专利名称：针对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体的制作方法
针对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体相关申请的交叉引用本申请要求于2008年4月28日提交的美国第61/048，522号临时申请的权益，该 申请通过引用的方式并入本文中。发明背景 “粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) ”是在响应多种炎症介质时由存在于造 血环境和炎症外周部位的细胞产生的小糖蛋白。GM-CSF能够刺激来自骨髓细胞的嗜中性粒 细胞、巨噬细胞以及混合的粒细胞-巨噬细胞集落的产生，并且能够刺激来自胎儿肝脏祖 细胞的嗜酸性集落的形成。GM-CSF还能够刺激成熟粒细胞和巨噬细胞的功能性活动，以及 抑制粒细胞和巨噬细胞的凋亡。已提出GM-CSF在多种疾病的发病机理中起作用。因此需要靶向GM-CSF的额外治 疗。本发明提供了改良的抗-GM-CSF抗体，例如，用于治疗GM-CSF为致病机制的一部分的疾病。发明概述一方面，本发明提供了抗-GM-CSF抗体，例如，人工程化的(humaneered)抗体， 以及利用所述抗体治疗疾病的的方法，对这些疾病而言，抑制GM-CSF受体信号传导是理 想的。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗-GM-CSF抗体，其包括含⑶R3结合特 异性决定簇RQRFPY或RDRFPY、J节段和V-节段的重链可变区，其中J-节段包含与人 JH4 (YFDYffGQGTLVTVSS)至少95%的一致性，以及V-节段包含与人种系VHl 1-02或VHl 1-03序列至少90%的一致性；或者含⑶R3结合特异性决定簇的重链可变区，该特异性决 定簇包括RQRFPY。在一些实施方案中，J节段包含YFDYWGQGTLVTVSS。在一些实施方案中， CDR3包含RQRFPYYFDY或RDRFPYYFDY。在一些实施方案中，重链可变区CDRl或CDR2能够 是人种系VHl序列；或者⑶Rl和⑶R2能够是人种系VHl。在一些实施方案中，抗体包含人 重链可变区⑶Rl或⑶R2，或者⑶Rl和⑶R2两者，如在
图1中列出的Vh区所示。在一些实 施方案中，本发明的抗体的V-节段具有图1所示的Vh V节段序列。在一些实施方案中，本 发明的抗体包含的Vh具有图1列出的VH# 1，VH#2, VH#3, VH#4或VH#5序列。本发明还提供了例如，具有上段中描述的重链可变区的抗-GM-CSF抗体，，其中该 抗体包括含⑶R3结合特异性决定簇FNK或FNR的轻链可变区。在一些实施方案中，这种 抗体包含人种系JK4区。在一些实施方案中，抗体八区⑶R3包含QQFN(K/R)SPLT.，例如 QFNKSPLT。在一些实施方案中，轻链可变区包含图1所示的八区的⑶Rl或⑶R2，或者⑶Rl 和⑶R2两者。在一些实施方案中，\区包含与图1所示的VKIIIA27V节段序列具有至少 95% —致性的V节段。在一些实施方案中，Vl区具有图1所示的VH#1，VH#2, VH#3或VH#4 序列。在一些实施方案中，本发明的抗体的单价亲和力优于约ΙΟηΜ，经常优于(低于) 约500pM或优于约50pM，这通过在37°C进行的表面等离子共振分析来测定，所述抗体例如 具有选自图1中的Vh区序列区序列以及选自图1中的八区序列的\区。因此，在一 些实施方案中，本发明的抗体的亲和力(如利用表面等离子共振测量的)低于50pM，通常低于约25pM，或甚至低于约ΙΟρΜ。在一些实施方案中，本发明的抗-GM-CSF具有慢解离速 率，对于与GM-CSF的单价相互作用，通过在37°C的表面等离子共振分析测定的解离速率常 数(kd)低于约ΙΟ 优选低于5x IO-5S-1,以及最优选低于ΙΟ、—1。在一些实施方案中，本 发明的抗体的解离速率比在相同条件下测定的参考嵌合C19/2单克隆抗体慢2至3倍，但 在测量GM-CSF活性的基于细胞测定中，中和GM-CSF活性的效能比参考抗体的效能大至少 6-10 倍。
在一些实施方案中，具有本文所述的重链可变区和/或轻链可变区的本发明的抗 体是IgG。在一些实施方案中，重链具有恒定区，该恒定区具有SEQ ID N0:11的序列。在 一些实施方案中，轻链恒定区是具有SEQ ID N0:10所示序列的κ轻链。在一些实施方 案中，本发明的抗体具有SEQ ID NO :11所示的重链恒定区、具有SEQ ID N0:10所示序列 的轻链κ恒定区以及选自图1所示的重和轻链可变区的重链和轻链可变区，例如，抗体重 链和轻链可变区包含来自图1所列序列的下述组合的一个a)VH#2，VK#3 ；b)VH#l, VK#3 ； c)VH#3, VK#1 ；d) VH#4, VK#3 ；e)VH#4, VK#4 ；f) VH#4, VK#2 ；g) VH#5, VK#1 ；h) VH#5, VK#2 ；i) VH#3,VK#4 ；或j)VH#3，VL#3)。结合本文的教导，本领域技术人员会意识到本发明的抗体能 够选自图1所列的Vh区和\区的任一组合。 在一些实施方案中，Vh区或八区序列，或者Vh区和\区两者氨基酸序列都在N末 端包含甲硫氨酸。在另外方面，本发明提供了治疗患者的方法，所述患者患有其中抑制GM-CSF是理 想的疾病，该方法包括给予患者治疗有效量的前述权利要求中任一项的抗体。在一些实施 方案中，所述患者患有骨质减少症、类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、银屑病、慢性阻塞 性肺疾病、特发性血小板减少性紫癜、阿耳茨海默氏病、心衰、缺血事件导致的心肌缺损或 糖尿病。附图简述图1提供了抗GM-CSF抗体的示例性的Vh区或\区序列。图2.通过在37°C的表面等离子共振分析(Biacore 3000)测定的GM-CSF与 Abl(A)或Ab2(B)的结合。Abl和Ab2被捕获在Biacore芯片上固定的抗Fab多克隆抗体上。 如所显示的，不同浓度的GM-CSF注射在表面上方。假定1 1相互作用，使用Scrubber2 软件进行整体拟合分析(Global fit analysis)。图3. Abl和Ab2与糖基化的和非糖基化的GM-CSF结合。通过ELISA测定与人293 细胞表达的糖基化的GM-CSF或大肠杆菌(E.coli)中表达的非糖基化的GM-CSF的结合。 显示了来自单次试验的代表性的结果(试验1)。将从1500ng/ml开始的Abl和Ab2的两 倍稀释液应用到GM-CSF包被的孔中。每一点代表一式三份测定的平均值士标准误。利用 Prism 5. 0 软件(Graphpad)进行 Sigmoidal 曲线拟合。图4.证实Abl和Ab2与共享表位结合的竞争性ELISA。用50ng/孔重组GM-CSF 包被的ELISA板用不同浓度的抗体(Ab2、Abl或同种型对照抗体)以及50nM生物素化Ab2 孵育。利用中性亲和素(neutravidin)-HRP偶联来测定生物素化的抗体结合。对与GM-CSF 的结合的竞争进行1小时(A)或进行18小时(B)。每一点代表一式三份测定的平均值士 标准误。利用Prism 5. O软件(Graphpad)进行Sigmoidal曲线拟合。图5. GM-CSF诱导的IL-8表达的抑制。不同量的每种抗体与0. 5ng/ml GM-CSF孵育，以及与U937细胞孵育16小时。通过ELISA测定分泌到培养物上清的IL-8。发明详述如本文所用的，“抗体”指蛋白，该蛋白在功能上被定义为结合蛋白，在结构上被定 义为包含氨基酸序列，该序列被本领域技术人员公认为来自产生抗体的动物的免疫球蛋白 编码基因的框架区。抗体能够由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片 段编码的多肽组成。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定区基因， 以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为Y、μ、α、δ或ε，其依 次分别定义免疫球蛋白类型IgG，IgM, IgA, IgD和IgE。已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对完全相 同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的 N末端确定了约100-110或更多的氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链 (Vl)和可变重链(Vh)分别指这些轻链和重链。此处使用的术语“抗体”还包括保留结合特异性的抗体片段。例如，有许多表征清 楚的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键近C-端消化抗体，以产生F(ab) ! 2，Fab的二聚体，该二聚体自身是通过二硫键连接到VH-CHl的轻链。该F(ab) ! 2能够在 温和条件下被还原，以破坏在铰链区的二硫键，从而将(Fab' )2 二聚体转化为Fab'单体。 该Fab'单体本质上是带有部分铰链区的Fab(对于其他抗体片段的更具体的描述，参见 Fundamental Immunology (基础免疫学),W. E. Paul, ed.，Raven Press, N. Y. (1993))。尽 管根据完整抗体的消化定义了多种抗体片段，本领域技术人员会认识到能够以化学方式或 通过利用重组DNA方法学从头合成片段。因此，此处使用的术语“抗体”包括通过完整抗体 的修饰产生的或利用重组DNA方法学合成的抗体片段。本发明的抗体还包括多种对形式，包括单链抗体(以单多肽链存在的抗体)， 诸如单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中可变重链区和可变轻链区连接在一起(直接地或通 过肽连接子)以形成连续的多肽。单链Fv抗体是共价连接的VH-\，其可以-和V^编 码序列的核酸表达，所述Vh-和编码序列直接连接的或通过肽编码连接子连接(例如， Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci USA，85 :5879_5883，1988)。虽然 Vh 和 Vl 作为单多肽 链相互连接，但Vh和\结构域的结合是非共价的。抗体还可以是另一片段形式，诸如二硫 化物稳定的Fv(dSFv)。还可以例如利用重组技术产生其他片段作为可溶蛋白或作为从展示 方法获得的片段。抗体还可以包括双抗体和微型抗体。本发明的抗体还包括诸如来自骆驼科动物抗体的重链二聚体。由于骆驼科动物 体内的重链二聚体IgG的Vh区不必与轻链之间形成疏水作用，因此，通常接触轻链的重链 中的该区在骆驼科动物体内被改变为亲水性氨基酸残基。重链二聚体IgG的Vh结构域被 称为VHH结构域。另外，用于本发明的抗体包括单域抗体(dAbs)和纳米抗体(参见例如 Cortez-Retamozo, et al, Cancer Res. 64 :2853_2 857,2004)。如本文所用的，“V-区”指抗体可变区结构域，该结构域包含框架1、⑶R1、框架2、 ⑶R2和框架3节段，包括⑶R3和框架4，这些节段作为B细胞分化期间重链和轻链V区基 因重排的结果被加到V-节段上。本文使用的“V-节段”指由V基因编码的V-区(重或轻 链)的区。重链可变区的V-节段编码FRl-⑶R1-FR2-⑶R2和FR3。出于本发明的目的，轻 链可变区的V-节段被定义为通过FR3延伸至到⑶R3。
如本文所用的，术语“J-节段”指编码的可变区的亚序列，其包含⑶R3的C末端部 分和FR4。内源性J-节段由免疫球蛋白J基因编码。如本 文所用的，术语“互补性决定区(CDR) ”指每条链上的三个高变区，其中断由轻 和重链可变区确立的四个“框架”区。这些⑶R主要负责结合到抗原表位。从N末端开始 顺序编号，每条链的几个⑶R(⑶Rs)通常称为⑶R1、⑶R2和⑶R3，以及通常被其中有特定 ⑶R的链所确定。因此，例如，Vh⑶R3位于它被发现的抗体重链可变结构域；而Vl⑶Rl是 来自它被发现的抗体轻链可变结构域的CDRl。不同轻或重链的框架区的序列在同一物种内是相对保守的。抗体的框架区是组成 型轻和重链的组合框架区，用于在三维空间定位和排列⑶Rs。CDRs和框架区的氨基酸序列可以利用为本领域技术人员所熟知的不同的定义 来确定，例如Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见例如Johnson et al, supra ；Chothia & Lesk，1987，Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins (用于免疫球蛋白高变区的极限结构式).J. Mol. Biol. 196， 901-917 ；Chothia C. et al. ,1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions(免疫球蛋白高变区的构象).Nature 342,877-883 ；Chothia C. et al.，1992， structural repertoire of the human VH segments (人 VH 节段的结构集合)· J. Mol. Biol. 227,799-817 ；Al-Lazikani et al，J. Mol. Bioll997，273 (4))。抗原结合位点的定 义还在下列文章中被描述Ruiz et al. , IMGT，国际免疫遗传学数据库。Nucleic Acids Res. 28，219-221 (2000)；以及Lefranc，Μ.-P. IMGT，国际免疫遗传学数据库。Nucleic Acids Res. Jan 1 ；29 (1) 207-9 (2001) ；MacCalIum et al, Antibody-antigen interactions Contact analysis and binding site topography ( -
结合位点布局)，J. Mol. Biol.，262 (5) ,732-745(1996)；以及 Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA,86,9268-9272 (1989) ；Martin, et al, Methods Enzymol，203，121 — 153， (1991) ；Pedersen et al, Immimomethods, 1,126, (1992)；以及 Rees et al, In Sternberg M. J.E. (ed.), Protein Structure Prediction (蛋白质结构预测)· Oxford University Press, Oxford,141-172 1996)。“表位”或“抗原决定簇”指抗原上与抗体结合的位点。表位可以通过连续的氨基 酸或经由蛋白三级折叠紧靠的非连续的氨基酸形成。暴露于变性剂时，通过连续的氨基酸 形成的表位通常被保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性剂处理时消失。表位在 独特的空间构象中通常包括至少3个，以及更通常地至少5个或8-10个氨基酸。确定表 位空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (分子生物学方法中的表位分析操作)， Vol. 66，Glenn Ε. Morris, Ed(1996)。本发明上下文中使用的术语“结合特异性决定簇”或“BSD”指在CDR区内用于确 定抗体结合特异性所必需的最小的连续或非连续氨基酸序列。在本发明中，该最小结合特 异性决定簇位于抗体重链和轻链的⑶R3序列的部分或全长内。如本文所用的，“抗GM-CSF抗体”或“GM-CSF抗体”可互相替换使用，指结合到 GM-CSF并抑制GM-CSF受体活性的抗体。可以利用评价GM-CSF结合和/或功能的多种本 领域公认的测定方法来鉴定这类抗体。例如，可以利用诸如ELISA测定的结合测定，其测量GM-CSF与α受体亚单位结合的抑制。也方便地应用关于GM-CSF受体信号传导的基于细胞 的测定，诸如确定GM-CSF依赖的细胞系响应有限量的GM-CSF时的增殖率的测定，如同测量 细胞因子产生的量的测定，例如响应GM-CSF接触时的IL-18产生。 如本文使用的，“中和抗体”指与GM-CSF结合并抑制通过GM-CSF受体的信号传导 或抑制GM-CSF与其受体结合的抗体。如本文所使用的，“粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF) ”指小的天然存在的 具有内部二硫键的糖蛋白，分子量为约23kDa。在人类，它是由位于人类第5号染色体上的 细胞因子簇内的基因编码。人类基因和蛋白的序列是已知的。该蛋白具有N-末端信号序 列和C-末端受体结合结构域(Rasko and Gough In :The Cytokine Handbook (细胞因子手 册)，A. Thomson, et al, Academic Press, New York(1994)，第 349-369 页)。其三维结构 与白介素的结构相似，尽管氨基酸序列并不相似。GM-CSF在响应由存在于造血环境中和炎 症周围部位的许多炎症介质时产生。GM-CSF能够刺激来自骨髓细胞的嗜中性粒细胞、巨噬 细胞和混合的粒细胞_巨噬细胞集落的生成，并能够刺激嗜酸性粒细胞集落从胎儿肝脏祖 细胞形成。GM-CSF也能够刺激成熟的粒细胞和巨噬细胞的一些功能性活动并抑制粒细胞和 巨噬细胞的凋亡。术语“平衡解离常数”或“亲和力”缩写为(Kd)，指除以结合速率常数(ka，时间_1， Μ"1)的解离速率常数(kd，时间―1)。平衡解离常数可以利用本领域已知的任一方法测量。本 发明的抗体是高亲和力抗体。这种抗体具有优于(低于)约ΙΟηΜ，通常优于约500pM或优于 约50pM的单价亲和力，这通过在37°C进行的表面等离子共振分析来测定。因此，在某些实 施方案中，本发明的抗体具有低于50pM，通常低于约25pM、或甚至低于IOpM的亲和力(如 利用表面等离子共振所测量的)。在一些实施方案中，本发明的GM-CSF具有慢解离速率，对于与GM-CSF的单价相互 作用，通过在37°C的表面等离子共振分析测定的解离速率常数(kd)低于约ΙΟ—4。1，优选低 于δχΙΟ、—1，以及最优选低于ΙΟ、—1。如本文所用的，“人源化抗体(humanized antibody)，，指将来自供体抗体的CDRs 移植到人框架序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体还可以在框架序列中包含供体来源的 残基。人源化抗体还可以包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人源化抗体还可以包 含既不是在受体抗体也不是在输入的CDR或框架序列中发现的残基。人源化能够利用本 领域所熟知的方法来实现(例如，Jones et al, Nature 321 522~525 ； 1986 ；Riechmann et al. , Nature 332 323~327,1988 ；Verhoeyen et al, Science239 1534-1536,1988)； Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2 :593_596，1992 ；U. S. Patent No. 4，816，567)，包括诸如〃 超人化(superhumanizing)“抗体(Tan et al, J. Immunol 169 1119，2002)和〃表面重塑 (resurfacing)“(例如，Staelens et al, MoL Immunol 43 1243, 2006 ；and Roguska et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 91:969,1994)的技术。本发明上下文中的“人工程化”抗体(“humaneered” antibody)指具有参照抗体 结合特异性的工程化人抗体。用于本发明的“人工程化”抗体具有包含从供体免疫球蛋白 衍生的最小序列的免疫球蛋白分子。通常地，抗体通过将编码来自参照抗体重链CDR3区的 结合特异性决定簇(BSD)的DNA序列连接到人Vh节段序列，以及将来自参照抗体轻链CDR3 BSD连接到人\节段序列被“人工程化”。“BSD”指介导结合特异性的⑶R3-FR4区，或该区的一部分。因此，结合特异性决定簇可以是⑶R3-FR4、⑶R3、⑶R3的最小必需结合特异性 决定簇(其指当存在于抗体V区时赋予结合特异性的任一小于CDR3的区)、D节段(关于 重链区)，或赋予参照抗体结合特异性的CDR3-FR4的其他区。人工程化的方法在公开号为 20050255552的美国专利申请和公开号为20060134098的美国专利申请中被提供。本文使用的“人”抗体包括人源化和人工程化抗体，以及利用已知技术获得的人单 克隆抗体。当术语“杂种”被用于提及核酸或蛋白的部分时，表示该核酸或蛋白包含两个或多 个序列，这些序列通常不是在自然界发现的彼此有相同亲缘关系的序列。例如，该核酸通常 以重组方式产生，其具有两个或多个序列，例如来自被排列以产生新的功能性核酸的无关 联的基因。类似地，杂种蛋白指通常不是在自然界发现的彼此有相同亲缘关系的序列的两 个或多个序列。 当用术语“重组的”提及例如细胞、核酸、蛋白或载体时，指所述细胞、核酸、蛋白或 载体已经通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白被修饰，或者指所述细胞来自进 行过如此修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞表达不在细胞的天然形式(非重组的)内存 在的基因或表达否则会异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。本文所用术语“重组的 核酸”指正常不在自然界存在的形式的核酸，其最初一般通过例如利用聚合酶和核酸内切 酶操纵核酸在体外形成。以这种方式，实现不同序列的可操作连接。因此出于本发明的目 的，线性形式的分离的核酸，或者通过连接正常不相连的DNA分子在体外形成的表达载体 都被认为是重组的。可以理解，一旦重组的核酸被制备并重新导入宿主细胞或有机体，它会 以非重组形式复制，即，利用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操纵；然而，出于本发明 的目的，这类核酸，一旦被重组制备，尽管随后非重组复制，仍然被认为是重组的。类似地， “重组蛋白”是利用重组技术制备的蛋白，即，通过上文所述的重组核酸的表达。当提及蛋白或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”到抗体或“特异性(或选择 性)与…免疫反应”指抗体结合感兴趣蛋白的结合反应。在本发明中，抗体结合感兴趣抗原 如GM-CSF的亲和力优于它对其它抗原的亲和力至少100倍。用于两个或更多个多肽(或核酸)序列时，术语“一致的”或“一致性”百分比指两 个或多个序列或子序列相同或者具有特定百分比的相同氨基酸残基或(核苷酸)(即，当在 比较窗(comparison window)或指定区域比较并对齐以进行最大的对应时，在特定的区域 有约 60% 的一致性，优选 70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97%,98%,99%或更高的一致性)，如使用下述的带缺省参数的BLAST或BLAST 2. 0序列比 较算法或通过手工比对和目测(参见，例如NCBI万维网站)所测量的。这样的序列被称为 “基本上一致的”。基本上一致的”序列也包括具有删除和/或添加的序列，和具有取代的那 些，以及例如多态或等位变体的天然存在的变体，以及人工变体。如下文所述的，优选的算 法可以解释空位及类似情况。优选地，蛋白序列一致性存在于至少约25个氨基酸长度的区 域，或更优选地存在于50-100个氨基酸长度的区域，或者整个蛋白长度。如本文使用的，“比较窗”包括选自一般为20-600，通常为约50-约200，更通常 约100-约150的连续位的数目中的一个的片段的参照，其中可以将序列与具有相同数 目连续位的参照序列最佳比对后进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域是公知 的。例如，可以通过Smith& Waterman，Adv. Appl. Math. 2 :482 (1981)的局部同源性算法、通过 Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48 443(1970)的同源比对算法、通过Pearson & Lipman, Proc. Nat' 1. Acad. Sci USA 85 =2444(1988)的相似性检索方法、通过这些算法的 计算机实施(Wisconsin Genetics Software Package (威斯康星遗传学软件包)中的GAP， BESTFIT，FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group (遗传学计算机组)，575 Science Dr.，Madison，WI)或通过手工比对和目测(参见，例如 Current Protocols in Molecular Biology(通用分子生物学技术)(Ausubel et al.，eds. 1995supplement))进行用于比较 的序列的最优化比对。适于确定序列一致性百分比和序列相似性的优选的算法实例包括BLAST和BLAST 2. O 算法，这些算法在 Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25 3389-3402 (1977)和 Altschul et al, J. Mol. Biol 215 :403_410 (1990)中有记载。具有本文所描述的参数的BLAST和 BLAST 2. O用于确定本发明的核酸和蛋白的序列一致性百分比。BLASTN程序(对于核苷酸 序列)使用的缺省值是字长(W)为11、期望值(E)为10、M=5、N = -4以及进行双链的比较。 对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值是字长为3和期望值(E)为10，以及BL0SUM62 得分矩阵(参见 Henikoff&HenikofT，Proc· Natl Acad. Sci. USA 89 10915 (1989))比对(B) 为50、期望值(E)为10、M = 5、N = -4以及进行双链的比较。术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指物质基本上或实质上没有通常如在其 天然状态中发现的伴随的组分。纯度和同质性通常利用诸如聚丙烯凝胶电泳和高效液相色 谱法的分析化学技术来确定。存在于制剂中的主要种类的蛋白是基本上纯化的。术语“纯 化的”在某些实施方案中表示在电泳凝胶中基本上产生一条带的蛋白。优选地，它表示蛋白 是至少85%纯的，更优选地至少95%纯的，以及最优选地至少99%纯的。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可以互相替换使用，用于指氨基酸残基的多聚 体。该术语适用于氨基酸多聚体，该氨基酸多聚体中的一个或多个氨基酸残基是对应的天 然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及还适用于天然存在的氨基酸多聚体、包含修饰的 残基的那些，以及非天然存在的氨基酸多聚体。术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，此外还指在功能上与天然存在的氨 基酸类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些， 以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸 类似物指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构例如与氢结合的α碳、羧基、氨基、R 基的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物可以具 有修饰的R基(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本 化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸一般化学结构不同的结构的化合物，但其功能与 天然存在的氨基酸类似。本文的氨基酸可以通过它们公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委 员会推荐的单字母符号被提及。同样地，核苷酸可以通过它们公认的单字母代码被提及。“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守性修饰 变体指那些编码相同或本质上相同的氨基酸序列的核酸，或者如果所述核酸不编码氨基酸 序列，其指本质上相同或相关的序列，例如，天然的连续的序列。由于遗传密码的兼并性，大 量功能相同的核酸编码大多数蛋白。例如，密码子GCA，GCC, GCG和GCU都编码氨基酸丙氨 酸。因此，在由密码子指定的丙氨酸的每一位置处，该密码子都可以改变为描述的相应密码子中的另一个，而不改变编码的多肽。这种核酸变体是“沉默变体”，其是保守性修饰的变体 的一种。本文编码多肽的每一核酸序列也描述了所述核酸的沉默变体。本领域的技术人员 会认识到，在某些情形下，可以修饰核酸中的每一密码子(AUG除外，其通常是甲硫氨酸的 唯一密码子；TGG也除外，其通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此， 编码多肽的核酸的沉默变体经常内含在描述的序列中，所述序列与表达产物有关，而与实 际的探针序列无关。 对于氨基酸序列，本领域的技术人员会认识到，改变、添加或删除在编码的序列中 的单个氨基酸或小部分氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别的取代、删除或添加是 “保守性修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供了功能 类似的氨基酸的保守性取代表和诸如BLOSUM的取代矩阵在本领域中是公知的。这种保守 性修饰变体为本发明的多态性变体，种间同源体和等位体的附加，并不排除本发明的多态 性变体，种间同源体和等位体。典型的相互的保守性取代包括1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)； 2)冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K) ；5) 异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸 (W) ；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton， Proteins(1984))οI.引言本发明涉及以高亲和力与GM-CSF结合的抗体，并且是GM-CSF的拮抗剂。该抗体 包含与人种系序列具有高度一致性的可变区。在优选的实施方案中，本发明抗体的 CDRH3中的BSD序列包含氨基酸序列RQRFPY或RDRFPY。CDRL3中的BSD包含FNK或FNR。完整的V区通过如下方式产生其中，BSD形成部分⑶R3，另外的序列用于完成 ⑶R3和添加FR4序列。通常，⑶R3除BSD之外的部分和完整的FR4由人种系序列组成。在 一些实施方案中，除BSD之外的CDR3-FR4序列与人种系序列的差异在每条链上不超过2个 氨基酸。在一些实施方案中，J节段包含人种系J节段。例如，可以通过公众可用的国际免 疫遗传学数据库(IMGT)和基于V的数据库(V-base)(万维网vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk) 确定人种系序列。人种系V节段的集合由51个重链V区、40个κ轻链V节段和31个λ轻链V 节段组成，产生共计3，621个种系V区对。另外还有针对这些V节段的大多数的稳定等 位变体，但这些变体对种系集合的结构多样性的贡献是有限的。所有人种系V节段基因 的序列都是已知的，并可以在由英国剑桥蛋白质工程MRC中心(MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,United Kingdom)提供的基于V的数据库中获取(还参见Chothia et al,1992, J Mol Biol 227 776-798 ；Tomlinson et al，1995，EMBO J 14:4628-4638; Cook et al(1995)Immunol. Today 16:237-242 and Williams et al,1996, J Mol Biol 264 -.220-232)。本文所描述的抗体或抗体片段能够在原核或真核微生物系统中、或者在诸如哺乳 动物细胞的更高级的真核生物细胞中表达。本发明中所用的抗体可以是任何形式。例如，在一些实施方案中，该抗体可以是 包含恒定区，例如人的恒定区的完整抗体，或者可以是完整抗体的片段或衍生物，例如Fab， Fab'，F (ab ‘ ) 2，scFv, Fv,或者是单域抗体，例如纳米抗体或骆驼科动物抗体。
II.重链本发明的抗-GM-CSF抗体的重链包含具有下列元件的重链V区1)包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人重链V节段序列
2)包含氨基酸序列R (Q/D) RFPY的CDRH3区3)由人种系J基因节段提供的FR4。
图1中显示了支持结合到GM-CSF的V节段序列及前面所述的⑶R3-FR4节段及互 补的\区的实例。例如，该V节段可以来自人的VHl亚类。在一些实施方案中，该V节段 是人VhI亚类节段，其与种系节段VHl 1-02或VHl 1-03具有高度氨基酸序列一致性，例如至 少80 %、85 %或90 %或更高的一致性。在一些实施方案中，该V节段与VHl 1-02或VHl 1-03 的区别不超过15个残基，以及优选地不超过7个残基。本发明的抗体的FR4序列由人的JHl、JH3、JH4、JH5或JH6基因种系节段提供，或 者由与人种系JH节段具有高度氨基酸序列一致性的序列提供。在一些实施方案中，J节段 是人种系JH4序列。⑶RH3还包含来自人的J节段的序列。通常地，除去BSD的⑶RH3-FR4序列与人种 系J节段的区别不超过2个氨基酸。在典型的实施方案中，CDRH3中的J节段序列来自用 于FR4序列的同样的J节段。由此，在一些实施方案中，该⑶RH3-FR4区包含BSD和完整的 人JH4种系基因片段。CDRH3和FR4序列的示例性组合如下所示，其中BSD用粗体表示，人 种系J片段JH4残基用下划线表示。CDR3R (Q/D) RFPY YFDYffGQGTLVTVSS在一些实施方案中，本发明的抗体包含的V节段与种系节段VH1-02或VH1-03、或 与图1所示的Vh区的一个V节段如VH# 1，VH#2, VH#3, VH#4或VH#5的V节段部分具有至 少 90% —致性，或至少 91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或 100% 的一致性。在一些实施方案中，Vh区的V节段具有如图1所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本 发明的抗体可以具有包含序列GYYMH或NYYIH的CDRl ；或包含序列WINPNSGGTNYAQKFQG或 WINAGNGNTKYSQKFQG 的 CDR2。在特定的实施方案中，抗体具有来自图1所示的Vh区V节段的一个的⑶Rl和 CDR2，以及包含R(Q/D)RFPY如RDRFPYYFDY或RQRFPYYFDY的CDR3。因此，在一些实施方 案中，本发明的抗GM-SCF抗体可以例如，具有包含序列R (Q/D) RFPYYFDYffGQGTLVTVSS的 ⑶R3-FR4以及如图1所示的⑶Rl和/或⑶R2。在一些实施方案中，本发明的抗体的Vh区具有含结合特异性决定簇R(Q/D)RFPY 的⑶R3、来自人种系VHl节段的⑶R2或来自人种系VHl的⑶R1。在一些实施方案中，⑶Rl 和⑶R2都来自人种系VHl节段。III.轻链本发明的抗-GM-SCF抗体的轻链包含具有下列元件的轻链V区1)包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人轻链V节段序列2) CDRL3 区，其包含序列 FNK 或 FNR，例如 QQFNRSPLT 或 QQFNKSPLT3)由人种系J基因节段提供的FR4。
八区包含V λ或VK V节段。图1中提供了支持结合的V κ序列及互补的Vh区的 实例。八区⑶ R3序列包含J节段衍生的序列。在典型的实施方案中，⑶RL3中的J节段 序列来自用于FR4的同样的J节段。由此，在一些实施方案中，该序列与人κ种系V节段 和J节段序列的差异可以不超过2个氨基酸。在一些实施方案中，该CDRL3-FR4区包含BSD 和完整的人JK4种系基因节段。用于κ链的示例性CDRL3-FR4组合如下所示，其中最小的 必需结合特异性决定簇用粗体显示，JK4序列用下划线表示。CDR3QQ FNR SPLTFGGGTKVEIK
QQ FNK SPLTFGGGTKVEIKVk节段通常属于VKIII亚类。在一些实施方案中，该节段具有与人种系VKIII亚 类至少80%的序列一致性，例如与人种系VKIIIA27序列至少80%的一致性。在一些实施方 案中，Vk节段与VKIIIA27的差异可以不超过18个残基。在其他实施方案中，本发明的抗 体的八区V节段与图1中所示的\区的人1^￥节段序列，例如￥1(#1，￥1(#2，￥1(#3或￥1(#4的 V节段序列具有至少85%的一致性，或至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%， 98%，99% 或 100% 的一致性。在一些实施方案中，八区的V节段具有如图1所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本 发明的抗体可以具有CDRl序列RASQSVGTNVA或RASQSIGSNLA ；或CDR2序列STSSRAT。在特定的实施方案中，本发明的抗-GM-CSF抗体可以具有显示在图1中所示的八 区的一个V节段中的⑶Rl和⑶R2组合，以及包含FNK或FNR的⑶R3序列，例如⑶R3可以 是QQFNKSPLT或QQFNRSPLT。在一些实施方案中，这种抗-GM-CSF抗体可以包含FR4区，该 FR4区是FGGGTKVEIK。因此本发明的抗-GM-CSF抗体可以包含例如，来自图1所示的一个 Vl 区的 CDRl 和 CDR2，以及为 FGGGTKVEIK 的 CDR3-FR4 区。IV. GM-CSF抗体的制备本发明的抗体可以包含图1所示的Vh区VH#1，VH#2, VH#3, VH#4或VH#5的任一 个。在一些实施方案中，本发明的抗体可以包含图1所示的\区VK#1，VK#2，VK#3或VK#4 的任一个。在一些实施方案中，抗体具有图1所示的Vh区VH#1，VH#2，VH#3, VH#4或VH#5 ； 以及如图1所示的\区VK#1，VK#2, VK#3或VK#4。可以测试抗体以确定该抗体保留拮抗GM-CSF活性的活性。拮抗剂活性能够利用 多种指标来确定，包括增殖测定。利用评价GM-CSF功能的多种测定来评价抗GM-CSF抗体。 例如，对于GM-CSF受体信号传导，方便地利用基于细胞的测定，诸如确定GM-CSF依赖的细 胞系响应有限量的GM-CSF的增殖率的测定。人TF-I细胞系适合用于这种测定。参见， Krinner et al，(2007)Mol. Immunol。给予治疗疾病(对疾病而言，抑制GM-CSF是理想的) 的抗体优选保留嵌合c 19/2抗体拮抗活性的至少约50%，或至少约75%，80%，90%，95% 或100%，例如W003/068920，其具有鼠单克隆抗体LMM102的可变区和CDRsjnfi Kabat所 定义的CDRHl DYNIHCDRH2 YIAPYSGGTGYNQEFKNCDRH3 RDRFPYYFDY
CDRLl KASQNVGSNVACDRL2 SASYRSGCDRL3 QQFNRSPLT。可以利用熟知的测定来鉴定高亲和力抗体，以确定结合活性和亲和力。这种技术 包括ELISA测定，以及利用表面等离子共振或干涉测量技术测定的结合测定。例如，亲和力 可以通过利用ForteBio (Mountain View, CA) Octet生物传感器的生物膜层干涉测量技术来 确定。本发明的抗体通常以相似的亲和力与糖基化和非糖基化形式的GM-CSF结合。本发明的抗体与C19/2竞争对GM-CSF的结合。本文所描述的抗体阻断cl9/2或 与C19/2竞争对GM-CSF的结合的能力表明，该抗体与cl9/2结合相同的表位，或结合到与 C19/2结合的表位接近的表位，例如与C19/2结合的表位交叠的表位。在其他的实施方案 中，本文所述的抗体，例如图1提供的表中所示的包含Vh和\区组合的抗体，可以被用作参 照抗体，以评价是否有另一抗体竞争对GM-CSF的结合。在测试抗体存在的情况下，如果参 照抗体对抗原的结合减少至少30%，通常至少大约40%、50%、60%或75%，以及经常至少 约90%，则测试抗体被视为竞争性地抑制参照抗体的结合。许多测定可以应用于评价结合， 包括ELISA，以及其他测定，诸如免疫印迹。先前已经描述了带有与人种系序列接近的V区序列的抗体的分离方法(公开号为 20050255552和20060134098的美国专利申请)。抗体库可以在适合的宿主细胞中表达，包 括哺乳动物细胞、酵母细胞或原核细胞。为了在某些细胞体系中表达，可以在N-末端引入 信号肽，以将分泌导向细胞外介质。有或无信号肽的抗体可以从诸如大肠杆菌(E. coli)的 细菌细胞分泌。在美国专利申请20070020685中描述了抗体片段从大肠杆菌的无信号分泌 的方法。为了生成GM-CSF-结合抗体，本发明的一个例如图1所示的Vh区与本发明的一个 例如图1所示的\区结合，并在合适的表达系统中以许多形式中的任一种表达。由此，该抗 体可以表达为scFv、Fab、Fab'(包含免疫球蛋白铰链序列)、F(ab' )2(通过两个Fab' 分子铰链序列间形成二硫键而形成)、完整的免疫球蛋白或截短的免疫球蛋白，或在原核或 真核宿主细胞中，无论是在宿主细胞内还是通过分泌方式，表达为融合蛋白。甲硫氨酸残基 可以任选地存在于例如在无信号表达系统中产生的多肽的N末端。本文描述的每一个
都可以与每一个\区成对，以生成抗-GM-CSF抗体。图1中显示了示例性的重链和轻链的 组合。本发明的抗体抑 制GM-CSF受体活化，例如通过抑制GM-CSF与受体结合，并且展示 了对GM-CSF的高亲和力结合，例如500pM。在一些实施方案中，抗体具有每秒约10_4或更 小的解离常数。不被理论约束，具有较小解离常数的抗体提供改良的治疗益处。例如，本发 明的抗体具有比cl9/2低三倍的解离速率，产生了超过10倍的有效的GM-CSF中和活性，例 如在基于细胞的测定中，诸如IL-8产生(参见，例如，实施例2)。可以利用多种表达系统，包括原核的和真核的表达系统来生产抗体。在一些实施 方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达，诸如CHO细胞表达系统。许多这种系统可以从供应 商处广泛获取。在抗体包含Vh和\区两者的实施方案中，该Vh和\区可以利用单一载体 来表达，例如在双顺反子表达单元中或在不同启动子控制下。在其他的实施方案中，该Vh* Vl区可以利用分别的载体来表达。本文所描述的Vh或\区可以在N末端任选地包含甲硫氨酸。本发明的抗体可以通过多种形式来生产，包括作为Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv或 dAB。本发明的抗体还能够包括人的恒定区。轻链的恒定区可以是人的κ或λ恒定区。重 链恒定区通常是Y链恒定区，例如Y-l、Y-2, Y-3或Y-4恒定区。在其他的实施方案 中，该抗体可以是IgA。在本发明的一些实施方案中，抗体Vl区，例如图1的VK#1，VK#2，VK#3或VK#4，与 人κ恒定区(例如，SEQ ID NO 10)结合以形成完整的轻链。在本发明的一些实施方案中，Vh区与人Y-I恒定区结合。可以选择任何适合的 Y-If同种异型，诸如f-同种异型。因此，在一些实施方案中，抗体是具有f-同种异型恒定 区例如SEQ ID而11的化6，其具有选自￥!1#1，￥!1#2，￥!1#3，￥!1#4或￥!1#5(图1)的VH。在一 些实施方案中，抗体具有选自兆#1，￥1(#2，￥1(#3或￥1(#4(图1)的\。在特定的实施方案中， 抗体具有SEQ ID N0:10所列的κ恒定区，以及SEQ ID NO :11所列的重链恒定区，其中重链 和轻链可变区包含下述来自图1所列的序列的组合中的一个a)VH#2，VK#3 ；b)VH#l,VK#3 ； c)VH#3, VK#1 ；d) VH#3, VL#3 ；e)VH#4, VK#4 ；f) VH#4, VK#2 ；g) VH#5, VK#1 ；h) VH#5, VK#2 ；i) VH#3, VK#4 ；或 j)VH#3，VL#3)。在一些实施方案中，例如，如果抗体是片段，该抗体能够与另一分子偶联，例如聚 乙二醇(聚乙二醇化)或血清蛋白，以在体内提供延长的半衰期。抗体片段聚乙二醇化的实 例在Knight et al. Plateletsl5 :409，2004(关于阿昔单抗)；Pedley et al. ,Br. J. Cancer 70 1126，1994(关于抗-CEA 抗体)；Chapman et al, Nature Biotech. 17 :780，1999 ；以及 Humphreys, et al.，Protein Eng. Des. 20 227,2007)中被提供。在一些实施方案中，本发明的抗体以Fab'片段的形式存在。全长轻链通过将八 区融合到人κ或λ恒定区产生。任一恒定区可以用于任何轻链。然而，在典型的实施方 案中，κ恒定区与Vκ可变区联用，以及λ恒定区与Vλ可变区一起使用。Fab'的重链是Fd'片段，其是通过将本发明的Vh区融合到人重链恒定区序列， 第一恒定结构域(CHl)和铰链区产生的。该重链恒定区序列可以来自任何的免疫球蛋白种 类，但通常来自IgG，以及可以来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。本发明的Fab'抗体还可以 是杂种序列，例如铰链序列可以来自一个免疫球蛋白亚类，CHl结构域可以来自另一亚类。V.用于治疗其中GM-CSF是靶标的疾病的抗GM-CSF抗体的给药。本发明还提供了治疗患有与GM-CSF有关的疾病的患者的方法，在该疾病中，抑制 GM-CSF活性是理想的，即，该疾病中GM-CSF是治疗靶标。在一些实施方案中，这种患者患有 慢性炎症疾病，例如关节炎，例如类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、青少年特 发性关节炎以及关节的其他炎症疾病；炎性肠疾病如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、巴雷特综 合征(Barrett' s syndrome)，回肠炎、肠炎和谷蛋白敏感性肠病；呼吸系统的炎性病症， 诸如哮喘、成人呼吸窘迫综合征、变态反应性鼻炎、矽肺、慢性呼吸道阻塞性疾病、超敏反应 肺疾病、支气管扩张症；皮肤的炎症疾病，包括银屑病、硬皮病和诸如湿疹、特应性皮炎、荨 麻疹和瘙痒症的炎症皮肤病；涉及中枢和外周围神经系统炎症的病症包括多发性硬化、特 发性脱髓鞘性多神经病、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、慢性炎症性脱髓 鞘性多发性神经病和诸如阿尔茨海默氏病的神经变性疾病。各种其它炎症疾病可以使用 本发明的方法治疗。这些包括系统性红斑性狼疮，免疫介导性肾脏病，例如肾小球肾炎和脊椎关节病；带有不良慢性炎症成分的疾病，诸如系统性硬化病，特发性炎症性肌病，肖格伦 氏综合征(Sjogren' s syndrome)，脉管炎，肉瘤样病，甲状腺炎，痛风，耳炎，结膜炎，窦炎， 肉瘤样病，贝赫切特综合征(Behcet' s syndrome)，肝胆管疾病诸如肝炎、原发性胆汁性肝 硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎。在一些实施方案中，患者患有心血管系统损伤后的炎 症。多种其他的炎症性疾病包括肺结核和慢性胆囊炎。例如在Harrison' s Principles of Internal Medicine (哈里森内科学)，第 12 版，Wilson, et al.，eds.，McGraw-Hill, Inc.)中也描述了其它慢性炎症疾病。在一些实施方案中，用抗体治疗的患者患有癌症，其 中GM-SCF促进肿瘤或癌症细胞生长，例如急性髓样白血病。在一些实施方案中，用本发明 抗体治疗的患者患有心衰，或具有患心衰的风险，例如由于心血管细胞的缺血损伤，诸如缺 血性心脏病、中风和动脉粥样硬化导致。在一些实施方案中，用本发明的抗体治疗的患者患 有哮喘。在一些实施方案中，用本发明的抗体治疗的患者患有阿尔茨海默氏病。在一些实 施方案中，用本发明的抗体治疗的患者患有骨质减少症，例如骨质疏松症。在一些实施方案 中，用本发明的抗体治疗的患者患有血小板减少性紫癜。在一些实施方案中，患者患有I型 或II型糖尿病。在一些实施方案中，患者可以患有多于一种的以GM-SCF为治疗靶标的疾 病，例如患者可以患有类风湿性关节炎和心衰，或者骨质疏松症和类风湿性关节炎等。本发明的方法包括以治疗有效量给予患者作为药物组合物的抗GM-CSF抗体，所 述方法使用适用于治疗所述疾病的给药方案。可以配制用于多种药物递送系统的组合物。 一种或多种生理学上可接受的赋性剂或载体也可以包括在用于合适制剂的组合物中。用 于本发明的合适的制剂见于Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿氏药物科 学)，第 21 版，Philadelphia, PA.Lippincott Williams&Wilkins，2005。抗GM-CSF抗体以适合注射入患者体内的溶液形式提供，例如用于注射的无菌等 渗水溶液。将抗体以合适的浓度溶解或悬浮在可接受的载体中。在一些实施方案中，所述 载体是水性的，例如，水、盐水、磷酸缓冲盐等。组合物可以包含接近生理条件所需的辅助性 药用物质，诸如PH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等。本发明的药物组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病或疾病的症状及其并发 症的量给予患者，例如患有骨质减少、哮喘、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱 炎、青少年特发性关节炎、多肌炎、系统性红斑狼疮、心衰、心肌损害如心脏病发作后的心 肌损害、血小板减少性紫癜或糖尿病的患者。足以实现这一目的的量定义为“治疗有效剂 量”。通过监测患者对治疗的反应确定治疗有效剂量。指示治疗有销量的典型的参考标准 (benchmark)包括患者疾病症状的减轻。用于这一用途的有效量取决于疾病的严重程度以 及患者总体健康状况，包括诸如年龄、体重、性别、给药途径等其他因素。抗体的单次或多次 给药可以按照患者所需和耐受的剂量及频率给予。在任一情形下，该方法提供了有效地治 疗患者的足够量的抗GM-CSF抗体。抗体可以单独给予，或与其他治疗联合给予，以治疗目的疾病。抗体可以通过经由包括但不限于静脉内、皮下、肌肉内或腹腔内途径的任何适合 途径的注射或输注给药。在一些实施方案中，该抗体可以通过吹入法给药。在示例性的实 施方案中，抗体可以在4°C以10mg/ml储存在无菌等渗注射用盐水溶液 中，并且在给予患者 前，在100ml或200ml 0. 9%的注射用氯化钠中稀释。在1小时的时程以0. 2-10mg/kg的剂 量通过静脉内输注的方式给予抗体。在其他的实施方案中，在15分钟-2小时的时间段，通过静脉内输注的方式给予抗体。在其他的实施方案中，给药操作通过皮下弹丸注射。选择抗体的剂量以便为患者提供有效的治疗，所述剂量为小于0. lmg/kg体重至 约25mg/kg体重的范围，或为lmg-2g/患者的范围。优选地，该剂量为l_10mg/kg或大约 50mg-1000mg/患者的范围。该剂量可以以适当的频率重复，根据抗体的药代动力学(例如， 抗体在循环中的半衰期)和药效反应(例如，抗体疗效的持续时间)，该频率可以为每天一 次至每三个月一次。在一些实施方案中，在体内的半衰期为约7-约25天，以及在每周一次 至每三个月一次重复抗体给药。在其他的实施方案中，大约每月一次给药抗体。本发明的Vh区和/或\区还可以用于诊断目的。例如，Vh区和/或\区可以用 于临床分析，例如检测患者中的GM-CSF水平。本发明的Vh区或\区还可以用于例如生产 抗-Id抗体。
实施例 实施例1.工禾旱化的人杭-GM-CSF V区的鉴定。如公开号为20050255552的美国专利申请中所描述的，进行人工程化。从人V节 段文库序列以及人种系J节段序列构建表位_聚集的文库，该人V节段库序列连接到包含 ⑶RH3和⑶RL3中的BSD序列的⑶R3-FR4区。对于重链，使用人种系JH4序列，以及对于轻 链，使用人种系JK4序列。选择支持与重组人GM-CSF结合的、来自Vhl-限制性文库的全长人工程化的V区。 “全长”V-K文库用作构建如公开号为20060134098的美国专利申请所描述的“盒式”文 库(“cassette” libraries)的基础，其中只有部分鼠科cl9/2V节段最初由人序列文库取 代。构建了两种类型的盒(cassette)。通过框架2区内的交叠共有序列的桥式PCR(bridge PCR)制备V-K链的盒。以这种方式，构建人V-K III同种型的“前端”和“中间”人盒式 文库。支持与GM-CSF结合的人V-κ III盒通过集落转移结合测定(colony-lift binding assay)来鉴定并按照ELISA中的亲和力来排序。将V-κ人“前端”和“中间”盒通过桥式 PCR融合在一起，从而重构支持GM-SCF结合活性的全长人V- κ区。因此人工程化Fabs由 支持与人GM-CSF结合的人工程化V重链和V- κ区组成。通过表面等离子共振技术(spr)分析确定结合活性。生物素化的GM-SCF被捕获 在链霉抗生物素包被的CM5生物传感器芯片上。从大肠杆菌表达的人工程化的Fab片段在 IOmM HEPESU50mM NaCl,0. lmg/mL BSA 和 0. 005% p20 中在 pH 7. 4 时稀释到 30nM 的起始 浓度。利用3倍稀释系列，将每一 Fab稀释4次，每一浓度在37°C下测试两次以确定与不同 密度抗原表面的结合动力学。整体拟合来自所有三个表面的数据以提取解离常数。图1中显示了示例性的人工程化的抗GM-CSF V区。实施例2.人工程化的GM-CSF抗体的评价本实施例评价了人工程化抗GM-CSF抗体在基于细胞的测定中与嵌合的IgGlk抗 体(Ab2)相比的结合活性和生物学效能，所述嵌合的IgGlk抗体具有来自小鼠抗体LMM102 的可变区(Nice et al,Growth Factors (生长因子)，3 159，1990)。Abl 是抗 GM-CSF 的人 工程化IgGlk抗体，与Ab2具有相同的恒定区。人GM-CSF与Abl和Ab2结合的表面等离子共振分析利用Biacore 3000仪器，表面等离子共振分析用于比较Abl和Ab2与糖基化的人GM-CSF相互作用的结合动力学和单价亲和力。利用多克隆抗人F(ab' )2，将Abl或Ab2捕 获到Biacore芯片表面。人293细胞表达的糖基化重组人GM-CSF用作分析物。在2次独 立实验中确定动力学常数(参见，图2和表1)。结果表明，在该实验中，GM-CSF以可比较的 单价亲和力与Ab2和Abl结合。然而，Abl具有比Ab2低2倍的“结合速率(on-rate) ”，但 “解离速率(off-rate)，，比Ab2低约3倍。表1 图2中由表面等离子共振分析确定的37°C的动力学常数，显示了结合常数 00、解离常数(kd)和计算的亲和力(KD)。
权利要求
1.抗GM-CSF抗体，包含Vh区，其包含⑶R3结合特异性决定簇RQRFPY或RDRFPY、J节段和V节段，其中所述J 节段包含与人JH4(YFDYWGQGTLVTVSS)至少95%的一致性，以及所述V节段包含与人种系 VHl 1-02或VHl 1-03序列至少90%的一致性；或者Vh区，其包含⑶R3结合特异性决定簇RQRFPY。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述J节段包含YFDYWGQGTLVTVSS。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述⑶R3包含RQRFPYYFDY或 RDRFPYYFDY。
4.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述Vh区⑶Rl是人种系VHl⑶Rl;所 述Vh区⑶R2是人种系VHl⑶R2 ；或者⑶Rl和⑶R2两者都来自人种系VHl序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含图1所列的Vh区中显示的 Vh CDRl，或者 Vh CDR2,或者 Vh CDRl 和 Vh CDR2 两者。
6.如前述权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述Vh区CDRl具有序列NYYIH或 GYYMH。
7.如前述权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述CDR2具有序列 WINAGNGNTKYSQKFQG 或 WINPNSGGTNYAQFKQG。
8.如前述权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述Vh区CDRl具有序列NYYIH或 GYYMH ；以及所述 Vh 区 CDR2 具有序列 WINAGNGNTKYSQKFQG 或 WINPNSGGTNYAQFKQG。
9.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述V节段序列具有图1所示的VhV节 段序列。
10.如权利要求9所述的抗体，其中所述Vh具有图1所示的VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或 VH#5序列。
11.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含\区，所述\区包含具 有氨基酸序列FNK或FNR的CDR3。
12.如权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含人种系JK4区。
13.如权利要求11或权利要求12所述的抗体，其中所述\区CDR3包含QQFN(K/R) SPLT。
14.如权利要求13所述的抗体，其中所述\区⑶R3包含QQFNKSPLT。
15.如权利要求11至14中任一项所述的抗体，其中所述\区包含图1所示的序列\ 区的⑶Rl或⑶R2，或者⑶Rl和⑶R2两者。
16.如权利要求15所述的抗体，其中所述\区CDRl具有序列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)A。
17.如权利要求15所述的抗体，其中所述\区⑶R2具有序列STSSRAT。
18.如权利要求15所述的抗体，其中所述\区CDRl具有序列RASQS(V/I)G(T/S)N(V/ L)A ；以及所述Vl区CDR2具有序列STSSRAT。
19.如权利要求11-18中任一项所述的抗体，其中所述\区包含与图1所示的 VKIIIA27V节段序列具有至少95% —致性的V节段。
20.如权利要求19所述的抗体，其中所述\区具有图1所示的VK#1，VK#2,VK#3或 VK#4序列。
21.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG。
22.如权利要求21所述的抗体，其中所述抗体包含具有SEQID N0:11中所示的氨基 酸序列的重链恒定区。
23.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含具有SEQID N0:10中所 示的氨基酸序列的κ轻链恒定区。
24.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述Vh区或\区，或者Vh和\区两者 的氨基酸序列在N-末端包含甲硫氨酸。
25.抗GM-CSF抗体，包含Vl区，其包含CDR3，所述CDR3包含QQFNKSPLT。
26.如权利要求25所述的抗体，其中所述Vh区或\区，或者所述Vh和\区两者的氨 基酸序列在N-末端包含甲硫氨酸。
27.抗体，其包含图1所示的Vh区和图1所示的八区。
28.如权利要求27所述的抗体，其中所述抗体是IgG。
29.如权利要求27或权利要求28所述的抗体，其中所述抗体包含具有SEQID NO=Il 中所示的氨基酸序列的重链恒定区。
30.如权利要求27-29中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含具有SEQID N0:10中 所示的氨基酸序列的κ轻链恒定区。
31.如权利要求27所述的抗体，其中所述抗体具有 SEQ ID NO 11中所示的重链恒定区；SEQ ID NO 10中所示的轻链κ恒定区；以及选自图 1 所示的 a)VH#2, VK#3 ；b)VH#l, VK#3 ；c)VH#3, VK#1 ；d)VH#4, VL#3 ；e)VH#4, VK#4 ；f) VH#4, VK#2 ；g) VH#5, VK#1 ；h) VH#5, VK#2 ； i)VH#3, VK#4 禾口 j)VH#3, VL#3 的重链和轻链可变区组合。
32.治疗患者的方法，所述患者患有其中GM-CSF是治疗靶标的疾病，所述方法包括给 予所述患者治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的抗体。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述疾病是骨质减少症、类风湿性关节炎、哮喘、 多发性硬化、银屑病、慢性阻塞性肺疾病、特发性血小板减少性紫癜、心衰、缺血事件导致的 心肌损害、或者糖尿病。
全文摘要
本发明涉及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的高亲和力抗体，其被给予人类以治疗疾病时具有降低的免疫原性，以及涉及使用这种抗体的方法。
文档编号C07K16/22GK102037016SQ200980118423
公开日2011年4月27日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年4月28日
发明者克里斯托弗·R·贝炳东, 杰弗里·T·亚兰东, 肯尼思·鲁尔森 申请人:卡罗拜奥斯制药公司