利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路。
【背景技术】
[0002] 合成的基因线路经过精屯、设计，依据功能将基因调控装置组装起来，感受、整合、 处理细胞内的分子信息，行使一定的功能。各种合成基因线路已发展在细胞内实现可定制、 可编程的功能，包括动态行为、开关和记忆、细胞间通讯、适应性、细胞极化、数字和模拟计 算和复杂的生物合成途径。该些基因线路中大多数是通过使用有限的基因元件和昂贵、低 效的"尝试-错误"的方法构建。因此，为了简化设计和优化对活体细胞进行复杂的操作， 研发出一个大规模的、功能定义良好的合成基因元件库和相应的计算模型和模拟方法是很 有必要的。
[0003] 在针对哺乳动物的合成生物学研究领域，工程化的合成转录激活子和抑制子是 支持可扩展的基因线路设计的一个重要的目标。目前，构建哺乳动物/真核生物转录抑 制子常用的策略是融合一个转录抑制结构域和一个工程化的DNA结合蛋白结构域，比如 锋指蛋白、转录激活子类似因子（TAL巧蛋白和失活的Cas9(dCas9)核酸酶在RNA引导的 CRISPR(簇状周期性间隔短回文重复序列）系统。然而，转录抑制结构域，如Kr化pel相关 盒化RAB)转录抑制结构域和mSin相互作用结构域（SID4)通常会导致祀启动子附近的表 观遗传学修饰，因而响应时间很慢。因此，该种转录抑制不适用于构建响应快速、可逆的基 因线路。
[0004] 另一种普遍存在于原核生物中的转录抑制模式是通过无功能结构域的空间位阻， 而该在真核生物中并不常见，例如，Lac抑制子（LacI)和四环素抑制子（TetR)通过低聚化 结合在启动子附近的特异DNA序列，使DNA形成一个环，从而阻止转录起始核屯、元件在启动 子区域的结合）。已有研究表明，在哺乳动物基因调控的环境下，在合成基因线路中把LacI 结合位点放置在巨细胞病毒启动子（CMV)或者CAG启动子下游，可W抑制基因表达，虽然抑 制效率在哺乳动物表达系统中低于原核表达系统。类似的，在哺乳动物系统中祀as9蛋白 不融合任何转录抑制结构域也表现出弱的转录抑制功能。
[0005] TALER蛋白由若干个特异性识别DNA的串联"蛋白模块"和两侧的N-末端及C-末 端序列组成。每个"蛋白模块"包含33-35个氨基酸残基，第12、13位氨基酸残基是祀向识 别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基（RVDs)位点。TALER蛋白上的每个RVD 仅能识别一个碱基。TALEN("Transcription Activator-Uke Effector Nuclease)是一种 人工改造的限制性内切酶，是将TAL邸蛋白（作为DM结合域）与限制性内切酶化k I (作 为DNA切割域，又称抑制结构域）融合而得到的TALEN融合蛋白。TALEN在细胞中与基因组 的祀位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA 断裂值SB，Double-Strand化eaks)，从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可W通过非同源性 末端接合机制（N肥J, Non-homologous化d化ining)修复DNA。畑EJ修复机制并不精确， 极易发生错误（缺失/插入），从而造成移码突变，因此可w达到基因敲除的目的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基 因线路。
[0007] 本发明保护的第一种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下（a)或化）；
[000引 （a)包括表达盒甲-I、表达盒己-I和表达盒丙的试剂盒；
[0009] 化）包括具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒己-I的重组 载体己-I和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
[0010] 所述表达盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子甲、通过自剪切多肤的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、 祀序列甲-I ;所述祀序列甲-I包括1个W上（具体可为4个）shRNAl的祀序列；
[0011] 所述表达盒己-I自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子己、通过自剪切多肤的编码基因连接的蛋白己的编码基因和TALm?蛋白己的编码基因、 祀序列己-I ;所述祀序列己-I包括1个W上（具体可为4个）shRNA2的祀序列；
[0012] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALm?蛋 白己的祀点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALm?蛋白己的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白己的祀点；
[0013] 所述表达盒己-I中，所述启动子己的上游和下游各具有至少一个所述TALm?蛋 白甲的祀点，或，所述启动子己的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的祀点；
[0014] 所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达。
[0015] 将具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒己-I的重组载体 己-I和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNAl或shRNA2调控 所述蛋白甲的表达和所述蛋白己的表达。
[0016] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALm?蛋白己的祀点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白己的祀点；
[0017] 所述表达盒己-I中，所述启动子己的上游具有1个所述TALm?蛋白甲的祀点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的祀点。
[0018] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲上游的TAL邸蛋白己的祀点与所述启动子甲 下游最邻近的TALm?蛋白己的祀点之间的距离为72-lOObp ;
[0019] 所述表达盒己-I中，所述启动子己上游的TALm?蛋白甲的祀点与所述启动子己 下游最邻近的TALm?蛋白甲的祀点之间的距离为72-lOObp。
[0020] 本发明保护的第二种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下（a)或化）；
[002U (a)包括表达盒甲-I、表达盒己-I和表达盒丙的试剂盒；
[0022] 化）包括具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒己-I的重组 载体己-I和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
[0023] 所述表达盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子甲、通过自剪切多肤的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、 祀序列甲-I ;所述祀序列甲-I包括shRNAl-1的祀序列、……、shRNAl-n的祀序列，n为 2W上的自然数；
[0024] 所述表达盒己-I自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子己、通过自剪切多肤的编码基因连接的蛋白己的编码基因和TALm?蛋白己的编码基因、 祀序列己-I ;所述祀序列己-I包括shRNA2-l的祀序列、……、shRNA2-n的祀序列，n为 2W上的自然数；
[0025] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TAL邸蛋 白己的祀点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALm?蛋白己的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白己的祀点；
[0026] 所述表达盒己-I中，所述启动子己的上游和下游各具有至少一个所述TAL邸蛋 白甲的祀点，或，所述启动子己的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的祀点；
[0027] 所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达。
[002引将具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒己-I的重组载 体己-I和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNAl-1、……、 shRNAl-n、shRNA2-l、......或shRNA2-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白己的表达。
[0029] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游具有1个所述TAL邸蛋白己的祀点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白己的祀点；
[0030] 所述表达盒己-I中，所述启动子己的上游具有1个所述TAL邸蛋白甲的祀点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的祀点。
[0031] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲上游的TALm?蛋白己的祀点与所述启动子甲 下游最邻近的TALm?蛋白己的祀点之间的距离为72-lOObp ;
[0032] 所述表达盒己-I中，所述启动子己上游的TALER蛋白甲的祀点与所述启动子己 下游最邻近的TALm?蛋白甲的祀点之间的距离为72-lOObp。
[0033] 本发明保护的第S种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下（a)或化）；
[0034] (a)包括表达盒甲-I、表达盒己-I、表达盒丙和表达盒了 - I的试剂盒；
[0035] 化）包括具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒己-I的重组 载体己-I、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒了- I的重组载体了- I 的试剂盒；
[0036] 所述表达盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子甲、通过自剪切多肤的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、 祀序列甲-I ;所述祀序列甲-I包括shRNAl-1的祀序列、……、shRNAl-n的祀序列，n为 2W上的自然数；
[0037] 所述表达盒己-I自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子己、通过自剪切多肤的编码基因连接的蛋白己的编码基因和TALm?蛋白己的编码基因、 祀序列己-I ;所述祀序列己-I包括shRNA2-l的祀序列、……、shRNA2-n的祀序列，n为 2W上的自然数；
[003引所述表达盒了 - I自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子了、通过自剪切多肤的编码基因连接的蛋白己的编码基因和TALm?蛋白己的编码基因、 祀序列了；所述祀序列了 - I包括shRNA3-l的祀序列、……、shRNA3-n的祀序列，n为2 W 上的自然数；
[0039] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TAL邸蛋 白己的祀点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALm?蛋白己的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白己的祀点；
[0040] 所述表达盒己-I中，所述启动子己的上游和下游各具有至少一个所述TALm?蛋 白甲的祀点，或，所述启动子己的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的祀点；
[0041] 所述表达盒了 - I中，所述启动子了的上游和下游各具有至少一个所述TALm?蛋 白甲的祀点，或，所述启动子了的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的祀点；
[0042] 所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达。
[0043] 将具有所述表达盒甲-I的重组载体甲-I、具有所述表达盒己-I的重组载体 己-I、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒了- I的重组载体了- I导入 宿主细胞，通过加入 shRNAl-1、......、shRNAl-n、shRNA2-l、......、shRNA2-n、shRNA3-l、...... 或shRNA3-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白己的表达。
[0044] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALm?蛋白己的祀点且 其下游具有1-3个所述TALm?蛋白己的祀点；
[0045] 所述表达盒己-I中，所述启动子己的上游具有1个所述TALm?蛋白甲的祀点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的祀点；
[0046] 所述表达盒了 - I中，所述启动子了的上游具有1个所述TALm?蛋白甲的祀点且 其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的祀点。
[0047] 所述表达盒甲-I中，所述启动子甲上游的TAL邸蛋白己的祀点与所述启动子甲 下游最邻近的TALER蛋白己的祀点之间的距离为72-lOObp ;
[0048] 所述表达盒己-I中，所述启动子己上游的TALm?蛋白甲的祀点与所述启动子己 下游最邻近的TALm?蛋白甲的祀点之间的距离为72-lOObp ;
[0049] 所述表达盒了 - I中，所述启动子了上游的TALm?蛋白甲的祀点与所述启动子了 下游最邻近的TALm?蛋白甲的祀点之间的距离为72-lOObp。
[0050] 本发明保护的第一种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞己的试剂盒，为如下 姑或化）；
[0化1] (a)包括表达盒甲-II、表达盒己-II和表达盒丙的试剂盒；
[0052] 化）包括具有所述表达盒甲-II的重组载体甲-II、具有所述表达盒己-II的重组 载体己-II和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
[0化3] 所述表达盒甲-II自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子甲、通过自剪切多肤的编码基因连接的巧光蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基 因、祀序列甲-II ;所述祀序列甲-II包括1个W上（具体可为4个）miRNAl的祀序列；
[0化4] 所述表达盒己-II自上游至下游依次包括如下元件；反馈元件的编码序列、启动 子己、通过自剪切多肤的编码基因连接的巧光蛋白己的编码基因和TALm?蛋白己的编码基 因、祀序列己-II ;所述祀序列己-II包括1个W上（具体可为4个）miRNA2的祀序列； [0化5] 所述表达盒甲-II中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALm?蛋 白己的祀点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALm?蛋白己的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白己的祀点；
[0化6] 所述表达盒己-II中，所述启动子己的上游和下游各具有至少一个所述TALm?蛋 白甲的祀点，或，所述启动子己的上游不具有所述TALm?蛋白甲的祀点但其下游具有至少 一个所述TALER蛋白甲的祀点；
[0化7] 所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
[0化引所述miRNAl为所述细胞甲具有的特定miR