专利名称：氯化钾KCl在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切地说涉及KCl的医药新用途，涉及KCl作为促进神 经细胞生长剂、促进PC12细胞生长剂、抗氧化应激损伤剂、PC12细胞免于帕金森病毒性物 损伤剂的应用，以及KC1在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
背景技术：
KC1可以使细胞膜去极化，兴奋细胞，改变离子通道通透性，调节质膜和钙库膜 上的钙离子通道，从而引起细胞内游离钙离子升高，所以通常被用来建立组织缺血所导 致细胞内牵丐离子浓度升高模型(William J.Moody and Martha M. Bosma. IonCha騰l Development, Spontaneous Activity, and Activity—D印endentDevelopment in Nerve and Muscle Cells. Physiol Rev， Jul 2005;85:883-941)。并且，KCl常用于治疗低钾血 症的防治，亦可用于强心甙中毒的阵发性心动过速或者频发室性期外收縮(Paul H.Ratz， Krystina M. Berg， Nicole H. Urban, and AmyS. Miner Regulation of smooth muscle calcium sensitivity :KCl as acalcium—sensitizing stimulus. Am J Physiol Cell Physiol, Apr 2005 ;288 :C769_C783)。 MPP+是1-甲基-4-苯基_1，2，3，6-四氢卩比啶(l-methyl+phenyl-l, 2， 3， 6-tetrahydropyridine， MPTP)经过单胺氧化酶B (MA0-B)催化后生成的具有细 胞毒性的活性代谢产物，它与线粒体复合物-I结合抑制其活性，使细胞线粒体ATP 的下降和膜电位的破坏，最终导致线粒体功能障碍和氧自由基生成增加，细胞凋 亡。MPP+通常用来做帕金森病的细胞模型，MPP+抑制PC12细胞的生长增殖，诱导 细胞凋亡 (JieBai， Hajime Nakamura， Shugo Ueda， Yong_Won Kwon， Toru Tanaka， Sadayuki Ban， and Junji YodoiProteasome—d印endent Degra—dation of Cyclin Dl inl_Methyl_4_phenylpyridinium Ion(MPP+)-induced Cell Cycle Arrest. J. Biol. Chem. ， S印2004 ;279 :38710-38714.)。 硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx)是一种普遍存在于原核生物和真核生物中的 小分子蛋白质，它与NAPDH和硫氧还蛋白还原酶组成细胞内主要的氧化还原系统。Trx-1 是生物体所必须的基因，如果选择性地敲除小鼠的Trx-l基因，小鼠则早期胚胎致死 (Matsui M. ， 0shima M. ， 0shima H. ， Takaku K. ， Maruyama T. ， Yodoi J. ， and Taketo M.M.Early embryonic lethality caused by targeted disruptionof the mouse thioredoxin gene. Dev. Biol. 1996， 178 :179-185)。作为细胞内的抗氧化剂，Trx-1能保 护细胞、减轻氧化应激所致的损伤，并且能抑制p38 MAPK和凋亡信号调节激酶1活性， 增强细胞的抗凋亡能力(Saito M. ， Nishitoh， H. ， Fujii， M. ， Takeda， K. ， Tobiume， K.， Sawada， Y. ， Kawabata， M. ， Miyazono， K. ， and Ichijyo， H. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosissignal-regulating kinase (ASK)1. EMBO，1998，17 : 2596—2606 ;Hashimoto S. ， Matsumoto K. ， Gon Y. ， Furuichi S. ， Maruoka S. ， Takeshita I. ， Hirota K. ， YodoiJ. ， and Horie T.Thioredoxin negatively regulates p38 MAPkinase activationand IL_6 production by tumor necrosis factor—alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999， 258 :443-447.)。到目前为止，Trx与人类疾病有关的研究很 多，Trx具有保护神经元抑制巾白金森病作用(Thioredoxin suppressesl_methyl_4_pheny lpyridinium—induced neurotoxicity in rat PC12 cells. BaiJ， Nakamura H， Hattori I， Tanito M， Yodoi J. Neurosci Lett. 2002 Marl5 ;321(1-2) :81-4.Does thioredoxin-l prevent mitochondria—and endoplasmicreticulum—mediated neurotoxicity of l_methyl_4_phenyl_l，2，3，6—tetrahydropyridine Bai J，Nakamura H，Kwon YW，Tanito M， Ueda S， Tanaka T， Hattori I， Ban S， Momoi T， Kitao Y， Ogawa S， Yodoi J Antioxid RedoxSignal. 2007 May ;9(5) :603-8)。 迄今，现有技术中未见KC1保护神经元免受MPP+损伤的作用的报道。
发明内容
本发明旨在提供KC1的医药新用途，涉及KC1作为促进神经细胞生长剂、促进PC12 细胞生长剂、抗氧化应激损伤剂、PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤剂的应用，以及KC1在 制备治疗帕金森病的药物中的应用。 本发明的上述目的是用下面的技术方案得以实现的 KCl作为促进神经细胞生长剂的应用。 KC1作为促进PC12细胞生长剂的应用。 KCl作为抗氧化应激损伤剂的应用。 KC1作为PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤剂的应用。 KC1在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
图1 :四噻唑蓝(MTT)法测定KC1对PC12细胞的存活率影响；
图2 :Western Blot检测KC1对PC12细胞中Trx蛋白表达的影响；
图3 :四噻唑蓝(MTT)法测定KC1对MPP+剌激的PC12细胞的保护作用；
图4 :Western Blot检测KC1对MPP+剌激的PC12细胞Trx蛋白表达的影响。
具体实施例方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以 此来限定本发明。 实施例1 :把KC1(KC1购自天津市化学试剂三厂)250mg，溶于1000ml水中制成
0. 25%浓度的水溶液加热溶解，混合均匀后，装入药瓶中密封，消毒制成产品。 实施例2 :把KC1(KC1购自天津市化学试剂三厂)125mg，溶于1000ml水中制成
0. 125%浓度的水溶液加热溶解，混合均匀后，装入药瓶中密封，消毒制成产品。 实施例3 :把KC1 (KC1购自天津市化学试剂三厂)2500mg，溶于1000ml水中制成
水溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成5mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒制成产
PI
PR o 实施例4 :把KC1 (KC1购自天津市化学试剂三厂)1500mg，溶于1000ml水中制成
4水溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成3mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒制成产
PR o 实施例5 :把KC1 (KC1购自天津市化学试剂三厂)5000mg，溶于1000ml水中制成水 溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成10mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒制成产 实施例6 :取100克KC1 (KC1购自天津市化学试剂三厂)、560克微晶纤维素、380 克无水乳糖、200克硬脂酸镁、30克氧化硅，按公知的制片技术和装备制成片剂，即取上述 配方中除硬脂酸镁外所有成分混合25-30分钟，再筛入硬脂酸镁，继续混匀，尔后用12/32 英寸(约1. 03cm)标准凹冲压成片。 下面用本发明的试验例来证明本发明的药理效果。
下列试验所采用的材料和条件如下
1、细胞 PC12细胞大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，购自中国科学院昆明动物所。
2、药品及主要试剂 KC1购自天津市化学试剂三厂；MPP+购自美国sigma公司；一抗Anti-mouse Trx， 由日本京都大学淀井溶司教授提供；一抗Anti-mouse P-actin购自santa ;Protein Marker购自Fermentas公司；RPMI Medium 1640购自Invitrogen corporation ;蛋白质 定量试剂盒(BCA法)购自Bio-Rad公司；Chemiluminesent substrate购自生物晶美公 司;PVDF膜购自Millipore公司;TRISBase购自N0V0N公司;Acrylamide购自Solarbio 公司；十二焼基硫酸納购自xiamensanland chemicals company limited ;琼月旨糖、考马 斯亮蓝R_250、 Aprotimin、 PMSF禾口 NP_40，均购自Sanland-chem International InC ; TEMED购自HUALVYUANBIOTECHNOLOGY ;X射线胶片购自中国乐凯胶片集团公司；二抗 affinity purif iedantibody peroxidase labled goat anti_mouse lgG(H+UHSA liquid conjugate禾口 affinity purified antibody peroxidase labled goat Miti-rabbit lgG(H+L)HSA liquid conjugate,购自美国Kirkegaard & laboratories ;四噻唑蓝(MTT) 购自美国Promega公司。
3、主要实验仪器 BHC-1300II A/B3生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司生产；TS100生物倒置 相差显微镜，日本NIKON公司生产；C02培养箱，美国NBS公司生产；TS-1脱色摇床，金纭市 杰瑞尔电器有限公司生产；电子分析天枰，北京塞多利斯仪器系统有限公司生产；旋涡混 合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；BYY-6C双稳定时电泳仪，北京六一仪器有 限公司生产；酶标仪，美国MD公司生产；J-25离心机，美国贝克曼公司生产；XJX-IIX射线 摄影暗匣，上海跃进医用光学器械厂生产；血球计数板，上海市求精生化试剂仪器有限公 司；96孔板细胞培养板，Biousing Biotechnology有限公司生产。
试验例1 : 四噻唑蓝(MTT)法测定PC12细胞的存活率
( — )PC12细胞株的培养 PC12细胞用含10X马血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的 RPMI1640培养基，于37°C 、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。每2_3天更换培养液一次，细胞达约70 % 80%融合时，传代或用于实验。
(二)PC12细胞的排板 用0. 25%的胰酶将贴壁的PC12细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将 细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为lX10、ell/孔，在含有10X马血清，5X胎牛血清、 100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度的培 养箱中培养。(三)梯度浓度KC1剌激 细胞培养过夜，换新鲜RPMI1640培养液，对照组不加KC1，实验组分别用20、40、 80mM的浓度KCl剌激。各组设5个平行实验。 [O(HO](四)四噻唑蓝(MTT)实验取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，继续孵育4小时 后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150 yl 二甲基亚砜，小心混匀，用 酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。
(五)细胞的存活率计算 存活率％ =加药组A值/对照组A值X 100%
试验例2 : KCl诱导PC12细胞中Trx蛋白表达升高
( — )细胞株培养和KC1剌激处理 PC12细胞用含10X马血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的 1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。每2_3天更换培养液一次，细 胞达约70 % 80%融合时，传代或用于实验。 将细胞接种于平板中，培养过夜后，KC1处理细胞。分组处理如下对照组不加药， 实验组分别加20、40、80mM的KC1。上述处理后，置于37。C和5% C02培养箱中培养24小 时，然后收集细胞，以提取蛋白1500rpm离心5min收获细胞，分别加入100 yl细胞裂解 液(150mM NaCl，O. 5% NP-40， 10mM Tris-HCl， pH 7.2，0.1mM PMSF，2iig/ml即rotinin， 200 ii g/ml NaN3)，充分混悬后于冰浴下放置裂解50min (中间振荡5 6次)，4 °C下 15000rpm离心15min，转上清至新离心管中，-8(TC保存。
( 二 )免疫印迹
1.蛋白含量的测定 用BCA试剂盒测定将10 ii 1标准品或待测样本与200 y 1WR工作溶液混合，37°C 孵育30min，将反应管温度冷却至室温。测定562nm光密度值，绘制标准曲线，并计算蛋白浓度。 2.蛋白免疫印迹(Western Blot) 总蛋白加样量为6ii g，与2XSDS凝胶加样缓冲液混合后，95t:热变性5min，用 15X的SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白条带用电转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶4°〇封 闭过夜；取出PVDF膜，用含0. 1% Tween-20的TPBS冲洗后，加入1000倍稀释的一抗室温 孵育75min ;用含0. 1% Tween-20的TPBS冲洗，加入5000倍稀释的二抗室温孵育75min ; 用含0. 1 % Tween-20的TPBS冲洗，将PVDF膜浸入发光底物溶液中反应lmin， X射线胶片 曝光。
试验例3 : 四噻唑蓝(MTT)法测定KCl对MPP+剌激的PC12细胞的保护作用 [OO56] ( — )PC12细胞株的培养 PC12细胞用含10X马血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的 RPMI1640培养基，于37°C 、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。每2_3天更换培养基一次， 细胞达约70 % 80%融合时，传代或用于实验。 [OO58] (二)PC12细胞的排板 用0. 25%的胰酶将贴壁的PC12细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将 细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为lX10、ell/孔，在含有10X马血清，5X胎牛血清、 100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下进 行贴壁培养。(三)梯度浓度KC1剌激 细胞培养过夜，换新鲜RPMI1640培养基，对照组不加KC1，实验组分别用40mM的 浓度KC1 ， 0. 3mM浓度MPP+， 30mM的浓度KC1加上0. 3mM浓度MPP+分别剌激剌激。各组设5 个平行实验。(四)四噻唑蓝(MTT)试验 取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，继续孵育4小时 后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150 yl 二甲基亚砜，小心混匀，用 酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。
(五)细胞的存活率计算 存活率％ =加药组A值/对照组A值X 100%
试验例4 : Western Blot检测KCl对MPP+剌激的PC12细胞Trx蛋白表达的影响
( — )PC12细胞株的培养 PC12细胞用含10X马血清，5X胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL链霉素的 RPMI1640培养基，于37°C 、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。每2_3天更换培养基一次， 细胞达约70 % 80%融合时，传代或用于实验。
(二)PC12细胞的排板 用0. 25%的胰酶将贴壁的Hela细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将 细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为1X10、ell/孔，在含有10X胎牛血清、100U/mL青 霉素和100ii g/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。(三)梯度浓度KCl剌激 细胞培养过夜，换新鲜RPMI1640培养基，对照组不加KC1，实验组分别用实验组分
别用40mM的浓度KCl ， 0. 3mM浓度MPP+， 40mM浓度KCl加上0. 3mM浓度MPP+剌激。各组设
三个以上平行实验。(四)四噻唑蓝(MTT)试验 取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，继续孵育4小时 后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150 yl 二甲基亚砜，小心混匀，用
7值。 [OO76](五)细胞的存活率计算 存活率％ =加药组A值/对照组A值X 100%
( 二 )免疫印迹
1.蛋白含量的测定 用BCA试剂盒测定将10 ii 1标准品或待测样本与200 ii 1WR工作溶液混合，37°C 孵育30min，将反应管温度冷却至室温。测定562nm光密度值，绘制标准曲线，并计算蛋白浓度。 2.蛋白免疫印迹(Western Blot) 总蛋白加样量为6i! g，与2XSDS凝胶加样缓冲液混合后，95t:热变性5min，用 15X的SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白条带用电转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶4°〇封 闭过夜；取出PVDF膜，用含0. 1% Tween-20的TPBS冲洗后，加入1000倍稀释的一抗室温 孵育75min ;用含0. 1 % Tween-20的TPBS冲洗，加入5000倍稀释的二抗室温孵育75min ; 用含0. 1 % Tween-20的TPBS冲洗，将PVDF膜浸入发光底物溶液中反应lmin， X射线胶片 曝光。 与对照组相比，在最适剂量时KC1能增加PC12细胞生长繁殖并且诱导了 Trx蛋白 表达水平，KC1还可以保护PC12细胞免于帕金森毒性物MPP+损伤。由于Trx具有抗凋亡， 保护细胞的作用，因此，KC1通过诱导Trx的表达来促进神经细胞的生长和保护神经细胞。 本发明通过上述试验证明了 KC1能促进PC12细胞的生长和保护PC12细胞免于帕金森病毒 性物损伤。 本发明的试验例旨在证实KC1保护神经细胞免于MPP+的损伤。
很多研究中，把细胞外高钾(高浓度KCl，20-200mM)剌激作为组织缺血导致细胞 内游离钙离子升高的模型。KC1具有促使细胞膜去极化而导致细胞内游离Ga2+离子升高的 作用，而钙离子作为第二信使，参与调控很多与促进细胞增殖，细胞分化相关的信号通路。 不同程度细胞内游离钙离子的浓度，本身对细胞内各种生理反应起到不同程度的信号调节 作用，甚至起到相反的作用，这些都提示我们KC1的浓度不同所产生的作用亦不同。本发明 中也探讨了不同浓度的KC1的不同作用。MPP+具有抑制PC12细胞的生长增殖并诱导PC12 细胞的凋亡的作用。PC12细胞中加入KC1，结果表明20-40mM的KCl能促进PC12细胞的生 长(图D，诱导PC12细胞中Trx的蛋白表达(图2)，而且，用20-40mM的KCl预剌激PC12 细胞时，明显保护细胞免受由MPP+所致细胞损伤作用(图3)，并且加入KC1的能使MPP+所 致的Trx的蛋白表达有所回升(图4)。这些结果都说明适当浓度的KC1可用于促进神经细 胞生长或者增殖，保护神经细胞免于帕金森病毒性物的损伤。 由于KC1能促进PC12细胞的生长，保护神经细胞免于帕金森病毒性物的损伤是本 发明首次发现的。因此，以适当浓度的KC1作为促进神经细胞生长和保护神经细胞免于帕 金森病毒性物损伤就成为必然。
权利要求
KCl作为促进神经细胞生长剂的应用。
2. KCl作为促进PC12细胞生长剂的应用。
3. KCl作为抗氧化应激损伤剂的应用。
4. KCl作为PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤剂的应用。
5. KCl在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及KCl的医药新用途，涉及KCl作为促进神经细胞生长剂、促进PC12细胞生长剂、抗氧化应激损伤剂、PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤剂的应用，以及KCl在制备治疗帕金森病的药物中的应用。经四噻唑蓝(MTT)法，发现KCl能促进大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞)的生长，KCl具有促进神经细胞增殖的活性，并且抑制帕金森毒性物MPP+(1-Methyl-4-Phenylpyridinium ion)导致的神经细胞的损伤；蛋白质免疫印迹法表明，KCl可以诱导PC12细胞中硫氧还蛋白的表达水平。因此，KCl保护神经细胞免于MPP+毒性与诱导硫氧还蛋白表达有关。
文档编号A61P43/00GK101695500SQ20091009509
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者李彦辉, 白洁 申请人:昆明理工大学;