极化cd4+t细胞的方法
【专利摘要】本发明提供一种极化CD4+T细胞的方法，包括以下步骤：得到CD4+T细胞；进行培养时，加入SDF-1α和IL-2，刺激CD4+T细胞，培养1—8天，CD4+T细胞向Th1方向极化；或者进行培养时，加入SDF-1α和IL-4，刺激CD4+T细胞，培养1—8天，CD4+T细胞向Th2方向极化。本发明通过IL-2或IL-4联合SDF-1α诱导Th细胞极化方向，使CD4+T细胞向Thl或Th2方向极化。其中CXCR4与SDF-1α信号转导通路能増强TCR介导的Thl和Th2细胞活化，Th极化方向受IL-2或IL-4与SDF-1α协同信号转导通路的影响。
【专利说明】极化CD4W细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及一种极化CD4+T细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 化细胞极化是一个多信号参与的复杂过程，如TCR活化信号、辅助受体W及细胞 因子、趋化因子等，对其相关研究已逐步深入到转录因子、信号转导、基因调控水平。国内外 己有较多研究探讨单一细胞因子或趋化因子对化细胞极化的调节机制。己有研究表明，外 源性IL-2或IL-4可使CD4+T前体细胞向Thl或化2细胞极化，其信号转导通路的激发有赖 结合于受体胞内域的非受体型蛋白酪氨酸激酶（Syk、ZAP70等）。CXCR4是Thl细胞和化2 细胞均表达的趋化因子受体，其配体为SDF-I a (基质细胞源因子）（或CX化12)，二者结合 不仅可促T细胞迁移，还可提供T细胞共刺激和极化信号。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种新的极化CD4+T细胞的方法。
[0004] 实现上述目的的技术方案如下。
[0005] 一种极化CD4+T细胞的方法，包括W下步骤：
[000引 得到CD4+T细胞；
[0007] 进行培养时，加入SDF-I a和rhIL-2,刺激CD4+T细胞，培养1一8天，CD4+T细胞 向Thl方向极化。
[0008] 或者，包括W下步骤：
[000引 得到CD4+T细胞；
[0010] 进行培养时，加入SDF-I a和IL-4,刺激CD4+T细胞，培养1一8天，CD4+T细胞向 Th2方向极化。
[0011] 在其中一个实施例中，进行培养时CD4+T细胞细胞密度为2xlO^L，0. 5ml/孔，所 述SDF-I a的加入量为50-100ng，所述rhlk2的加入量为5-lOng。
[0012] 在其中一个实施例中，进行培养时CD4+T细胞细胞密度为2xl(yVL，0. 5ml/孔，所 述SDF-I a的加入量为50-100ng，所述rhlk4的加入量为5-lOng。
[0013] 本发明的发明人通过长期的实验研究积累，发现通过联合细胞因子和趋化因子协 同作用使化细胞进行极化。W往的研究表明，外源性IL-2可使CD4+T前体细胞向Thl细 胞极化；外源性IL-4可使CD4+T前体细胞向化2细胞极化。SDF-I a可提供T细胞共刺激 和极化信号。但单一细胞因子或趋化因子并不代表整个机体免疫网络，仅能作为其中一部 分，细胞因子和趋化因子间也存在交互作用。而本发明人发现，单纯使用IL-2或者IL-4极 化CD4+T前体细胞不能提供其所需的共刺激和极化信号，因此联合细胞因子和趋化因子共 同调节化细胞极化具有重要意义，通过二者联合使用，可W使CD4+T前体细胞表达趋化因 子受体，并与其配体SDF-I a结合，从而顺利完成极化过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为实时定量RT-PCR检测细胞IFN-YmRNA(A)和比-4mRNA做表达，其中图 A.圆形；标准DNA模板
[0015] H角形；resting CB CD4+T 细胞
[001引菱形；经比-2 (lOug/L)和SDF-I a (lOOug/L)刺激的细胞 [0017]方形：经 IL-4(10ug/L)和 SDF-I a (lOOug/L)刺激的细胞 [001引图B.圆形；标准DNA模板
[0019] 方形；resting CB CD4+T 细胞
[0020] 菱形；经比-2 (lOug/L)和 SDF-I a (lOOug/L)刺激的细胞
[0021] H角形：经比-4(10ug/L)和 SDF-I a (l〇〇ug/L)/CX化12 刺激的细胞；
[0022] 图2为比-2/比-4和SDF-I a协同诱导CD4+T细胞Syk和ZAR70的磯酸化。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1
[0024] 1. CD4+T细胞的获得
[00巧]1. 1取新鲜厮带血（肝素抗凝20u/ml)+生理盐水照1 ;1稀释；
[0026] 1. 2在50ml离也管中预先加入淋己细胞分离液15ml，再加入稀释好的厮带血 25ml ；
[0027] 1. 3小也的将稀释后的血液加到分离液的上面；
[0028] 1.4 离也；转速；1500r/min，温度 20°C- 28°C，时间；20min ;
[0029] I. 5离也管内顺次为血浆---单个核细胞层一一分离液一一红细胞；
[0030] 1. 6用移液管吸出单个核细胞层，重息于2-5倍体积的生理盐水中；
[00引]1. 7 离也：转速：2000 - 2300r/min，时间；lOmin，温度；4°C ;
[0032] 1.8离也后，弃上清液，细胞沉淀重息于Iml完全培养基中（含10% FCS的 RPM-1640 培养液）。
[0033] 2. (SD巧?1 a (基质细胞源因子）联合IL-2^L-4极化CD4+T细胞
[0034] 2. 1调整细胞密度为2x1〇7L，放入48孔培养板，0. 5ml/孔；
[0035] 2. 2分8组给予刺激，分别为
[0036] rh比-2(5ng/孔）；
[0037] rh比-4 (5ng/孔）；
[0038] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）；
[0039] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）；
[0040] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 化加g/ 孔）；
[0041] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 化加g/ 孔）；
[0042] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 的二抗化加g/ 孔）；
[0043] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 的二抗化加g/ 孔）。
[0044] 2. 337°C，5% C〇2的饱和湿度培养箱中常规培养，于培养第1，2, 4, 8天收集细胞用 于检测胞内细胞因子。
[0045] 3.检测CD4+T细胞极化状态
[0046] 3. I流式细胞仪检测细胞内Thl和Th2型细胞因子表达
[0047] 将收集的细胞分为两组，用IntraPrepTM(Coulte-ImmunoTech公司）试剂盒固定 细胞后，第1组加入鼠抗人IFN-Y抗体，室温赔育15min，PBS洗涂2次后，加入FITC标记 的羊抗鼠二抗室温赔育15min。第2组加入鼠抗人比-4抗体，室温赔育15min，PBS洗涂2 次后，加入PE标记的羊抗鼠抗体室温赔育15min。再次洗涂细胞，加入含0. 5%甲酵的PBS 制成细胞息液，通过流式细胞仪检测胞内细胞因子表达。
[0048] 流式细胞结果表明，rhIL-2+SDF-l a刺激后，CD4+T细胞分泌IFN- Y逐渐増加， 呈时间依赖性，第8天最多，为胞内细胞因子的84. 0%;IL-4分泌逐渐减少，第8天最少，为 0. 2%。而在rhIL-2+SDF-la+Ab(CXCR4小鼠单抗）协同刺激情况下，IFN-Y分泌逐渐减 少，第8天最少，为0.4% ;IL-4分泌亦逐渐减少，第8天最少，为1.6%。rhIL-4+SDF-la 刺激后，CD4+T细胞分泌IL-4逐渐増加，第8天最多，为90. 3% ;IFN- Y分泌逐渐减少，第 8天最少，为0. 1 %。rhIL-4+SDFla+Ab (CXCR4小鼠单抗）协同刺激情况下，IL-4分泌逐渐 减少，第8天最少，为0.6% ;IFN-Y分泌百分比逐渐减少，第8天最少，为2. 8%。
[0049] 3. 2实时定量RT-PCR检测胞内Thl和化2型细胞因子mRNA表达
[0050] 2xl06个新鲜分离CD4+T细胞提取总RNA，寡聚d (T) 12-18和SuperscriptII逆转 录酶反转录RNAW合成cDNA第一链，实时定量RT-PCR在ABIPRISM7700SequenceDetector Systems (Pekin Elmer Applied Bi-systems)中完成。
[0051] IFN- Y和比-4的特异性引物为：
[0052] IFN-Y sense:5-TGTAAGCCCCCA GAA-ACA-GAAAG-3,（沈Q ID NO. 1);
[0053] IFN-yantisense:5-TTGCCCATCA AGA AACAGCAG-3'（沈Q ID NO. 2);
[0054] n^-4sense:5-TCACTCTTCACTCTTTTCTTCCCC-3>GEQIDN0.3);
[00巧]IL-4antisense:5-TCTTCCCACTTTGCTGTTCCT-3'(沈Q ID NO. 4);
[0056] 目 actin sense:5-TCCTGTGGCATCCA CGAAACT-3'（沈Q ID NO. 5);
[0057] 目 antisense:5-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3,（沈Q ID NO. 6)。
[0058] 扩増条件：5(TC 2min，95°C 10min，93°C 20s，40 个循环。
[0059] 实时定量RT-PCR检测新鲜分离的CD4+T细胞内IFN- Y和比-4mRNA表达分别为 7. 3X102 和 2. 1X103 拷贝；rhIL-2+SDF-l a 刺激后 8d 检测细胞内 IFN-YmRNA 为 1. 0x104 拷贝，rh比-4mRNA为3. 6X102拷贝；rh比-4+SDF-1 a刺激后8d细胞内比-4mRNA约为 1. 3X104, IFN- Y mRNA 为 7.細101 拷贝（图 1)。
[0060] 3. 3比-2/比-4单独W及比-2/lk4联合SDF-I a诱导Syk和ZAP-70磯酸化
[0061] ImlT肥缓冲液分别裂解步骤2中经过rh比-2/rh比-4 W及rh比-2/rh比-4联合 SDF-Ia协同诱导的CD4+T细胞（细胞密度5x109/1)，离也（l〇〇〇〇r/min，5min)，取上清， 分别加入加g抗人Syk(e20)和ZAP-70(LR)抗体（Santa Cruz BioTech公司）4°C赔育比， 12%聚丙帰醜胺凝胶电泳。
[0062] 免疫复合物激酶分析；Syk, ZAP-70抗体免疫沉淀后，T肥缓冲液洗涂5遍，激酶缓 冲液洗涂4遍，然后重息到20ul (含IOul Y -32P) ATP激酶缓冲液中，室温赔育30min后终 止反应。混合物煮沸5min，8% SDS-PAGE电泳，放射自显影。
[0063] 免疫印迹：蛋白质进行12%聚丙帰醜胺凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上， 5% BSA-TBS中封闭过夜，弃封闭液，分别加入Syk、ZAF70抗体，37 C赔育比，IxTBS洗涂 10minx3 次，再加入[y-125I]p;rotein A(肥N Life Sciences 公司）37°C赔育 lh，lxTBS 洗 涂IOmin巧次，放射自显影。
[0064] 免疫复合物激酶分析和免疫印迹显示在IL-2和SDF-I a协同诱导30min后，Syk 即发生弱磯酸化，8d后Syk磯酸化明显加强而稳定；而单一 IL-2或SDF-I a刺激不能诱导 Syk磯酸化（图2A)。比-4和SDF-I a协同诱导ZAF70磯酸化的效应与比-2和SDF-I a 协同诱导Syk磯酸化的作用相似，单一 IL-4或SDF-I a刺激亦不能诱导ZAP70磯酸化（图 沈)。
[0065] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，该些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【权利要求】
1. 一种极化⑶4+T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： 得到⑶4+T细胞； 进行培养时，加入SDF-1 a和rhIL-2,刺激⑶4+T细胞，培养1一8天，⑶4+T细胞向Thl 方向极化。
2. 根据权利要求1所述的极化CD4+T细胞的方法，其特征在于，进行培养时CD4+T细胞 细胞密度为2x109/L，0. 5ml/孔，所述SDF-1 a的加入量为50-100ng，所述rhIL-2的加入量 为 5-lOng。
3. -种极化⑶4+T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： 得到⑶4+T细胞； 进行培养时，加入SDF-1 a和IL-4,刺激⑶4+T细胞，培养1一8天，⑶4+T细胞向Th2 方向极化。
4. 根据权利要求3所述的极化CD4+T细胞的方法，其特征在于，进行培养时CD4+T细胞 细胞密度为2xl09/L，0. 5ml/孔，所述SDF-1 a的加入量为50-100ng，所述rhIL-4的加入量 为 5-lOng。
【文档编号】C12N5/0783GK104357392SQ201410629285
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】邹汉东, 于兆学, 夏凡 申请人:广州洁汉贸易有限公司