专利名称：多能干细胞心肌细胞分化促进剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，和用于诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，以及用于从多能干细胞制备心肌细胞的方法。
背景技术：
诱导多能干细胞分化的技术对于再生医学的实现和体外药物筛选研究的建立或药物安全性评价是关键。尤其，对于用于心脏病的再生医学和药物评价很重要，原因在于目前在日本心脏病是第二位的死因。存在多种药物，其诱发严重的副作用，包括心脏停搏和心律不齐，导致不断增加的对提供同质心肌细胞(其可用于心脏毒性研究)的需要。到目前为止，已有报道，通过将人ES细胞和小鼠饲养细胞，END2细胞共培养来诱导人ES细胞分化为心肌细胞(非专利文献I)。然而，此方法的分化效率不令人满意并且它难以获得纯的人心肌细胞，因为所得的人心肌细胞通常被小鼠END2细胞污染。还有报道，通过由ES细胞制备胚胎体并向胚胎体中加入若干细胞因子(成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白4 (BMP4)、血管内皮细胞生长因子(VEGF) ,Dickkopf-1 (DKKl)、活化素A)来诱导心肌细胞分化(非专利文献2和3)。然而，此方法需要大量的细胞因子并且成本太高，同时其分化效率不足。引用列表非专利文献非专利文献1:Mummery, C., 等，Differentiation of human embryonic stem cells tocardiomyocytes:role of c oculture with visceral endoderm-like cells(人胚月台干细胞分化成心肌细胞:与内脏内胚层样细胞共培养的作用).Circulation(循环).107(21)，2733-40(2003)。非专利文献2:Yang, L., 等，Human cardiovascular progenitor cells develop from aKDR+embryonic-stem-cell-derived population (人心血管祖细胞发育自 KDR+ 胚胎干细胞源的种群).Nature (自然).453 (7194)，524-8 (2008)。非专利文献3:Leschik, J.,等，Cardiac commitment of primate embryonic stem cells (灵长类动物胚胎干细胞的心脏定向).Nat Protoc.3(9)，1381-7(2008)。上述文献通过引用结合于此。
发明内容
技术问题在再生医学和药物发现领域需要以低成本高效率制备同质心肌细胞的方法。解决问题的方案
本发明的发明人考察了 9600种库化合物的促进猴ES细胞分化成心肌细胞的作用，并且发现低分子量化合物N11474具有促进心肌细胞分化的作用。此外，发现通过NI 1474及其类似化合物的合成开发获得的类似物KY02111具有促进心肌细胞分化的作用。因而，本发明已经得以实现。本发明提供一种用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，所述组合物包含由式(I)表示的化合物或其盐:[式I]
权利要求
1.一种用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，所述组合物包含由式(I)表示的化合物或其盐: [式1]
2.根据权利要求1所述的组合物，其中， R6至R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13,其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R6至R9中的两个相邻基团能够结合在一起以形成 _0_CH2_0_ 或 _0_ (CH2) 2_〇_。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中， R1至R5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R1至R5中的两个相邻基团能够结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O-(CH2)2-O-,并且X是氧原子；硫原子；或基团-NR15，其中R15是氢原子，具有I至5个碳原子的直链或支链烷基，或具有I至5个碳原子的直链或支链酰基。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中， R2和R3是具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基，或R2和R3结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O- (CH2) 2~0-, R6和R9各自独立地是，氢原子；卤素原子；羟基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基，并且R7是氢原子；卤素原子；羟基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基， R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基，或者R7和R8结合在一起以形成-O-CH2-O-或-0-(CH2)2-0-。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，R1, R4, R5, RdPR9 是氢原子， R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基，并且 RlO和Rn是氢原子。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中， X是硫原子，并且 η是O至4的整数。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中， R1, R4, R5, R6, R8和R9各自独立地是氢原子；卤素原子；轻基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基； R2和R3是具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基，或R2和R3结合在一起以形成-O-CH2-O-或-O- (CH2) 2~0-, R7是被基团-C (O) A取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中A是饱和或不饱和的5元或6元环,所述5元或6元环是未取代的或被具有I至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环能够含有I个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子；并且 X是氧原子；硫原子；或基团-NR15，其中R15是氢原子，具有I至5个碳原子的直链或支链烷基，或具有I至5个碳原子的直链或支链酰基。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，R1, R4, R5, R6, R8 和 R9 是氢原子， R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基， R10和R11是氢原子， X是硫原子， A是哌啶基、哌嗪基或吗啉基，其是未取代的或被具有I至5个碳原子的直链或支链烷基取代，并且 η是O至4的整数。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述化合物选自下列各项:
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中多能干细胞是哺乳动物细胞。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中多能干细胞是灵长类动物细胞。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，所述组合物联合不同的心肌细胞分化促进剂使用。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述不同的心肌细胞分化促进剂是双呋脒腙；bFGF、BMP4、VEGF, DKKl和活化素A的组合；或Wnt信号传导抑制剂。
14.一种用于促进心肌细胞分化的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至11中任一项所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，所述试剂盒还包括不同的心肌细胞分化促进剂。
16.一种用于诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，所述方法包括在含有权利要求1至13中任一项所述的组合物的培养基中培养多能干细胞。
17.一种用于从多能干细胞制备心肌细胞的方法，所述方法包括在含有权利要求1至13中任一项所述的组合物的培养基中培养多能干细胞。
18.通过权利要求17所述的方法制备的心肌细胞。
19.一种具有式(I)的化合物或其盐:
20.根据权利要求19所述的化合物或其盐，其中， R6至R9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13,其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基；其中R6至R9中的两个相邻基团能够结合在一起以形成-O-CH2-Q-或-Q- (CH2) 2~0-,η是3至6的整数。
21.根据权利要求20所述的化合物或其盐，其中， R1, R4, R5, R6和R9各自独立地是氢原子；卤素原子；轻基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基；并且 R7是氢原子；卤素原子；羟基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-NR12R13，其中R12和R13各自独立地是氢原子，氧原子，或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基， R8是氢原子；卤素原子；羟基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基，或R7和R8结合在一起以形成-O-CH2-O-或-0-(CH2)2-0-。
22.根据权利要求21所述的化合物或其盐，其中， R1, R4, R5, RdPR9 是氢原子， R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基，并且 RlO和Rn是氢原子。
23.根据权利要求22所述的化合物或其盐，其中， X是硫原子，并且 η是3。
24.根据权利要求19所述的化合物或其盐，其中， R1, R4, R5, R6和R9各自独立地是氢原子；卤素原子；轻基；具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或是未取代的或被卤素原子取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷基，R7是被基团-C (O) A取代的具有I至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中A是饱和或不饱和的5元或6元环,所述5元或6元环是未取代的或被具有I至5个碳原子的直链或支链烷基取代并且所述环能够含有I个或2个独立地选自氮原子、氧原子和硫原子中的原子。
25.根据权利要求24所述的化合物或其盐，其中，R1, R4, R5, R6, R8 和 R9 是氢原子， R2和R3是甲氧基，乙氧基或丙氧基， R10和R11是氢原子， X是硫原子， A是哌啶基，哌嗪基或吗啉基，其是未取代的或被具有I至5个碳原子的直链或支链烷基取代，并且 η是O至4的整数。
26.根据权利要求19所述的化合物或其盐，所述化合物由以下化学式表示:S0087 [式 22]
全文摘要
本发明涉及多能干细胞的心肌细胞分化促进剂，所述分化促进剂包含由下式(I)表示的化合物或其盐成心肌细胞的方法；和用于制备心肌细胞的方法。
文档编号A61P43/00GK103209968SQ20118005157
公开日2013年7月17日 申请日期2011年8月24日 优先权日2010年8月26日
发明者中辻宪夫, 上杉志成, 山田耕平, 南一成, 尾辻智美 申请人:国立大学法人京都大学