po 1基因的逆转录酶基因区域中，第179 位氨基酸由缬氨酸（V)突变成天冬门氨酸（D);
[0071] 上述V179E耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第179 位氨基酸由缬氨酸（V)突变成谷氨酸（E);
[0072] 上述V179D/V(杂合突变）耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基 因区域中，部分HIV-I病毒株第179位氨基酸由缬氨酸（V)突变成天冬门氨酸（D);
[0073] 上述Q58E耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第58位 氨基酸由谷氨酰胺（Q)突变成谷氨酸（E);
[0074] 上述Q58E/Q(杂合突变）耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的蛋白酶基因区 域中，部分HIV-I病毒株第58位氨基酸由谷氨酰胺（Q)突变成谷氨酸（E);
[0075] 上述F227F/L(杂合突变）耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基 因区域中，部分HIV-I病毒株第227位氨基酸由苯丙氨酸（F)突变成亮氨酸（L);
[0076] 上述M184V耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第184 位氨基酸由甲硫氨酸（M)突变成缬氨酸（V);
[0077] 上述D67N耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第67 位氨基酸由天冬门氨酸⑶突变成天冬门酰胺（N);
[0078] 上述G190S耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第190 位氨基酸由甘氨酸（G)突变成丝氨酸（S);
[0079] 上述G190A耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第190 位氨基酸由甘氨酸（G)突变成丙氨酸（A);
[0080] 上述T69A/T (杂合突变）耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因 区域中，部分HIV-I病毒株第69位氨基酸由苏氨酸（T)突变成丙氨酸（A);
[0081] 上述T69D/N(混合突变）耐药位点位于HIV-I基因组的Pol基因的逆转录酶基因 区域中，部分HIV-I病毒株第69位氨基酸由苏氨酸（T)突变成天冬门氨酸（D)，部分HIV-I 病毒株第69位氨基酸由苏氨酸（T)突变成天冬门酰胺（N)。
[0082] 上述HIV-I基因组的Pol基因及Pol基因编码的氨基酸序列为现有技术中公开的 任一例，一个具体例子如下：Ρ〇1基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示；所述Pol基因 编码的氨基酸序列如序列表中序列11所示。
[0083] 本发明针对中国HIV-I流行病毒株序列的保守性特点，设计了覆盖度广、特异性 好、灵敏度高的扩增及测序引物，提供了一种基于sanger测序法的HIV-I耐药检测方法，同 时也提供一种适用于国内HIV-I耐药检测试剂盒。本发明的检测试剂盒保证了低频突变 毒株的检测能力，极大地弥补了类似国外进口试剂盒存在的对中国HIV流行毒株扩增效率 差、检出率低、低频突变检测率低的不足，并且具有操作简便快速、高效、经济、高通量等特 点，不仅为HIV耐药检测试剂国产化打下了坚实基础，而且为国内大规模检测HIV病毒株耐 药情况开拓了广阔的前景。
【附图说明】
[0084] 图1为临床样本RNA、阳性质控品及阴性质控品RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳 结果。其中，泳道1为试剂盒阳性质控品RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；泳道2为 临床样本RNA RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；泳道3为试剂盒阴性质控品RT-PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；M :marker。
[0085] 图2为试剂盒阳性质控品扩增产物双脱氧末端终止法的测序结果。
【具体实施方式】
[0086] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0087] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0088] 实施例UHIV-I的Pol基因区的扩增