利用小分子化合物诱导干细胞向心肌分化的方法
【专利摘要】利用小分子化合物诱导干细胞向心肌分化的方法，涉及干细胞生物学与再生医学领域。所述小分子化合物为一类氨基甲酸酯类化合物(I)或其可药用盐、水合物、溶剂合物和异构体。将小分子化合物加入分化培养基中，直接作用于受试细胞，根据受试细胞形态、生长状态及鉴定情况，持续使用小分子化合物，直至受试细胞内相应的目标基因表达水平升高，分化为心肌样细胞；所述干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能性干细胞和间充质干细胞。实验证实在干细胞分化培养基中加入该类诱导剂后，干细胞向心肌细胞分化的比例明显提高。含有一类氨基甲酸酯类化合物或其可药用盐、水合物、溶剂合物和异构体的分化培养基可诱导干细胞向心肌细胞分化。
【专利说明】利用小分子化合物诱导干细胞向心肌分化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明所涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体是涉及利用小分子化合物（一 类氨基甲酸酯类化合物或其可药用盐、水合物、溶剂合物和异构体）诱导干细胞向心肌分 化的方法。
【背景技术】
[0002] 基于干细胞的再生医学为生命科学和医学的发展开辟了一个崭新的、广阔的领 域。研究者认为干细胞（再生医学）研究有潜力通过修复特定的组织或器官，改变人类对 疾病的应对方法。干细胞再生医学在治疗心肌病等目前尚无良好治疗方案的疾病方面具有 广泛的应用前景。
[0003] 干细胞是原始未分化的细胞，具有分化为其它细胞类型的能力。根据来源不同，可 将干细胞分为多能干细胞和来自成熟组织的干细胞。多能干细胞是指具有无限增殖、多分 化潜能的一类干细胞，包括胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESC)和诱导型人多能干细 胞（induced pluripotent stem cells, iPSC)。ESC是指从桑葚胚或附植前囊胚内细胞团 分离出的多潜能细胞；iPSC是将4种转录因子0ct4, Sox2, c-myc和Klf4组合导入体细胞， 将分化的体细胞重编程，转变为胚胎干细胞样细胞。间充质干细胞是成体各组织器官中的 干细胞，分化潜能较窄，只能分化为相应或邻近组织器官的细胞。已有研究表明，干细胞可 分化为包括心房肌、心室肌、房室结和窦房结样细胞等多种心肌组织细胞，这种特性使得干 细胞有望成为心脏疾病替代疗法的种子细胞。
[0004] 目前，诱导干细胞分化为心肌细胞的方法一般有三种：拟胚体形成法、与内胚层细 胞共培养法和加入特定诱导物定向心肌分化法。拟胚体是多能干细胞悬浮培养条件下形成 的具有三维结构的细胞团，细胞构成与发育中的胚胎相似，在分化培养基的作用下，部分拟 胚体分化为心肌样细胞，产生节律性收缩。
[0005] 干细胞分化在某种程度上是随机的，但一些小分子或细胞因子却可以诱导它们向 心肌细胞定向分化。研究发现小分子，维甲酸、DMS0、维生素 C、视黄醛激活剂及过氧化物酶 增殖激活的受体拮抗剂等可诱导ESC向心肌分化[1-5]。5-氮杂胞苷和维生素 C也能够诱 导干细胞向心肌分化[6, 7]。另外，一些生长因子及细胞因子，如BMP(bone morphogenetic protein)、FGF (fibroblast growth factor)、oxytocin、cardiotrophin I 也可促进干细胞 向心肌细胞分化[8-11]。虽然人们可通过因子或小分子诱导干细胞的心肌分化，但这些方 法均有其局限性，如DMSO具有致癌性；生长因子及细胞因子的价格比较昂贵，不适合临床 大量使用等。因此，科研工作者们致力于寻找小分子化合物，通过改善干细胞的分化培养体 系，研究促进干细胞向心肌定向分化的方法。我们通过在干细胞的分化培养基中加入一类 氨基甲酸酯类化合物或其可药用盐、水合物、溶剂合物和异构体，高效诱导干细胞定向分化 为心肌样细胞。
[0006] 参考文献：
[0007] I. Choi, S. C. , et al. , 5-azacytidine induces cardiac differentiation of P19 embryonic stem cells. Exp Mol Medj 2004. 36 (6) : 515-23.
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[0013] 7. Yoon, B. S. , et al. , Enhanced differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes by combining hanging drop culture and 5-azacytidine treatment. Differentiation, 2006. 74(4) :149-59.
[0014] 8. AteghangjB. , et al. , Regulation of cardiotrophin-1 expression in mouse embryonic stem cells by HIF-Ialpha and intracellular reactive oxygen species. J Cell Sci，2006. 119 (Pt 6):1043-52.
[0015] 9. Behfarj A. , et al. , Stem cell differentiation requires a paracrine pathway in the heart. FASEB Jj 2002. 16(12):1558-66.
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【发明内容】
[0018] 本发明的第一目的在于提供小分子化合物及其制备方法。
[0019] 本发明的第二目的在于提供利用小分子化合物（一类氨基甲酸酯类化合物或其 可药用盐、水合物、溶剂合物和异构体）诱导干细胞向心肌分化的方法，从而为干细胞移植 治疗心脏损伤修复研究提供新的思路和方法。
[0020] 所述小分子化合物为一类氨基甲酸酯类化合物（I)或其可药用盐、水合物、溶剂 合物和异构体，所述一类氨基甲酸酯类化合物（I)的化学结构式为：
[0021]
【权利要求】
1. 小分子化合物，其特征在于为一类氨基甲酸酯类化合物（I)或其可药用盐、水合物、 溶剂合物和异构体，所述一类氨基甲酸酯类化合物（I)的化学结构式为： I
其中，R基团为氢、烷基、环烷基、杂环烷基、羧基、醛基、羟基、胺基、芳基、杂芳基、卤素 中的一种；R的任何环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基可任选被1?5个选自卤素、羟基、羧 基、醛基、胺基、烷基、卤代烷基、芳基、卤代芳基、羰基结构、酯衍生物、酰胺衍生物的基团所 取代；R的任何羧基、醛基、羟基、胺基可任选被烷基、环烷基、羟基、羧基、芳基、杂芳基的基 团所取代。
2. 如权利要求1所述小分子化合物，其特征在于所述一类氨基甲酸酯类化合物（I)的 制备路线如下：
其具体制备方法如下： 0. 5M原料3溶解于2mlTHF及2mlH2O混合溶液，于0°C放置冷却，再加入0. 55M原料 2及ImlNa2C03/H20,升至室温反应5h，反应产物以饱和的NH4Cl溶液溶解，以乙酸乙酯萃 取，回收溶剂后以无水硫酸钠干燥，萃取物通过硅胶柱色谱层析，以石油醚与丙酮获得一类 氨基甲酸酯类化合物（I)。
3. 如权利要求2所述小分子化合物，其特征在于所述石油醚与丙酮的体积比为（3? 6) : 1。
4. 如权利要求2所述小分子化合物，其特征在于所述反应使用溶剂和酰基活化剂在碱 性环境下进行。
5. 如权利要求4所述小分子化合物，其特征在于所述溶剂选自THF或DMF;所述酰基活 化剂为HATU;所述碱性环境采用碳酸氢钠水溶液或DIEA。
6. 利用如权利要求1所述小分子化合物诱导干细胞向心肌分化的方法，其特征在于其 具体步骤如下： 将小分子化合物加入分化培养基中，直接作用于受试细胞，根据受试细胞形态、生长状 态及鉴定情况，持续使用小分子化合物，直至受试细胞内相应的目标基因（心肌特异性基 因）表达水平升高，分化为心肌样细胞； 所述干细胞包括胚胎干细胞（embryonicstemcells,ESC)、诱导多能性干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSC)和间充质干细胞； 胚胎干细胞向心肌分化的分化培养基的制备方法：按照制备IOOml分化培养基计，将 诱导剂小分子化合物（50?500nM)加入DMEM基础培养液使溶解，加入血清替代物20ml、青 霉素与链霉素的混合液1 %，非必需氨基酸2mM，L-谷氨酰胺2禮，β-巯基乙醇0. 1禮，最后 用DMEM基础培养液定容至100ml，即得； iPSC向心肌分化的分化培养基的制备方法：按照制备IOOml分化培养基计，将诱导剂 小分子化合物（50?500nM)加入DMEM基础培养液使溶解，加入血清替代物20ml、青霉素 与链霉素的混合液1 %，非必需氨基酸2mM，L-谷氨酰胺2禮，β-巯基乙醇0.ImM，最后用 DMEM基础培养液定容至100ml，即得； 间充质干细胞向心肌分化的分化培养基的制备方法：按照制备IOOml分化培养基 计，将诱导剂小分子化合物（50?500nM)加入DMEM基础培养液使溶解，加入5-氮胞苷 10μmol/L、青霉素与链霉素的混合液1%，最后用DMEM基础培养液定容至100ml，即得。
【文档编号】C12N5/077GK104447417SQ201410629278
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】徐秀琴, 邱彦, 刘靖, 林瑜 申请人:厦门大学