专利名称：：使用非哺乳动物dna病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的制作方法发明的背景本发明涉及使用非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因。目前用于在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法包括使用哺乳动物病毒载体，例如衍生于逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、或腺相关病毒的载体。在哺乳动物细胞中表达外源基因的其他方法包括直接注射DNA，使用配体-DNA结合物、使用腺病毒-配体-DNA结合物、磷酸钙沉淀，以及利用脂质体-或聚阳离子-DNA复合物等方法。在某些情况下，脂质体-或聚阳离子-DNA能够将外源基因靶向特定类型的组织，例如肝组织。某些将基因靶向肝细胞的方法利用了存在于肝细胞表面上的脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受体(ASGP-R)(Spiessetal.，1990，Biochem.2910009-10018)。ASGP-R是对糖蛋白的末端半乳糖残基有亲和性的凝集素。在这些情况下，当DNA复合物与细胞表面上的ASGP-R结合后即被细胞吞入。常用于基因表达(例如基因治疗)方法中的基因的构建一般是基于从已知可感染哺乳动物细胞，并在其中复制的病毒中除去不需要的功能这一原则。例如，常常除去那些参予病毒复制和包装的基因以建立一个非感染的病毒，并加上一个治疗基因。这一原则已被用于从许多类型的动物病毒例如逆转录病毒、腺病毒及疱疹病毒产生基因治疗载体。这种方法也已被用于Sindbis病毒-一种通常感染蚊虫但可在人体内复制，引起皮疹和关节炎综合症的RNA病毒。已使用非哺乳动物病毒在非哺乳动物细胞内表达外源基因。例如，已使用杆状病毒科(通常称为杆状病毒)的病毒在昆虫细胞中表达外源基因。其中一种研究最多的杆状病毒是苜蓿丫纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)。虽然已描述了某些感染甲壳纲昆虫的杆状病毒(Blissard，etal.，1990Ann.Rev.Entomology35127)，但杆状病毒AcMNPV的正常宿主范围只限于鳞翅目昆虫。已报导杆状病毒可进入哺乳动物细胞，并在哺乳动物细胞的核提取物中检测到了杆状病毒DNA(VolkmanandGoldsmith，1983，Appl.andEnviron.Microbio1.451085-1093；CarbonellandMiller，1987，Appl.andEnviron.Microbiol.531412-1417；Bruscaeta1.，1986，Intervirology26207-222；和Tjiaeta1.，1983，virology125107-117)。虽然出现了一篇关于在哺乳动物细胞中杆状病毒介导的基因表达的报导，但后来，作者将表观报导基因活性归因于在长时间保温带有病毒的细胞后，报导基因产物被带入细胞内(Carbonelletal，1985，J.Virol.56153-160；和CarbonellandMiller，1987，Appl.andEnvironMicrobiol.531412-1417)。这些作者报导，当外源基因作为杆状病毒基因组的一部分接近细胞时，外源基因并没有被重新表达。除杆状病毒外，其他科的病毒大多只是在无脊椎动物体内自然地繁殖；表1中列出了其中的一些病毒。基因治疗方法由于在治疗各种疾病中的实用性而得以研究。大多数基因治疗方法包括提供外源基因以克服基因在病人体内表达的不足。设计其他一些基因治疗方法以对抗疾病的影响。还有一些基因治疗方法包括提供反义核酸(例如RNA)以抑制宿主细胞基因(例如致癌基因)的表达或病原体(例如病毒)基因的表达。例如已检验了某些基因治疗方法纠正先天尿素循环错误的能力(如参见Wilsonetal.，1992，J.Biol.Chem.，26711483-11489)。尿素循环是从体内排除氮废物的关键性代谢途径。尿素循环的各步骤主要限于肝脏，而其中前两个步骤都发生在肝线粒体内。在第一个步骤中，在由氨甲酰磷酸合成酶I(CPS-I)催化的反应中合成氨甲酰磷酸。在第二个步骤中，在由鸟氨酸转氨甲酰酶I(OTC)催化的反应中形成瓜氨酸。然后将瓜氨酸转运到胞质并在精氨琥珀酸合成酶(AS)的作用下与天冬氨酸缩合成精氨琥珀酸。在下一个步骤中，精氨琥珀酸裂解酶(ASL)裂解精氨琥珀酸以产生精氨酸和富马酸。在循环的最后步骤中，精氨酸酶将精氨酸转化成鸟氨酸和尿素。缺乏5个参予尿素循环的酶中的任何一个，均导致明显的病理学影响，例如昏睡、食欲差、精神迟钝、昏迷或在新生儿期内死亡(例如参见Emeryetal.，1990，PrinciplesandPracticeofMedicalGenetics，ChurchillLivingstone，NewYork)。OTC缺乏通常表现为在新生儿期内的致死性高氨血昏迷。AS缺乏导致以血液中瓜氨酸含量高为特征的瓜氨酸血症。缺乏ASL可造成精氨琥珀酸尿(ASA)，出现包括严重的新生儿高氨血症和中度精神迟滞在内的各种病理症状。缺乏精氨酸酶导致高精氨酸血症。表现为幼儿期间的进行性痉挛状态和精神迟滞。目前使用的其他肝病疗法包括饮食限制、肝移植及服用精氨酸游离碱、苯甲酸钠和/或苯乙酸钠。发明概要我已发现，可使用携带外源基因表达构建体的非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因。因此，一个方面本发明的特色是，在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法，其包括将基因组携带外源基因的非哺乳动物DNA病毒(本文中也称之为“病毒颗粒”)导入细胞中，并使细胞在得以表达外源基因的条件下生长。第二个方面，本发明的特色是，治疗哺乳动物(例如人或小鼠)的基因缺陷性疾病的方法，包括将治疗有效量的基因组携带外源基因的非哺乳动物DNA病毒导入细胞内，并使细胞在允许外源基因在哺乳动物体内表达的条件下生长。本发明进一步的特色是，治疗哺乳动物肝细胞癌的方法，包括将基因组表达癌症治疗基因(例如肿瘤坏死因子、胸苷激酶、白喉毒素嵌合体及胞嘧啶二胺酶)的非哺乳动物DNA病毒(例如杆状病毒)导入细胞(例如肝细胞)中。一般说来，可使用体内或体外方法将病毒导入细胞内。最好将外源性基因可操作地连接到在癌细胞中有活性，但在其他哺乳动物细胞中无活性的启动子上。例如，甲种胎儿球蛋白启动子在肝癌细胞中和胎儿组织中有活性，但在成熟组织中则无活性。因此，在本发明的这一个方面，优选使用这样的启动子。在本发明各方面中，优选的非哺乳动物DNA病毒都是无脊椎动物病毒。例如，本发明中可使用表1中列出的DNA病毒。无脊椎动物DNA病毒最好是杆状病毒，例如核型多角体病毒，如苜蓿丫纹夜蛾多核型多角体病毒。必要时可对核型多角体病毒进行基因工程改造，以使之缺少功能性多角体基因。可使用闭合形式和芽殖形式的病毒(例如杆状病毒)。表1可用于本发明的非哺乳动物DNA病毒1I.科杆状病毒杆状病毒科亚科闭合的杆状病毒科真杆状病毒属核型多角体病毒(NPV)亚属多核蛋白壳病毒(MNPV)优选的种苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)其他成员枞色卷蛾MNPV(cfMNPV)甘蓝夜蛾MNPV(MbMNPV)OrgyiapsendotsgataMNPV(OpMNPV)和大约400-500种从七个目及甲壳纲昆虫中分离的病毒。1这些病毒列于由澳大利亚堪培拉生物科学研究学校的CorneliaBuchen-Osmond(1991，3)编写的“FifthReportoftheInternatinalCommitteeonTazonomyofViruses”(ICTV)中。这里所列的大多数病毒都可从美国典型培养物保藏中心得到。亚属单核蛋白壳病毒(SNPV)优选的种家蚕单核型多角体病毒(BmSNPV)其他成员玉米夜蛾SNPV(HzSnpv)粉纹夜蛾SNPV(TnSnpv)从七个目及甲壳纲昆虫中分离的相似病毒。属颗粒体病毒(GV)优选的种印度谷螟颗粒体病毒(PiGV)其他成员粉纹夜蛾颗粒体病毒(TnGV)大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV)Artogeiarapae颗粒体病毒(ArGV)苹果小卷蛾颗粒体病毒(CpGV)和得自鳞翅目约50个种的相似病毒亚科非闭合的杆状病毒科裸杆状病毒属非闭合的杆状病毒(NOB)优选的种玉米夜蛾NOB(HzNOB)其他成员Oryctesrhinoceros病毒在真菌(Strongwellseamagma)、蜘蛛、欧洲蟹(Carcinusmaenas)和兰蟹(Callinectessapidus)中观察到的其他病毒。II.科二十面体胞质脱氧病毒虹彩病毒属小虹样虹彩病毒昆虫病毒族优选的种Chilo虹彩病毒其他成员昆虫虹彩病毒1昆虫虹彩病毒2昆虫虹彩病毒6昆虫虹彩病毒9昆虫虹彩病毒10昆虫虹彩病毒16昆虫虹彩病毒17昆虫虹彩病毒18昆虫虹彩病毒19昆虫虹彩病毒20昆虫虹彩病毒21昆虫虹彩病毒22昆虫虹彩病毒23昆虫虹彩病毒24昆虫虹彩病毒25昆虫虹彩病毒26昆虫虹彩病毒27昆虫虹彩病毒28昆虫虹彩病毒29昆虫虹彩病毒30昆虫虹彩病毒31昆虫虹彩病毒32属大虹彩Chloriridovirus昆虫病毒族优选的种蚊虫虹彩样病毒(虹彩样病毒3型，正规毒株)其他成员昆虫虹彩病毒3昆虫虹彩病毒4昆虫虹彩病毒5昆虫虹彩病毒7昆虫虹彩病毒8昆虫虹彩病毒11昆虫虹彩病毒12昆虫虹彩病毒13昆虫虹彩病毒14昆虫虹彩病毒15假定的成员Chironomusplumosusiridescent属蛙病毒族蛙病毒优选的种蛙病毒3(FV3)其他成员蛙病毒1蛙病毒2蛙病毒5蛙病毒6蛙病毒7蛙病毒8蛙病毒9蛙病毒10蛙病毒11蛙病毒12蛙病毒13蛙病毒14蛙病毒15蛙病毒16蛙病毒17蛙病毒18蛙病毒19蛙病毒20蛙病毒21蛙病毒22蛙病毒23蛙病毒24L2L4L5LT1LT2LT3LT4T21T6T7T8T9T10T11T12T13T14T15T16T17T18T19T20来源于newts的蝌蚪水肿病毒来源于Ranacatesbriana的蝌蚪水肿病毒来源于爪蟾的蝌蚪水肿病毒属淋巴细胞静止病病毒族，淋巴细胞静止病毒优选的种Flounder分离物(LCDV-1)其他成员淋巴细胞静止病病毒dab分离物(LCDV-2)假设的成员Octopusvlgaris病病毒属金鱼病毒族优选的种金鱼病毒1(GFV-1)其他成员金鱼病毒2(GF-2)III.科细小病毒属昆虫细小病毒族浓核病毒优选的种蜡螟科浓核病毒其他成员Junonia浓核病毒Agraulis浓核病毒蚕属浓核病毒伊蚊属浓核病毒推测的成员蟋蟀属浓核病毒蚋属浓核病毒杆草螟属浓核病毒切根虫属浓核病毒Leucorrhinia浓核病毒大蠊属浓核病毒粉蝶科浓核病毒Sibine浓核病毒PC84(来自carcinusmediterraneus的细小样病毒)来自penaeidshrimp的肝胰细小样病毒IV.科痘病毒族，痘病毒科亚科脊椎动物的痘病毒脊索动物痘病毒属Molluscum触染性软疣亚族触染痘病毒优选的种Molluscum触染性软疣病毒亚科昆虫的痘病毒昆虫痘病毒推测的属昆虫痘病毒AColeoptera的痘病毒优选的种西方五月鳃角金龟的痘病毒其他成员Coleoptera铜色丽金龟AphodiustasmaniaeDemodemaboranensisDermolepidaalbohirtumFigulussublaevissylvaticus粪金龟推测的属昆虫痘病毒B鳞翅目和直翅目的痘病毒优选的种桑红缘灯蛾(鳞翅目)的痘病毒其它成员鳞翅目巢斑螟属Choristoneurabiennis柳色卷蛾异色卷蛾行军切根虫冬尺蠖蛾直翅目Arphiaconspersa飞蝗属血黑蝗Oedaleussenugalensis沙漠蝗推测的属昆虫病毒C双翅目的痘病毒优选的种Chironomusluridus(双翅目的)的痘病毒其它成员双翅目埃及伊蚊伸展摇蚊细长摇蚊羽摇蚊Goeldichironomusholoprasimus痘病毒科的其他成员信天翁痘病毒(Avipoxvirus)CotiaEmbu狨痘病毒Marsupialpox(Australian‘quokkas’)骡鹿痘病毒(Odocoileushemionus；Capripoxvirus)Volepox(Microtusoeconomus，Microtuspennsylvanicus)Skunkpoxvirus(Mephitismephitis；Orthopoxvirus)V.族花椰菜花叶病毒优选的成员花椰菜花叶病毒(CaMV)(Cabbageb，davis分离物)其他成员Blueberry红环斑病毒(327)Carnationetchedring(182)大丽菊花叶病毒(51)玄参花叶病毒辣根隐潜病毒Mirabilis花叶病毒花生萎黄病划线病毒大豆萎黄病斑驳病毒(331)Strawberryveinbanding(219)蓟斑驳病毒推测的成员Aquiligea坏死花叶病毒Cassavavein花叶病毒Cestrum病毒PetuniaveinclearingPlantago病毒4Sonchus斑驳病毒VI.双粒病毒组亚族(即属)玉米划线病毒优选的成员玉米划线病毒(MSV)(133)其他成员Chlorisstriate花叶病毒(221)Digitaria划线病毒Miscanthus划线病毒白矮病毒推测的成员Bajra划线病毒Bromusstriate花叶病毒Digitariastriate花叶病毒OatchloroticstripePaspalumstriate花叶病毒亚族II(即属)甜菜卷尖病毒优选的成员甜菜卷尖病毒(BCTV)(210)其他成员蕃茄假卷尖病毒菜豆夏季死亡病毒烟草黄矮病毒蕃茄卷叶病毒亚族III(即属)菜豆金色花叶病毒优选的种菜豆金色花叶病毒(BGMNV)(192)其他成员Abutilon花叶病毒，非洲木薯、花叶病毒、棉花叶萎病毒、Euphorbia花叶病毒、Horsegram黄叶病毒、印度木薯花叶病毒、Jatropha花叶病毒、利马豆金色花叶病毒、Mahaceouschlorosis病毒、甜瓜叶卷曲病毒、绿豆黄花叶病毒、马铃薯黄色花叶病毒、Rhynochosia花叶病毒、压片叶卷曲病毒、Tigre病病毒、烟草叶卷曲病毒、蕃茄金色花叶病毒、蕃茄叶卷曲病毒、蕃茄黄矮病毒、蕃茄黄叶卷曲病毒、蕃茄黄色花叶病毒。西瓜卷叶斑驳病毒、西瓜萎黄矮化病毒、蜂吮黄脉花叶病毒推测的成员棉花叶卷曲病毒、Cowpea金色花叶病毒、Eggplant黄色花叶病毒、Eupatorium黄脉病毒、羽扁豆叶卷曲病毒、大豆皱叶病毒、Solanum顶端叶卷曲病毒、Wissadula花叶病毒VII.科双链DNA藻类病毒藻DNA病毒属双链DNA藻病毒藻DNA病毒族优选的种草履虫bursaria小球藻病毒-1(PBCV-1)草履虫bursaria小球藻NC64A病毒(NC64A病毒)草履虫bursaria小球藻Pbi病毒(Pbi病毒)Hydravirdis小球藻病毒(HVCV)其他成员小球藻NC64A病毒(37种NC64A病毒，包括PBCV-1)小球藻病毒NE-8D(CV-NE8D；同义词NE-8D)CV-NYb1CV-CA4BCV-AL1ACV-NY2CCV-NC1DCV-NC1CCV-CA1ACV-CA2ACV-IL2ACV-IL2BCV-IL3ACV-IL3DCV-SC1ACV-SC1BCV-NC1ACV-NE8ACV-AL2CCV-MA1ECV-NY2FCV-CA1DCV-NC1BCV-NYs1CV-IL5-2s1CV-AL2BCV-NA1DCV-NY2BCV-CA4ACV-NY2ACV-XZ3ACV-SH6ACV-BJ2CCV-XZ6ECV-XZ4CCV-XZ5CCV-XZ4A小球藻Pbi病毒CVA-1CVB-1CVG-1CVM-1CVR-1Hydraviridis小球藻病毒HVCV-1HVCV-2HVCV-3VIII.科多DNA病毒族多DNA病毒科属Ichnovirus优选的种Campoletissonorensisvirus(CsV)其他成员Glypta种的病毒属Bracovirus优选的种Cotesiamelanoscela病毒(CmV)可以对非哺乳动物DNA病毒的基因组进行基因工程构建，以使之包含一个或多个基因元件，例如转座因子或逆转录病毒(例如Rous肉瘤病毒)之长末端重复区的启动子；腺伴随病毒的整合末端重复序列；和/或细胞无限增殖序列，如EB病毒(EBV)的EBNA-1基因。必要时，非哺乳动物DNA病毒的基因组可包含在哺乳动物细胞中有功能活性的复制原点(例如EBV复制原点或哺乳动物复制原点)。用于本发明的非哺乳动物DNA病毒的基因组可包含为适当加工外源基因产物而定位的聚腺苷酸化信号和RNA剪接信号。此外，可对病毒进行基因工程发行以使之编码为适当导向基因产物所需的信号序列。如果需要进行外源基因的细胞类型特异性表达，可以使病毒的基因组中包含有细胞类型特异性启动子，例如肝细胞特异性启动子。肝细胞特异性启动子例如可包括编码白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、丙酮酸激酶、磷酸苯酚丙酮酸羧激酶(Phosphenolpyncvatecarboxykinase)、运铁蛋白、甲状腺素运载蛋白、甲肿胎儿球蛋白、α-血纤蛋白原或β-血纤蛋白原。或者，也可使用乙型肝炎启动子。必要时可将乙肝增强子与乙肝启动子联合使用。较好使用白蛋白启动子。当利用本发明表达用于治疗肝细胞癌的基因产物时，最好使用甲胎蛋白启动子来驱动外源基因的表达。其他优选的肝特异性启动子包括编码低密度脂蛋白受体、α2-巨球蛋白、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-HS-糖蛋白、触珠蛋白、血桨铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体蛋白质(C1q、CIr、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C9、补体因子I和因子H)、C3补体激活剂、β-脂蛋白及α1-酸性糖蛋白，几乎任何哺乳动物细胞均可用于本发明的方法中，但较好的哺乳动物细胞是人细胞。细胞可以是原代细胞，或者是已建立之细胞系的细胞。必要时，可在铺敷原代细胞后约24小时将病毒导入原代细胞，以获得最大感染效率。哺乳动物细胞较好是肝细胞，例如HepG2细胞或原代肝细胞；肾细胞系293的细胞；或PC12细胞(例如由神经生长因子诱导分化的PC12细胞)。其他优选的哺乳动物细胞是那些具有脱唾液酸糖蛋白受体的细胞。另外一些优选的哺乳动物细胞包括HIH3T3细胞、Hela细胞、COS7细胞及C2C12细胞。可经体外或体内方法将病毒导入细胞内。在于体外将病毒导入细胞的情况下，必要时可以继后再将该细胞导入哺乳动物体内(例如导入门静脉或脾脏中)。因此，可于体外、体内、或相继于体外和体内使细胞生存或生长，以实现外源基因的表达。相似地，如利用本发明在一个以上细胞内表达外源基因，可以联合使用体外和体内方法；以将基因导入一个以上的哺乳动物细胞内。必要时，可以给携带这些细胞的哺乳动物投用病毒，以将病毒导入细胞内。例如，可通过静脉内或腹腔内途径给这样的哺乳动物投用病毒。如需要的话，可以使用缓慢释放装置，例如可植入的原以利于将病毒输送到细胞内。当将病毒投用于携带将要导入病毒之细胞的哺乳动物时，可以通过调整将投用于哺乳动物之病毒的量或控制输送方法来定向导入细胞。例如，可以使用将病毒经血管内注入门静脉或肝动脉的方法将病毒定位导向肝细胞。在另一种方法中，可以将病毒投用于供体个体的细胞或器官内，然后再将细胞或器官移植到受体内。当使细胞在体外条件下生存时，可以使用常规的组织培养条件和方法。在一优选的方法中，可使细胞生长于含有胶原蛋白例如I型胶原蛋白或大鼠尾(rattail)胶原蛋白基质上，或者是含有层粘连蛋白的基质上。这些基质的可植入制品也适用于本发明(例如参见Hubbelletal.，1995，Bio/Technology13565-576和LangerandVacanti，1993，Science260920-925)。作为允许细胞在体外条件下生存的可代用方法或附加方法，也可以使细胞在体内条件(例如在人体内)存活。可使用各种外源基因编码例如蛋白质、反义核酸(如RNA)或催化RNA等基因产物。必要时可以从细胞中纯化基因产物(例如蛋白质或RNA)。因此，可以使用本发明的方法制造在生物学及医药学领域中有用的各种各样的蛋白质。本发明也可用于治疗基因缺陷性疾病，并且特别适于表达的基因包括那些在将被感染之细胞类型的正常细胞中表达，但在将被感染的特定细胞中则以低于正常水平表达的基因。特别有用的基因产物包括氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酰琥珀酸合成酶、精氨酰琥珀酸裂解酶及精氨酸酶。其他可望得到的基因产物包括富马酰乙酰乙酸、水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1-抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氢酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β合成酶、分支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰COA羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶(也称为P蛋白)、H蛋白、T蛋白、Menkes病蛋白以及Wilson氏病基因PWD的产物。其他可望表达的基因包括编码肿瘤抑制物(例如p53)、胰岛素或cFTR(例如用于治疗本性纤维变性)的基因。本发明的治疗有用性不只限于纠正基因表达的缺陷。如果使用本发明表达反义RNA，优选的反义RNA是与哺乳动物细胞之病原体(例如病毒细菌或真菌)的核酸互补的。例如，可将本发明用于表达与基本肝炎病毒基因产物之mRNA(例如聚合酶mRNA)杂交的反义RNA，以治疗肝炎感染。其他优选的反义RNA包括那些与细胞中天然存在之基因互补的，但其基因能够以不期望地高水平表达的RNA。例如，可以设计-反义RNA以抑制哺乳动物细胞中之癌基因的表达。同样，可以使用病毒来表达催化RNA(即核酶)，其通过水解靶向基因产物的mRNA来抑制靶基因在细胞中的表达。可利用常规标准设计反义RNA和催化RNA。“非哺乳动物”DNA病毒是指具有DNA基因组(而不是RNA)，并且在无脊椎动物体内，特别是哺乳动物细胞中没有天然复制能力的病毒。其中包括昆虫病毒(如杆状病毒)、鸟病毒、植物病毒及真菌病毒。不包括能够在原核细胞中天然复制的病毒。表1中列出了可用于本发明实践中的病毒的例子。“昆虫”DNA病毒是指具有DNA基因组并能够在昆虫细胞中复制的病毒(例如杆状病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科、多DNA病毒科、浓核病毒科、花椰菜花叶病毒科及藻DNA病毒科)。“为表达定位的”是指包括外源基因在内的DNA分子被定位于指导转录，以及必要时也指定DNA和RNA翻译之DNA序列的相邻位置(即有利于外源基因产物或RNA分子的产生)。“启动子”是指足以指导转录的最小序列。另外，可用于本发明的启动子还有那些足以使启动子依赖性基因得以可控制地细胞类型特异性、细胞周期特异性或组织特异性(例如肝特异性)表达的启动子，以及那些可被外部信号或试剂诱导的启动子；这样的元件可定位于天然基因的5′或3′区域中。“可操作地连接的”是指基因和调节序列(例如启动子)以一种当适当的分子(例如转录激活剂蛋白)被连接到调节序列上时即可允许基因表达的方式相连接。“外源性”基因或启动子是指非哺乳动物DNA病毒(如杆状病毒)基因组之非正常部分的任何基因或启动子。这样的基因包括天然存在于被感染之哺乳动物细胞中的基因；还包括非正常存在于被感染之哺乳动物细胞中的基因(例如其他细胞或种的相关和非相关基因)。“细胞无限增殖序列”是指一种核酸，当其存在于细胞内时能够转化细胞以延长对衰老的抑制作用。这样的序列包括SV40T抗原、c-myc，端粒酶及EIA。本发明用于在哺乳动物细胞(如HepG2细胞)中表达外源基因。该方法可用于制造有待纯化的蛋白质，例如药用蛋白质(如胰岛素)。本发明也可在治疗上应用。例如，本发明可用于在病人体内表达编码某种能纠正基因表达上有缺陷之蛋白质的基因。在其他可代用的治疗方法中，可使用本发明的方法在细胞中表达任何蛋白质、反义RNA或催化RNA。本发明的非哺乳动物病毒表达系统具有几个方面的优点。本发明允许从头表达外源基因；因此，检测被感染细胞中的外源蛋白质(如β半乳糖苷酶)即代表被感染细胞中天然合成的蛋白质，因为其正与连同病毒异常携带的蛋白质相反。用于本发明的非哺乳动物病毒不是人的天然病原体；因此，有关这些病毒的安全性操作方面的问题是极小的。同样，因为大多数天然存在的病毒启动子在哺乳动物细胞中一般是无活性的，所以抑制了不需要之病毒蛋白质的产生。例如，基于PCR的实验表明，某些病毒晚期基因未被表达。因此，与某些基于哺乳动物病毒的基因疗法相反，本发明的基于非哺乳动物病毒的方法不会引发宿主对病毒蛋白基的反应。此外，在无血清培养基中非哺乳动物病毒可随着细胞生长而增殖，所以免除了存在于污染病毒之血清制品中之感染因子的危险。再者，使用无血清培养基排除了哺乳动物病毒使用者所面临的过多花费。某些非哺乳动物病毒例如杆状病毒可以生长到很高的浓度(即108pfu/ml)。一般说来，病毒基因都较大(例如杆状病毒基因组为130kbp)；因此，用于本发明的病毒可接受较大的非源DNA分子。在某些实施方案中，本发明利用那些其基因组不经过了工程化改造从而含有外源性复制原点(例如EBVorip.)的病毒。病毒基因组中存在这些的序列可使病毒能进行游离型复制，从而提高其中细胞中的持久性。当本发明用于制造有待从细胞中纯化的蛋白质时，其优点在于其可利用哺乳动物表达系统。因此，可望对基因产物进行适当的翻译后加工和修饰(如糖基化)。可从下文对本发明优选实施方案的描述中，以及从权利要求中进一步了解本发明的特征和优点。发明的详细描述首先对附图作如下说明。图1是图解显示AcMNPVRSV-lacZ转移质粒Z4。图2是对闭合的AcMNPVRSV-lacZ转移质粒的图解说明。图3是对游离型转移质粒Z-EBV#1-一种杆状病毒和EB病毒序列的嵌合体-的图解说明。用该转移质粒产生的病毒能够在细胞中复制。图4A是图解显示可允许切割基因盒的转移质粒。图4B是图解显示被图4A的转移质粒切掉的基因盒。对基因盒的切割是由cre-lox重组介导的。这一方案得以在没有病毒序列的情况下持续保留外源基因。图5是图解说明转移质粒pBV-AVneo，即杆状病毒和腺伴随病毒序列的嵌合体。图6A是用含有RSV-LacZ基因盒的AcMNPV病毒感染后一天，用X-gal染色之细胞的图谱。表达lacZ基因的细胞被X-gal染成暗色。图6A是以感染复数15感染之HepG2细胞的典型视野照片。图6B是以125的感染复数感染之HepG2细胞的典型视野的照片；25％以上的细胞着染。图6C是以125的感染复数感染之Sk-Hep-1细胞的典型视域，其中未显示阳性着染的细胞。图6D是以125的感染复数感染之Sk-Hep-1细胞的不太典型的视野，其中显示出阳性着染细胞。Bar＝55μm。图7是在杆状病毒介导的基因转移到大鼠肝细胞的初级培养物中之后所得细胞的照片。70％以上的细胞被染成兰色。图8是展示杆状病毒介导之基因转移的剂量依赖性的图形。其中将106个HepG2细胞接种到60mm平皿中，一天后使细胞暴露于指定剂量的含RSV-lacZ盒的AcMNPV病毒(病毒溶度为1.4×109pfu/ml)。感染后一天收获细胞，制备提取物并检测β半乳糖苷酶活性。提取物活性以从前定义的β半乳糖苷酶活性单位数表示(NortonandCoffin，1985，Mol.Cell.Biol.5281-290)。就每种提取物的蛋白质含量校正酶活性。每个点均为三次独立试验的平均值，并加减标准差。图9是图解显示在杆状病毒介导的表达过程中，于不同时间点上获得的结果。在时间0时用含有RSV-lacZ盒的AcMNPV病毒感染HepG2细胞(感染复数＝15)。1小时后，除去含有病毒的培养基并换成新鲜培养基。在指出的时间点收获被感染的细胞，并按上述方法检测β半乳糖苷酶活性。各个作图点均以三次独立试验的平均值并加减标准差来表示。感染后12-24小时病毒中的表达量达到峰值，此后当规范为总细胞蛋白质时表达量开始下降。I.病毒的基因操作与常规基因表达方法相反，本发明是关于修饰那些正常情况下不感染哺乳动物细胞，而且不在其复制的非哺乳动物DNA病毒。因此，本发明是基于在非哺乳动物DNA病毒中加入新的性质，以允许其将基因转输到哺乳动物细胞内，而相反的常规基因治疗载体则是基于从病毒中去除某些功能这一原则。本方法中，病毒颗粒起到将DNA输送到哺乳动物细胞内之“壳”的作用。对病毒DNA进行改造以使之含有在哺乳动物细胞内有活的转录控制信号，从而使感兴趣的基因得以表达。可使用常规重组DNA技术来插入这样的序列。因为用于本发明的非哺乳动物DNA病毒不能在哺乳动物细胞中复制，所以不必删除其基本病毒功能以使之成为有缺陷的病毒。因为无脊椎动物和哺乳动物中核定位信号功能的相似性，所以最好将用本发明之病毒的基因组转输到其天然宿主的核内。病毒衣壳或被膜最好含有一个与哺乳动物细胞结合以利于其进入细胞的配体。在无脊椎动物种(例如昆虫)中增殖的病毒正常情况下不能用唾液酸终止糖蛋白序列。因此病毒配体通常是与哺乳动物凝集素(如肝脱唾液酸糖蛋白受体)结合的脱唾液酸糖蛋白，以有利于其进入哺乳动物细胞。另外，也可以用标准方法(例如就VSV-G包被蛋白进行假分型)修饰病毒颗粒，以使之结合并进入哺乳动物细胞。例如，非哺乳动物病毒可含有病毒颗粒蛋白(如AcMNPV的糖蛋白gpG4)，其有利于病毒被膜与哺乳动物细胞膜的融合，从而可使病毒颗粒进入胞质溶胶中。此外，病毒最好能在真核细胞中天然复制。表1中列出了本发明中可进行基因工程改造以用来表达外源基因之病毒的例子。可将操作重组病毒的已确立的方法并入这些在哺乳动物细胞骨表达外源基因的新方法中。例如，可从病毒中删除病毒基因并反过来通过包装系提供之。可望删除这些基因，以便(1)抑制可引发免疫反应之病毒基因产物的表达，(2)在病毒载体中提供另外的空间，或(3)提供使病毒保留在细胞内的更大安全性。因为大多数非哺乳动物病毒的启动子在哺乳动物细胞中是无活性的，所以立将外源基因可操作地连接到能指导基因在哺乳动物细胞中表达的启动子上。适用启动子的例子包括RSVLTR、SV40早期启动子、OMCIE启动子、腺病毒主要晚期启动子及乙型肝炎启动子。此外，可使用细胞类型特异性、周期特异性或组织特异性启动子。例如，已描述了几种肝特异性启动子，例如白蛋白启动子/增强子(例如参见Shenetal.，1989，DNA8101-108；Tanetal.，1991，Dev.Biol.14624-37；McGraneetal.，1992，TIBS1740-44；Jonesetal.，J.Biol.Chem.26514684-14690；以及Shimadeetal.，1991，FEBSLetters279198-200)。如用本发明的方法治疗肝细胞癌，甲胎蛋白启动子是特别适用的。该启动子正常情况下只在胎儿组织中有活性；但它在肝癌细胞中也有活性(Huberetal.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.888039-8043)。因此，可使用甲胎蛋白启动子定向表达针对肝癌细胞的肝肿瘤治疗剂。必要时，可改造病毒基因组以使之携带复制原点，从而有利于在哺乳动物细胞中持续保留外源基因。已鉴定了衍生于哺乳动物细胞的复制原点(Burhansetal.，1994，Science263639-640)。在适当的反式作用因子例如EBNA-1存在下，其他复制原点，例如EB病毒orip也可有利于表达的维持。如果需要的话，可对病毒基因组进行基因工程处理使之表达一种以上的外源基因(例如可使之表达OTC和AS)。下文将描述几种可用于本发明的病毒。提供这些实例旨在举例说明，而不是限制本发明的范围。Z4转移质粒的构建使用最初建立的用来在杆状病毒中表达蛋白质的已知重组技术(如参见O’Reillyetal.，1992，InRaculovirusexpressionvectors，W.H.Freeman，NewYork)完成对用于本发明之杆状病毒的基因操作。在此实例中，用一个指导报导基因表达的基因盒隔断病毒的多角体基因。报导基因盒包含相当于可操作地连接到E.colilacZ基因上之Rous肉瘤病毒(RSV)启动子的DNA序列(图1)。该报导基因盒还包含编码猴病毒40(SV40)RNA剪接和聚腺苷酸化信号的序列。用于下文给出的几个实施中的RSV-lacZAcMNPV转移质粒被称为Z4，并可按下述方法构建之。使用BglII和BamHI切掉包含SV40RNA剪接信号及聚腺苷酸化信号之pRSVPL9的847bp片段。经用BglII消化pRSV珠蛋白而从pRSV珠蛋白(Gormanetal.，Science221551-553)衍生得到质粒pRSVPL9，加入HindIII接头，然后用HindIII裂解该DNA。使寡核苷酸5′AGCTGTCGACTCGAGGTACCAGATCTCTAGA3′(SEQIDNO1)与5′AGCTTCTAGAGATCTGGTACCTCGAGTCTAC3′(SEQIDNO2)杂交制成的双股多聚接头连接到带有RSV启动子和SV40剪接及聚腺苷酸化信号的4240bp片段上。所得质粒在珠蛋白序列的位置上有多聚接头。使用常规技术将pRSVPL9的SV40序列克隆到pVL1392(InvitrogenandPharmingen)的BamHI位点中。用BglII和SpeI从pRSVlacZII(Linetal.，1991，Biotechmnoques11344-348，350-351)上切掉RSV-lacZ盒，并插入到pVL/SV40的BglII和XbaI位点中。将Z4转移质粒与线性化的AcMNPVDNA同源重组以制备称为Z4的AcMNPVRSV-lacZ病毒。用于制备该DNA的AcMNPV病毒是AcV-EPA(Hartigetal.，1992，J.Virol.Methods3861-70)。Z5转移质粒的构建某些非哺乳动物病毒(如杆状病毒)可被闭合在蛋白质包含体内，或者可以以芽生形式存在于胞浆膜中。如在本发明中使用闭合的病毒，首先可以从蛋白质包含体中释出病毒。可使用借助于碱的常规方法释出病毒(O’Reillyetal.，1992，InRaculovirusexpressionvectors，W.H.Freeman，NewYork)。闭合的，碱处理后释放的杆状病毒可以比非闭合的芽生病毒更容易被细胞摄入(VolkmanandGoldsmith，1983，ApplandEnviron.Microbiol.451085-1093)。为了构建本发明中使用闭合病毒的Z5转移质粒(图2)，可使用BglII和BamHI从Z4转移质粒中切下RSV-lacZ盒，然后插入到pAcUW1(Weyeretal.，1990，J.Gen.Virol.711525-1534)的BglII位点中。Z-EBV#1转移质粒的构建可对用于本发明的非哺乳动物DNA病毒进行遗传修饰，以使病毒在哺乳动物细胞中进行游离基因型复制。这样的病毒保留时间较长，因而是在细胞内长期表达外源基因的最佳方法。其中一个例子是Z-EBC#1(图3)，其构建程序如下。首先使用EcoRI和XbaI从pREP9(Invitrogen)上切掉EBVoriP和EBNA-1区域，然后在其EcoRI和XbcI位点插入到杆状病毒转移质粒pBacPAK9(Clontech)中，得到pEBCBP9。再用BglII和BamHI从转移质粒Z4上切掉RSV-lacZ盒，并将其插入到pEBVBP9的BamHI位点，得到质粒pZ-EBV#1。Z4loxP的构建Z4loxP病毒基因组是用噬菌体P1cre重组酶进行重组的底物。可使用此病毒按常规方法将携带loxP位点的基因盒插入到病毒中(Pateletal.，1992，Nacl.Acid.Res.2097-104)。可以工程化改变该插入系统，以便从其余的基因表达序列上切掉病毒序列。例如，可以构建自动切割性转移质粒(图4)，以在哺乳动物细胞中表达外源基因。该质粒含有有利于切掉杆状病毒序列的loxP序列。将合成的loxP位点插入到Z4转移质粒中，以构建Z4loxP转移质粒。合成两条loxP寡核苷酸并使之彼此退火。寡核苷酸序列是5′GATCTGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGG3′(SEQIDNO3)和5′GATCCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCA3′(SEQIDNO4)。于0.25MNaCl存在下将寡核苷酸加热到80℃以使之退火，然后将混合物缓慢冷却至室温，并用于连接反应。将已退火的寡核苷酸连接到已用BglII消化的Z4转移质粒上。以标准的克隆技术完成连接和对所得克隆的分析。然后用常规方法产生重组Z4loxP杆状病毒。pBV-AVneo，即AAV嵌合体转移质粒的构建本发明中也可以使用能够整合到宿主细胞之染色体中的杆状病毒基因组。这种整合的病毒可比未整合的病毒较长时间地存在于细胞内。因此，涉及这种病毒的基因表达方法显然需要反复向细胞内投用病毒，从而减少了引发抗病毒免疫反应的可能性。转移质粒pBV-AVneo(图5)包含腺伴随病毒(AAV)之整合性末端重复序列。可从pFasV.neo中切掉BglII-BamHI片段，并将此片段插入到pAVgal的BamHI位点以取代lacZ基因，从而构建成这一转移质粒。用CMV启动子和lacZ基因置换AAV的rev和cap编码序列以构建质粒pAVgal。用PvuI消化称为pAV.neo的所得中间体片段，然后将其插入到pBacPAK9的PacI位点中。必要时，可将可操作地连接到AAVrep基因上的适宜启动子插入到该构建体中(例如在AAVITR和多角体启动子之间)，以有利于切割并重组到基因组中。可插入到该构建体中的rep基因的例子包括rep40、rep52、rep68和rep78。病毒的增殖可以使用常规方法增殖用于本发明的病毒(如参见Burleson，etal.，1992，VirologyALaboratoryManual，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA；Mahy，ed.，1985，VirologyAPracticalApproach，IRLPress，Oxford，UK)。例如，就用于下述实验的杆状病毒来说，可按标准方法对病毒进行噬斑纯化并扩增(如参见O’Reillyetal.，infraandSummersandSmith，1987，Amanualofmethodsforbacalovirusvectorsandinsectcellcultureprocedures，TexasAgriculturelExperimentStationBulletinNo.1555，CollegeStation，Texas)。经在含有10％胎牛血清(FBS)和0.1％PLURONICF-68TM的HinksTNM-FH培养基(JRHBiosciences)中旋转培养来增殖AcMNPV和Sf21细胞。可用SW28转子，以超离心法(24,000rpm，75min)浓缩已扩增的病毒，其中使用27％(w/v)蔗糖溶于5mMNaCl，10mMTris(pH7.5)和10mMEDTA中的27％(w/v)蔗糖垫层。然后将沉淀的病毒在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重新悬浮，并通过0.45μm滤器(Nalgene)除菌过滤。如果需要，病毒也可在超声处理杯中进行超声处理以重新悬浮之。在SF21昆虫细胞上以噬斑测定法来测定AcMNPV溶度。II.外源基因在哺乳动物细胞中的表达几乎所有哺乳动物细胞都是非哺乳动物病毒的潜在的靶细胞，且任何培养的细胞都能被快速测定。细胞的生长可使用常规组织培养方法来培养将被感染的哺乳动物细胞(Freshnerg，1987，CaltureofAnimalCellsAMaunalofCasicTechniques，2nded.，AlanR.Liss，Inc.NewYork，NY)。在下面的例子中，检测Z4杆状病毒感染条件不同细胞的能力。这些细胞包括HepG2、Sk-Hep-1、NIH3T3、Hela、CHO/dhfr-、293、COS、Ramos、Jurkat、HL60、K-562、C2C12成肌细胞、C2C12肌小管，以及神经生长因子分化的PC12细胞。按下述方法培养这些细胞。HepG2和SK-Sep-1细胞培养在含10％FBS的Eagle改良的最小基本培养基中。NIH3T3、Hela、293和COS细胞培养在含10％FBS的DMEM培养基中。CHO/dhfr-细胞培养在含10％FBS的MEM-α培养基中。Ramos、Jurkat、HL60和K-562细胞培养在含10％FBS的RPMI/1640培养基中。HL60细胞在0.5％DMSO和1μm树脂酸(Sigma)的同样培养基中培养可导致其分化。C2C12成肌细胞在含20％FBS的DMEM中增殖，并在含10％马血清的DMEM中培养期间分化成肌小管。PC12细胞在含5％FBS和10％血清的DMEM中增殖，在含10％FBS和5％马血清及100ng/ml神经生长因子的DMEM中培养期间被诱导分化。在用AcMNPV感染的前一天接种细胞，并假定这段时间内细胞以指数生长的情况下，来计算感染复数。细胞的体外感染可使病毒在细胞上吸附0.1～6小时可以完成，较好吸附1～2小时，以完成病毒对哺乳动物细胞的感染。一般来说，感染复数为0.1～100是合适的。感染复数在100～500更好。对相对不感受态细胞来说，感染复数在100～1,000更可取。一般所期望的溶度为10～200pfu/细胞。对于本发明中所用的病毒，可用常规方法来确定溶度，此方法用病毒自然感染的非哺乳动物细胞。如果需要时，可将待感染的哺乳动物细胞培养在含有胶原(如大鼠尾I型胶原)的基质上。基于细胞在胶原包被之平板上培养和感染后的计数，以及与在常规EHS基质上生长之细胞的比较，我发现胶原基质能提高细胞(如肝细胞)被非哺乳动物病毒感染的敏感性，是使用常规EHS基质的10～100倍。可从市场上购得含胶原基质的平板(如Bio-COATTM平板，(CollaborativeResearch)，和大鼠尾胶原(Rattailcollagen)也可从市场上买到(SigmaChemicalandCollabonativeResearch)。在以下所述的体外检测法中，感染的标准条件是利用2×106个细胞和感染复数为15的RSV-lacZAcMNPV。在感染前一天，接种粘附细胞系。使细胞与加于2ml培养基中的病毒接触90分钟，然后除去含病毒培养基，并换成新鲜培养基。用2ml缺少病毒接种物的培养液处理伪感染的细胞。感染和基因表达的检测病毒对细胞的感染和外源基因的表达可以通过标准操作来监测。例如，可通过检测病毒DNA或RNA来检测病毒(如AcMNPV)向细胞的输送。(例如可使用Southern或Northern印迹法，狭缝或点印迹法，或原位杂交，用或不用PCR扩增)。可用分子生物学领域的常规方法制备与病毒核酸杂交的适当探针，调控序列(如启动子)，或外源基因。如用本发明在体内细胞中表达外源基因时，可通过细胞活组织检查来检测病毒对细胞的转染。例如，使用本发明在肝细胞中表达某个基因时，可进行肝细胞活组织检查，并用常规方法来检测肝细胞中的病毒。也可以通过分析这个哺乳动物的细胞或体液(如血清)中对应于此基因的RNA或蛋白质，来检测哺乳动物细胞中外源基因的表达。可用分子生物学家常采用的检测技术(如Northern或Western印迹法、原位杂交、狭缝或点印迹法、PCR扩增SDS-PAGE、免疫染色、RIA和ELISA)来测量基因表达。如果需要，可用报导基因(如lacZ)检测特殊的肝状病毒在确定的组织和细胞中定向表达基因的能力。组织的检测包括(a)在用液氮冰冻的异戊醇中致冷组织；(b)用o.c.T将组织固定在软木上并冰冻；(c)用冰冻切片机上将组织切成10μm切片；(d)干燥切片并用多聚甲醛处理之；(e)用溶于PBS的X-gal(0.5mg/ml)氰化亚铁(35mM)/氰化高铁(35mM)染色，以及(f)用显微镜分析组织。在以下的实例中，我测量了杆状病毒感染14种不同类型哺乳动物细胞的能力。在这个实例中，杆状病毒Z4病毒，是通过Z4转化质粒与线性化AcMNPVDNA同源重组而制备的。被检细胞为HepG2、Sk-Hep-1、NIH3T3、Hela、CHO/dhfr-、293、COS、Ramos、Jurkat、HL60、K-562、C2C12成肌细胞、C2C12肌小管，以及神经生长因子分化的PC12细胞。这些细胞的培养和感染方法如前所述。C2C12和PC12细胞在分化过程中可能已经增加了细胞数，并因此反应了一个较低的感染复数。为了检测被感染之细胞中中报导基因的表达，用标准方法来完成对β-半乳糖苷酶活性的比色分析。(Nortonetal.，1985，Molecular&CellaularBiology，5281-290)。测定β-半乳糖苷酶活性的其他常规方法也能替代此实例中所用的方法。感染后一天制备细胞提取物。细胞单层用PBS洗3次，从平皿上刮下，并经低速离心收集之。将细胞沉淀物重悬于25mMTrispH7.4/0.1mMEDTA中，然后经过3次在液氮中冷冻后再在37℃水浴中熔解循环。然后以14,000×g离心5分钟以澄清提取物。分析β-半乳糖苷酶活性的标准条件是利用0.1ml细胞提取物、0.8mlPM-2缓冲液、0.2ml邻硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖(4ng/ml)的PM-2缓冲液，于37℃反应10分钟(Nortonetal.，1985，Mol.&Cell.Biol.5281-290)加入0.5ml1MNa2CO3以中止反应。在420nm以分光光度法检测已水解之底物的量，并用常规方法计算β-半乳糖苷酶活性(Nortonetal.，1985，Mol&Cell.Biol.5281-290)。这个方法就提取物浓度和时间的线性关系验证该检测法。提取物蛋白浓度用考马斯蓝加蛋白分析法测定(CoomassiePlusProteinassay；Pierce)并用牛血清白蛋白作为标准品，β-半乳糖苷酶活性水平用每mg蛋白质中β-半乳糖苷酶活性单位来表示。如果需要的话，也可使用其他标准的蛋白质检测法。为了用组织染色法测定β-半乳糖苷酶活性，将细胞在含2％(w/v)甲醛-0.2％(V/V)多聚甲醛的PBS中固定5分钟。用PBS洗几次后，用含有0.5mg/mlX-gal(BRL)的PBS染细胞，37℃着染2～4小时。被检验的19个哺乳动物细胞系中，有3个细胞系(HepG2、293和PC12)在暴露于病毒后，其抽提物中较高的β-半乳糖苷酶活性显示出显著的统计学意义(p＜0.05，Student’st检验)(表2)。暴露于RSV-lacZ杆状病毒的人肝癌细胞系HepG2之β-半乳糖苷酶水平模拟感染的对照高80多倍。腺病毒转化的人胚胎肾细胞系293中lacZ报告基因的表达水平比本底高4倍。另外，用神经生长因子诱导分化成神经元样表型的PC12细胞在感染RSC-lacZ病毒后，表现出约2倍高的β-半乳糖苷酶水平。这种不同具有显著的统计学差异(p＝0.019)。通过组织化学染色这种更敏感的分析方法，可在19个暴露于病毒的细胞系中的14个中检测到β-半乳糖苷酶活性。因此，在检测抽提物时某些细胞系不产生具有显著统计学差异的较高水平β-半乳糖苷酶，但事实上用更敏感的X-gal染色方法来检测时，可见这些细胞系能够以低的，但可再现的频率表达β-半乳糖苷酶。这一频率可以因使用较高的感染复数得以提高，以致那些在低感染复数时感染的细胞则似乎不表达基因，但在高感染复数情况下细胞可被染成蓝色。可用这种方式转染的细胞系包括Sk-Hep-1、NIH3T3、Hela、CHO/dhfr-、293、COS和C2C12细胞。另外，可在暴露于病毒的原代人成肌细胞中检测到β-半乳糖苷酶活性。这一发现表明，杆状病毒能够介导基因向原代细胞和相应的已建细胞系(C2C12)转移，说明外源基因在已建立之细胞系中的表达对使用原代细胞获得的结果具有预测价值。也在用病毒处理的Hep3B细胞中检测出β-半乳糖苷酶活性；这些细胞中的表达水平几近于HepG2细胞中检测到的水平。另外，已在暴露于病毒的FTO2B(鼠肝细胞癌)细胞和Hepal-5(人肝细胞癌)细胞发现了β-半乳糖苷酶活性。也可在经过基因工程方法修饰而在细胞表面上表达脱唾液酸糖蛋白受体的NIH3T3细胞中检测到β-半乳糖苷酶活性。这些细胞的表达水平大约是正常NIH3T3细胞中β-半乳糖苷酶水平的2倍。这一观察结果提示，脱唾液酸糖蛋白的受体可用来提高病毒介导之基因转染的敏感性。如在感染后以β-半乳糖苷酶检测法所揭示的，在利用这一感染复数时，Ramos、Jurkat、HL60和K-562细胞系没有表达具有明显统计学差异的高水平β-半乳糖苷酶。基于用其他哺乳动物细胞系获得的结果，在利用高剂量(如感染复数)病毒或较长吸附时间时，可望在那些表观不应性细胞系中检测到β-半乳糖苷酶活性。即使暴露于病毒(体内或体外)的细胞中只有较低百分比的细胞导致外源基因的表达时，本发明也可用于鉴定或证实驱动外源基因表达之启动子的细胞或组织类型特异性(如报导基因，包括氯霉素乙酰转移酶基因、碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因，或绿色荧光蛋白基因)。一旦被鉴定，这样一个启动子即可用于任何常规的基因表达方法中。同样的，只有相对低水平的表达才是对哺乳动物抵抗异源基因产物的免疫反应(如产生抗体)所必需的。因此，本发明的基因表达方法可以通过在哺乳动物细胞中表达某种抗原，而用来制备抗某种优选异源抗原的抗体。这样的抗体本身则可用于纯化异源抗原。也可使用这种基因表达方法在哺乳动物体内引发抗异源抗原的免疫保护反应(如用作疫苗)。另外，本发明可用于从病毒介导的表达细胞无限增殖序列(如SV40T抗原)的细胞来制备永久细胞系。表2.杆状病毒介导的RSV-lacZ报导基因在哺乳动物细胞系中的表达β-半乳糖苷酶活性(单位/mg)(平均值±SD)使用X-gal进行的组织化学染色提供了一种高敏感地检测暴露于被修饰之AcMNPV的细胞中β-半乳糖苷酶表达的方法。当HepG2细胞以感染复数15暴露于被修饰的AcMNPV时，大约有5～10％的细胞被X-gal染色(图6A)。在感染复数为125时，大约有25～50％的细胞被染色(图6B)。暴露于病毒未见有例如核肿胀等不利影响。这些数据证明，如使用足够剂量的病毒将基因转移到HepG2细胞中时，被修饰的AcMNPV是高度有效的。当Sk-Hep-1细胞系以感染复数15暴露于病毒时，没有观察到着染细胞(数据未示出)。虽然大部分Sk-Hep-1细胞以感染复数为125暴露于病毒，也没有染成蓝色(图6C)，但可发现一小部分细胞用这种高剂量病毒处理过后(图6D)被染成深色。这些数据表明那些对相对低感染复数的病毒不感应的细胞，实际上在高感染复数时也能被感染并表达外源基因。在模拟感染的培养物中未发现被感染的细胞(数据未示出)。如根据细胞计数所确定的在Sk-Hep-1细胞系中着染细胞的频率估计在暴露于等剂量被修饰病毒后的HepG2细胞低2,000～4,000倍。可见，由被修饰的AcMNPV证明的细胞类型特异性是相对的而不是绝对的。这些数据还表明，当细胞混合物接触病毒(体外或体内)时，可调整病毒的剂量，使病毒在较低感染复数下也可导向细胞内。在大鼠肝细胞原代培养物中表达外源基因也可以使用非哺乳动物DNA病毒在原代培养的大鼠肝细胞中以高水平表达某种外源基因。在这个实验中，按已述方法将新鲜制备的大鼠肝细胞铺敷在用大鼠尾胶原蛋白包被的平皿上(Rameetal.，1994，Mol.Cell.Biol.145858-5869)。24小时后，更换含感染复数大约为430之RSV-lacZ杆状病毒的新鲜培养基。再过24小时后，固定细胞并用X-gal染色。70％以上的细胞被染成蓝色，表明它们摄入并表达了KSV-lacZDNA盒(图7)。在这个实例中所获得的表达频率高于基因治疗中用传统病毒载体(例如逆转录病毒和单纯疱疹病毒载体)所报导的频率。模拟感染的培养物不包含任何阳性染色的细胞(数据未显示)。可用其它合适的外源基因来代替lacZ基因。另外，也可用其它源于非哺乳动物细胞的原代细胞代替原代大鼠肝细胞。杆状病毒介导之基因转移剂量反应上文提到的组织化学数据表明，增加作用于哺乳动物细胞的病毒量可提高β-半乳糖苷酶的产生量。为了定量杆状病毒介导之基因表达的剂量依赖性，将HepG2细胞暴露于渐增剂量的病毒，并检测β-半乳糖苷酶活性。所产生的酶量与所用病毒接种物的量在一个宽的剂量范围内呈线性关系(图8)。这表明单个病毒颗粒的进入不依赖于其他病毒颗粒的进入。用于该检测法之病毒的最大剂量受病毒原种的溶度和体积的限制，使用较高剂量的病毒并没有观察到表达量的平台。因此，这些数据表明，在本发明实践中可通过调节所用病毒剂量来调整表达水平(即表达外源基因之细胞的百分比率)。杆状病毒介导之基因转移的时相将HepG2细胞暴露于RSV-lacZ杆状病毒1小时，然后在不同时间收集细胞并定量检测β-半乳糖苷酶活性。如图9中所示，在暴露于病毒后仅6小时即可测到β-半乳糖苷酶活性；感染12～24小时后出现表达峰。正如所预期的，在后期从KSV-lacZ基因盒起源的游离型DNA分子的表达逐渐减弱(图9，数据未示出)。转染后12天经X-gal染色，仍可在不足1/1000的细胞中测到lacZ表达(数据未示出)。lacZ的表达并不是病毒扩散的结果，因为感染10天后从HepG2细胞取得的培养上清液中有10pfu/ml的溶度(如在sf21细胞上用噬斑测定法测得的)。这些数据表明，本发明可用于生产从HepG2细胞中纯化的蛋白质，可望在细胞感染后不少于6小时从细胞中分离出蛋白质。依据蛋白质的半寿期，可望在蛋白质表达峰出现后不久即分离蛋白质(对于HepG2细胞，即可在感染后大约24小时后分离)。最大量分离所生产之蛋白质的最佳时期可根据每种蛋白质、病毒、和细胞的不同来确定。在哺乳动物细胞发生的从头表达为了证实在哺乳动物细胞中检测到的报导基因活性并不是简单地β-半乳糖苷酶与进入哺乳细胞之AcMNPV病毒粒子物理结合的结果，进行几个实验以证明所观察到的lacZ报导基因的表达是β-半乳糖苷酶从头合成的结果。首先，检测RSV-lacZ病毒接种物的β-半乳糖苷酶活性，并发现β-半乳糖苷酶活性水平不到感染HepG2细胞后所表达之酶量的10％。其次，用RSV-lacZ病毒感染HepG2细胞，然后于存在着蛋白质合成抑制剂-放线菌酮的培养基中培养。感染后放线菌酮的存在可抑制β-半乳糖苷酶活性的累积达90％以上(表3)。第三，以相同的感染复数用BacPAK6(Clontech)感染HepG2细胞。BacPAK6是其中lacZ基因受病毒多角体启动子而不是被RSV启动子控制的杆状病毒(表3)。后一种病毒在该启动子可发挥活性的昆虫细胞中表达特别高水平的β-半乳糖苷酶活性(数据未示出)。在哺乳动物细胞中，病毒的多角体启动子是无活性的，而包含这种启动子的病毒则不能在哺乳动物细胞中提供任何酶活性(表3)。与以前对杆状病毒和哺乳动物细胞相互作用的研究结果相反，这些数据证明在杆状病毒介导的基因转移到哺乳动物细胞中之后，发生了lacZ的以头合成。表3.从头发生杆状病毒介导的基因转移</tables>杆状病毒介导的基因转移受到lysomotropic剂的抑制为了深入了解杆状病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因的机理，检测了基因表达对lysomotropic剂的敏感性。如其他包裹的病毒一样，AcMNPV的芽生形式可通过细胞内吞作用进入细胞，随后受低pH触发而使病毒外膜与细胞内体膜相融合，从而才能够进入胞质中(Blissardetal.，1993，J.Virol.666829-6835；Blissardetal.，1990，Ann.Rev.ofEntomol.35127-155)。为了确定是否核内体酸化为杆状病毒介导基因转移到哺乳动物细胞中所必需的，在氯喹-一种溶解趋化剂存在下，用RSV-lacZAcMNPV感染HepG2细胞。使HepG2细胞在包含或不包含抑制剂的培养基与AcMNPV病毒接触90分钟，然后除去包含病毒的培养基，换成上述包含或不包含抑制剂的新鲜培养基。感染后一天，收获细胞并检测抽提物中的β-半乳糖苷酶活性和蛋白质含量。表中的每个值均代表三次独立实验的平均值，在缺乏抑制剂的情况下由RSV-lacZAcMNPV病毒产生的β-半乳糖苷酶的量被定义为100％。就每份抽提物中的蛋白质含量统一标定β-半乳糖苷酶活性。当HepG2细胞暴露于病毒期间和之后持续存在25μM氯喹时，β-半乳糖苷酶从头表达完全被抑制(表3)。这提示杆状病毒介导的基因转移是依赖于核内体酸化作用的。当细胞暴露于病毒90分钟后加入氯喹时，β-半乳糖苷酶的表达只被受到部分抑制。很显然，在暴露于病毒90分钟后，大约有22％的病毒颗粒能够通过核内体途径产生作用。杆状病毒不被豚鼠补体影响某些逆转录病毒感染哺乳动物细胞的能力受到补体的抑制。其可溶解病毒粒子的膜(例如参见Rotheretal.，1995，HumanGeneTherapy6429-435)。因此，就给哺乳动物血管内注射病毒来说，病毒最好不受补体的影响。为了确定豚鼠补体是否能阻止Z4病毒感染细胞的能力，将20μl的Z4病毒稀释于2ml保存的豚鼠补体(BRL)中，或者作为空白对照，稀释于2ml不含补体的贮存液(6％醋酸钠、2％硼酸和0.25％的叠氮钠；BRL)中。将混合物在37℃下保温10分钟，然后连续稀释(两次100倍稀释)到无血清TNM-FH昆虫培养基中。然后按常规方法用每个病毒株的100μl等分样品感染单层Sf9昆虫细胞，并在此单层细胞上铺敷含有1.5％低熔点琼脂糖的培养基。7天后，蚀斑用经MTT染色观察病毒噬斑(参见Shanafelt，1991，Bio/Techniques11330)。估测含有暴露于补体之病毒的平板上包含430个噬斑，所代表的病毒溶度为4.3×109pfu/ml，对照平板有近260个噬斑，代表的病毒溶度为2.6×109pfu/ml。这些结果表明，在暴露于补体的样品中未见病毒溶度有明显的降低，提示血管内投用病毒将是一种体内传递病毒的有效手段。分析HepG2细胞中病毒启动子驱动RNA表达在哺乳动物细胞中用非哺乳动物病毒表达外源基因的优点是，由于缺乏合适的宿主细胞因子，所以非哺乳动物病毒启动子在哺乳动物细胞中可能是无活性的。为了确定AcMNPV病毒基因是否在HepG2细胞中表达而对病毒的RNA进行了分析。在这些实验中，用Z4病毒以接近30的感染复数感染HepG2细胞。感染后18小时，收获细胞并从细胞中提取总RNA。用Northern印迹法分析总细胞RNA的病毒基因表达。所用的探针包括1.7kbp来自于PAcUW1(Pharmacia)的PacI-SalI片段，前者包含有病毒晚期基因P74，以及很晚期(超表达)基因P10。利用从Z4感染之昆虫细胞Sf9的总细胞RNA作为阳性对照。在这些对照组昆虫细胞中，针对P10和P74可测到很强的信号，但Z4感染的HepG2细胞或未感染的对照细胞则未测到信号。另外，用高度敏感的反转录酶PCR(RT-PCR)技术进行的实验，为证明大多数病毒基因在哺乳动物HepG2细胞中不被转录提供了进一步的证据。RT-PCR分析是使用从Z4感染的HepG2细胞、未感染的HepG2细胞或感染后6小时或24小时的Sf9细胞中制备的RNA进行的。HepG2细胞被以感染复数为10或100的剂量感染。感染后6小时，在以任何剂量的病毒Z4感染的HepG2细胞中未观察到来自病毒P39、ETL、LEF1、IE1或IE-N基因的RT-PCR产物。相反，在Z4感染的Sf9细胞中则很容易检测到RT-PCR产物。在感染后24小时，在以感染复数10感染的HepG2细胞中未检出这些基因的表达。感染后24小时，在以感染复数100感染的HepG2细胞中未观察到病毒P39、ETL或LEF1基因的表达。但是，在这种高剂量病毒感染状态下，可检测到病毒IE1和IE-N基因的低水平表达。不过以感染复数100感染时，所检测到的低水平表达仍明显低于在昆虫细胞中表达的水平。这些基因的表达可能是由于哺乳动物转录因子识别病毒的TATA盒所致(即RNA聚合酶II参与的直接早期基因转录)(参见HoopesandRorhman，1991，Proc.Natl.Sci.884513-4517)。与直接早期基因相反，晚期病毒基因则由一种病毒编码的RNA多聚酶所转录。其不需要TATA盒，而是在TAAG基元处启动转录(O’Reillyetal.，Supra)。因此，病毒晚期基因的表达在哺乳动物细胞中被天然阻断。如果需要的话，可以使用常规方法删除这些基因以阻断直接早期基因的表达。以上显示的数据提示被感染之哺乳动物细胞表面上的受体虽然不一定需要，但却有可能介导哺乳动物细胞的感染。特别有意义的备选细胞系包括那些表达细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)的细胞系。HepG2细胞因其细胞表面存在ASGP-R而不同于Sk-Hep-1人肝细胞和NIH3T3小鼠成纤维细胞。在这些研究中，在Sk-Hep-1细胞(图6B)或NIH3T3细胞中表达的β-半乳糖苷酶比HepG2细胞中更少。基于X-gal染色的细胞的定量计数，估计lacZ基因在HepG2细胞中表达的频率比在Sk-Hep-1细胞中高1000倍以上。正常肝细胞有100，000到500,000ASGP-R，每天每个受体可使多达200个配体内在化。ASGP-R可以通过在病毒粒子上提供糖蛋白的细胞表面受体而促进病毒进入细胞。昆虫和哺乳动物细胞的糖基化方式有所不同，产生于昆虫细胞中之病毒粒子表面上的碳水化合物部分缺乏末端唾液酸。那些碳水化合物部分可以介导病毒颗粒的内在化和转运。除了ASGP-R外，存在于哺乳动物中的其他半乳糖结合凝集素可以介导病毒的摄入(如参见Jungetal.，1994，J.Biochem.(Tokyo)116547-553)。如果需要的话，可以在将被病毒(如杆状病毒)感染的细胞表面表达ASGP-R。编码ASGP-R的基因已被克隆(Spiessetal.，1985，J.Biol.Chem.2601979和Spiessetal.，1985，PNAS826465)，并且可使用标准的反转录病毒、腺伴随病毒，或腺病毒载体或化学方法在被病毒感染的细胞中表达ASGP-R。也可以在将被感染的哺乳动物细胞表面上表达其病毒颗粒上配体的其他受体，例如昆虫碳水化合物受体，以有利于感染(如参见Monsignyetal.，1979，Biol，Cellulaire33289-300)。另外，也可以通过化学方法(如参见Neda，etal.，1991，J.Biol.Chem.26614143-14146)或其他方法，如假分型法(pseudotyping)(如参见Burnsetal.，1993，PNAS908033-8037)对病毒进行修饰，以使之能够结合哺乳动物细胞上的其他受体。例如可将病毒被膜蛋白如VSV-G或流感病毒血凝素蛋白用于假分型。或者也可在病毒颗粒上表达病毒被膜蛋白(如gp64)与靶向分子(如VSV-G或VCAM)的融合体。膜蛋白，例如细胞粘附分子(如VCAM)在昆虫包装细胞中的过表达也将有利于病毒与哺乳动物细胞定向结合。另外，非受体介导过程也可介导细胞对病毒的摄入，导致外源基因在哺乳动物中的表达。III.非哺乳动物病毒表达外源基因的治疗应用非哺乳动物DNA病毒在几种哺乳动物细胞中有效地表达lacZ报导基因这一发现表明，治疗上可使用非哺乳动物DNA病毒在哺乳动物细胞中表达外源基因。例如，本发明的方法可促使外源基因在病人的细胞中表达，以治疗由于基因表达不足所引起的疾病。现在已知许多疾病是因单一基因缺陷引起的(见表4)，并且引起基因缺陷性疾病的许多基因都已被鉴别和克隆。可使用标准的克隆技术(如参见Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，(1989))，对非哺乳动物病毒进行基因工程改造，以使之能够在哺乳动物细胞(如人细胞)中表达所需的外源基因。表4.可用本发明的方法治疗的疾病和可按本发明方法制造的基因产物的实例</tables>本发明还可用于促使所需基因在没有明显缺陷之细胞中的表达。例如，本发明可用于在病人的肝细胞中表达胰岛素，以便在给病人体内提供胰岛素。能够在哺乳动物细胞(例如肝细胞)中表达，并可转运到哺乳动物全身循环中的其他蛋白质的例子包括激素、生长因子及干扰素。本发明也可用于在细胞中表达调节基因或编码转录因子的基因(例如Vp16-tet阻遏物基因融合体)，以控制另一个基因(例如被连接到tet操纵基因序列上的基因；如参见Gossenetal.，1992，PNAS895547-5551)的表达。如果需要的话，亦可在细胞中以治疗肿瘤的方法表达肿瘤抑制基因，如编码p53的基因。另外，本发明也可用于在细胞中表达肝细胞癌治疗基因以处理肝癌。例如，可按治疗肝细胞癌的方法表达编码肿瘤坏死因子、胸苷激酶、白喉毒素嵌合体及胞嘧啶二胺酶的基因。(如参见VileandRussell，1994，GeneTherapy，188-98)。在治疗肝细胞癌时，特别需要将外源基因可操作地连接到甲胎蛋白启动子上，因为这种启动子在肝细胞癌细胞中是有活性的，而在正常成熟细胞中则是无活性的。其他有用的基因产物包括用于RNAdecoy、反义或用于抑制基因表达方法中的核酶等RNA分子(如参见Yuetal.，1994，GeneTherapy113-26)。必要时，本发明也可用于表达某一基因，如胞嘧啶脱氨酶基因，其基因产物可以在细胞中改变药物或前体药物，如5-氯胞嘧啶的活性(如参见Harrisetal.，1994，GeneTherepy1170-175)。一些利用核酶、反义RNA、反显性阻遏物、多聚酶突变体、或核心或表面抗原突变体的方法亦可用于抑制细胞中的肝炎病毒(例如甲、乙、丙、丁型肝炎病毒)。其他疾病例如家族性血色素沉着症等也可按本发明的方法用受影响之基因的正常变体进行治疗。适于表达的优选基因包括那些编码在正常哺乳动物细胞(例如肝细胞或肺细胞)中表达之蛋白质的基因。例如，编码参与尿素循环之酶的基因，如编码氨甲酰磷酸合成酶(CPS-I)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、精氨琥珀酸合成酶(AS)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)及精氨酸酶的基因很适用该方法中。所有这些基因均已被克隆(就OTC来说可参见Horwichetal.，1984，Science2241068-1074和Hataetal.，1988，J.Biochem.(Tokyo)103302-308；就AS来说可参见Bocketal.，1983，Nucl.AcidsRes.，116565；Surhetal.，1988，Nucl.AcidsRes.，169252；和Dennisetal.，1989，PNAS867947；就ASL来说，可参见O’Brienetal.，1986，PNAS837211；就CPS-I，可参见Adcocketal.，1984(摘要)Fed.Proc.431726；就精氨酸酶来说，可参见Haraguchietal.，PNAS84412)。可用常规技术将这些基因亚克隆到杆状病毒中。在细胞中表达外源基因的治疗效果可通过监测病人的已知症状或征象来评价。例如，可通过监测血浆中的铵和乳清酸水平来检测OTC缺陷和CPS缺陷的改善。类似地，血浆中瓜氨酸水平提供了AS缺陷的指征，ASL缺陷则可通过检测血浆中精氨琥珀酸盐水平来确定。估价治疗方法的参数是医学
技术领域：
中技术人员熟知的(如参见Maestrietal.，1991，J.Pediatrics，119923-928)。非哺乳动物病毒(如杆状病毒)可与药剂学上可接受的无毒性赋形剂或载体一起配制成药剂组合物，以便对哺乳动物给药。在本发明的实践中，可将病毒制备成适于非胃肠道给药(如静脉内注射(如通过肝门静脉)、动脉内注射(例如通过股动脉或肝动脉)、腹腔内注射、鞘内注射或直接注射到某一区域(例如肌肉内注射))的剂型。更具体地说，可将非哺乳动物病毒制备成水溶液或悬浮液形式的药剂。也可将病毒制成适于鼻内或支气管内给药的气雾剂或溶剂。在本发明的实践中，可以用病毒感染需要治疗之哺乳动物体外的细胞(例如供体动物的细胞或体外培养的细胞)，然后将此被感染的细胞投用于将被治疗之动物的体内。在这种方法中，细胞可以是将被治疗之动物的自体或异源细胞。例如，可使用从肝组织活检样品中获得的自体肝细胞。(如参见Grossmanetal.，1994，NatureGenetics6335)。然后可将此细胞注射到病人体内(例如，通过门静脉)。在这样一种方法中，较好使用大约总肝体积1％～10％的肝细胞。当用本发明的方法在肝细胞中表达外源基因时，可将肝细胞输送到脾内，随后此肝细胞可在体内迁移到肝中(如参见Luetal.，1995，Hepatology217752-759)。必要时，可利用常规技术将病毒转移到细胞内，以便输送到器官、细胞或组织中(包括使用灌注泵和注射器)。为了进行灌注，一般可按1×106～1×1010pfu/ml(最好1×109～1×1010pfu/ml)的溶度，以1～500ml的体积，经过1分钟到6小时的时间投用病毒。投予哺乳动物的最适病毒量和被感染的细胞数目，以及投用频率都取决于检测外源基因表达之方法的敏感性、所使用之启动子的强度、被治疗之疾病的严重性及病毒的靶细胞等因素。一般来说，以大约0.1～1000的感染复数投用病毒，较好的感染复数为5～100，更适宜的感染复数为10～50。使用非哺乳动物病毒在体内表达外源基因在两项实验中，我已经检测了给两个不同的动物模型投用非哺乳动物病毒后lacZ在其体内的表达情况。在第一项实验中，将0.5ml的Z4病毒(≈1.4×109pfu/ml)注射(以大约1ml/分钟的速率)到一只大鼠的门静脉内。感染后约72小时以常规组织化学方法检查冰冻切片，至少在一个肝细胞中发现有lacZ的表达。可以用下述任何一种或多种方法来提高表达效率(1)用生长因子预处理动物；(2)部分肝切除；(3)注射免疫抑制剂以抑制对病毒的任何免疫反应；(4)使用高溶度或高剂量的病毒；(5)通过手术灌注法向肝内注入病毒(例如为了限制可能存在的病毒与红细胞的非特异性结合)；和/或(6)用超声波处理病毒以减少病毒的团聚。在第二项实验中，将Z4病毒通过尾静脉注射到3周令雌性BALB/c小鼠体内。在此实验中，小鼠接受(i)6×107pfu病毒(悬浮于0.15mlPBS中)，或者(ii)6×108pfu病毒(悬浮于0.15mlPBS中)；或者(iii)2×108pfu病毒(悬浮于0.05mlPBS中)。做为对照，给小鼠注射150μl无病毒的PBS。注射后24小时，处死动物，并用X-gal进行组织染色以检查lacZ的表达。在接受6×108pfuZ4病毒之小鼠的全部10张肺组织冰冻切片中均检测到相当数目的蓝色细胞。对照组小鼠和接受低剂量病毒组小鼠的肺组织的冰冻切片中未检出蓝色细胞。正如在体外观察到的，外源基因的表达是剂量依赖性的；低剂量的病毒未产生可检测的表达。在接受病毒之小鼠的肝组织切片中没有被检出蓝色细胞。总之，这些数据表明，将表达外源基因的非哺乳动物DNA病毒注入哺乳动物体内，可在体内产生外源基因产物。其他实施方案本发明可使用除上述苜蓿丫纹夜蛾(Acetographacaliformica)病毒以外的其他一些非哺乳动物病毒，如表1中所列的病毒。较好使用核多角体病毒，如多核壳病毒(MNPV)或单核壳病毒(SWPV)。具体地说，可使用枞色卷蛾MNPV、甘蓝夜蛾MNPV、油桐尺蠖核多角体病毒，OrgyiapseudotsugataMNPV、中国家蚕(Bombyxmori)SNPV、玉米夜蛾(Heliothiszea)SWPV和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)SWPV。如下面列出的颗粒体病毒(GV)也可用在本发明中苹果异形小卷蛾GV、印度谷螟GV、粉纹夜蛾GV、大菜粉蝶GV、ArtogeiarapaeGV以及苹果小卷蛾颗粒体病毒(CpGV)。还有，本发明中也可使用非闭合病毒(NOB)，如HeliothiszeaNOB和Cryctesrhinoceras病毒。其他昆虫(如鳞翘目)和甲壳纲病毒也可用于本发明中。有用病毒的例子包括那些感染真菌(如strongwellseamagra)和蜘蛛的病毒。已从螨、甲壳纲昆虫(如Carcinusmaenas，Callinectessapidus，penaeid小虾的黄头杆状病毒以及penaeusmonodon型杆状病毒)和鞘翅目昆虫中分离出了一些相似于杆状病毒的病毒。Lymautriadispar杆状病毒用于本发明中也是有效的。如果需要时，病毒可用基因工程方法改造病毒，以促使病毒定向进入某种特定类型的靶细胞。例如可在病毒颗粒的表面上与细胞表面受体而不是ASGP-R结合的配体。此外，也可对病毒进行化学修饰以使之与特定受体结合。必要时，可首先刺激将被感染的细胞，使其达到有丝分裂活跃状态。在细胞培养中，一些试剂，如氯仿就可有这种作用；在体内例如可通过部分肝切除术刺激肝细胞分裂，(如参见Wilsonetal.，1992，J.Biol.Chem.26711283-11489)。可根据需要对病毒基因组进行基因工程修饰使之携带单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因；这就使得含病毒基因组的细胞可被9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(gancicylovir)杀死。如需要时，可将病毒制成在其天然非哺乳动物宿主细胞(如昆虫细胞)上生长有缺陷的病毒。这样的病毒株更为安全并能够在互补包装系上繁殖。例如可制得一种其中直接早期基因如IE1基因已被删除的缺陷型杆状病毒。这种删除可通过在酵母或大肠杆菌中定向重组来实现，并且这种缺陷病毒能够在IE1基因产物以反式提供的昆虫细胞中复制。必要时，可在感染前用神经氨酸酶处理病毒，以除去附加的末端半乳糖残基(例如参见Morelletal.，1971，J.Biol.Chem.2461461-1467)。序列表(1)一般的信息(i)申请人BoyceFrederickM(ii)发明名称USEOFANON-MAMMALIANDNAVIRUSTOEXPRESSANEXOGENOUSGENEINAMAMMALIANCELL(iii)序列数4个(iv)通讯地址(A)地址FishofRichardsonP.C.(B)街名225FranklimStreet(C)城市Boston(D)州MA(E)国家USA(F)zip02110-2804(v)计算机格式(A)媒介类型Floppy盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatertInRelease#1.0，Version#1.30(vi)本申请资料(A)申请号US08/486,341(B)申请日07-6-1995(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号US08/311,157(B)申请日23-9-1994(viii)律师/代理人资料(A)姓名Clark，PanlT(B)注册号30，162(C)参考/登记号00786/277001(ix)电讯(A)Tel617/542-5070(B)FAX617/542-8906(C)Telex200154(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基时(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO1AGCTGTCGACTCGAGGTACCAGATCTCTAGA31(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO2AGCTTCTAGAGATCTGGTACCTCGAGTCGAC31(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度52个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO3GATCTGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGG52(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)长度52个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO4GATCCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCA5权利要求1.在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法，包括a)将其基因组包含上述外源基因的非哺乳动物DNA病毒导入细胞中；b)使所说的细胞在得以表达所说的外源基因的条件下存活。2.权利要求1的方法，其中所述的病毒是一种无脊椎动物病毒。3.权利要求2的方法，其中所述的无脊椎动物病毒是一种昆虫病毒。4.权利要求3的方法，其中所述的昆虫病毒选自于杆状病毒科、多DNA病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科、浓核病毒科、花椰菜花叶病毒科和藻DNA病毒科。5.权利要求4的方法，其中所述的病毒是一种杆状病毒。6.权利要求5的方法，其中所述的杆状病毒是一种核多角体病毒。7.权利要求6的方法，其中所述的核多角体病毒是苜蓿丫纹夜蛾(AutographaCalifornica)多核型多角体病毒。8.权利要求6的方法，其中所述的基因组缺乏功能性的多角体基因。9.权利要求5的方法，其中所述的杆状病毒是以闭合的形式存在的。10.权利要求5的方法，其中所述的杆状病毒是以芽殖的形式存在的。11.权利要求1的方法，其中所述的基因组进一步包括转座因子之长末端重复序列的启动子。12.权利要求1的方法，其中所述的基因组进一步包括逆转录病毒之长末端重复序列的启动子。13.权利要求12的方法，其中所述的逆转录病毒是Rous肉瘤病毒。14.权利要求1的方法，其中所述的基因组进一步包括腺伴随病毒的整合末端重复序列。15.权利要求14的方法，其中所述的基因组进一步包括腺伴随病毒的rep基因。16.权利要求1的方法，其中所述的基因组进一步包括一个细胞无限增殖序列。17.权利要求1的方法，其中所述的基因组进一步包括一个复制原点。18.权利要求16的方法，其中所述的复制原点包括EB病毒的复制原点。19.权利要求1的方法，其中所述的基因组进一步包括聚腺苷酸化信号和RNA剪接信号。20.权利要求1的方法，其中所述的基因组进一步包括细胞类型特异性启动子。21.权利要求20的方法，其中所述的细胞类型特异性启动子包括肝细胞特异性启动子。22.权利要求21的方法，其中所述的肝细胞特异性启动子包括选自以下组中的启动子乙型肝炎启动子、甲型肝炎启动子、丙型肝炎启动子、白蛋白启动子、α-1-抗胰蛋白酶启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酚丙酮酸盐羧基激酶启动子、运铁蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、甲胎蛋白启动子、α-纤维蛋白原启动子和β-纤维蛋白原启动子。23.权利要求22的方法，其中所述的基因组包括乙型肝炎启动子，并进一步包括乙型肝炎增强子。24.权利要求22的方法，其中所述的基因组包括白蛋白启动子。25.权利要求21的方法，其中所述的肝细胞特异性启动子包括选自下列组中之基因的启动子低密度脂蛋白受体、α2-巨球蛋白、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-HS糖蛋白、触珠蛋白、血浆铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体蛋白、C3补体活化因子、β1脂蛋白和α1-酸性糖蛋白。26.权利要求1的方法，其中所述的细胞是肝细胞。27.权利要求26的方法，其中所述的肝细胞是原代肝细胞。28.权利要求26的方法，其中所述的肝细胞是HepG2肝细胞。29.权利要求1的方法，其中所述的细胞是肾细胞系293的细胞。30.权利要求1的方法，其中所述的细胞是PC12细胞。31.权利要求1的方法，其中所述的细胞选自下列组中Sk-Hep-1细胞、NTH3T3细胞、HeLa细胞、CHO/dhfr-细胞、293细胞、COS细胞和C2C12细胞。32.权利要求31的方法，其中所述的细胞是原代细胞。33.权利要求32的方法，其中所述的病毒在铺敷所述的原代细胞后24小时被导入所述的原代细胞中。34.权利要求32的方法，其进一步包括将所说的原代细胞导入哺乳动物体内。35.权利要求1的方法，其中所述的病毒被体外导入所述的细胞中。36.权利要求1的方法，其进一步包括允许所述的细胞在包含胶原的底物上存活。37.权利要求36的方法，其中所述的胶原是大鼠尾I型胶原。38.权利要求1的方法，其中所述的细胞允许在体外条件下存活。39.权利要求1的方法，其中所述的细胞允许在体内条件下存活40.权利要求39的方法，其中所述的细胞允许在人体内存活。41.权利要求1的方法，其中所述的哺乳动物细胞是人细胞。42.权利要求1的方法，其中所述的细胞包含脱唾液糖蛋白受体。43.权利要求1的方法，其中所述的病毒是经向包含所述细胞的哺乳动物体施用而导入所述细胞中的。44.权利要求43的方法，其中所述的病毒是通过静脉注射施用的。45.权利要求43的方法，其进一步包括通过调节向所述哺乳动物体内施用之所述病毒的量将病毒导向所述的细胞内。46.权利要求1的方法，其中所述的基因编码某种蛋白质。47.权利要求46的方法，其进一步包括从所述的细胞中纯化所述的蛋白质。48.权利要求46的方法，其中所述蛋白质包括选自以下组中的一种蛋白质氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸氨基甲酰转移酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶及精氨酸酶。49.权利要求46的方法，其中所述的蛋白质包含由下列组中选出的一种蛋白质富马酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、分支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、Menkes氏病蛋白、Wilson’s氏病基因pWD的产物和CFTR。50.权利要求46的方法，其中所述的蛋白质包括胰岛素。51.权利要求1的方法，其中所述的蛋白质包括P53。52.权利要求1的方法，其中所述的基因编码反义RNA。53.权利要求52的方法，其中所述的反义RNA包括一个互补于肝炎病毒之核酸的序列。54.应用基因组包含外源基因的非哺乳动物DNA病毒制备一种治疗哺乳动物基因缺陷性疾病的药物。55.权利要求54的应用，其中所述的病毒是无脊椎动物病毒。56.权利要求55的应用，其中所述的无脊椎动物病毒是一种昆虫病毒。57.权利要求56的应用，其中所述的昆虫病毒是一种杆状病毒。58.权利要求54的应用，其中所述的基因编码选自以下组中基因产物氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸氨基甲酰转移酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、富马酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸氨基甲酰转移酶、精氨琥珀酰合成酶、精氨琥珀酰裂解酶、精氨酸酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、分支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、Menkes氏病蛋白、Wilson’s氏病基因pWD的产物及CFTR。59.基因组中含有选自以下列组中的肿瘤治疗基因的非哺乳动物DNA病毒在制备治疗哺乳动物肝细胞癌的药物中的应用，所述基因包括肿瘤坏死因子、胸苷激酶、白喉毒素嵌合体和胞嘧啶二氨酶。60.权利要求59的应用，其中所述的非哺乳动物DNA病毒是一种杆状病毒。61.权利要求59的应用，其中所述的肿瘤治疗基因被可操作地连接到甲胎蛋白启动子上。62.权利要求1的方法，其中所述的外源基因选自以下组中LacZ基因、氯霉素乙酰转移酶基因、碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因。全文摘要公开了在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法,其包括用基因组中携带外源基因的非哺乳动物病毒,例如杆状病毒感染细胞,并在使基因得以表达的条件下培养细胞。使用例如附图中描述的转移载体将外源基因送入哺乳动物。另外还公开了给细胞提供治疗上有效量的其基因组载体外源基因的病毒并在可使外源基因在哺乳动物体内得以表达的条件下增殖细胞,以治疗哺乳动物的基因缺陷性疾病的方法。文档编号C12R1/91GK1172435SQ95196379公开日1998年2月4日申请日期1995年9月8日优先权日1994年9月23日发明者F·M·博伊斯申请人:综合医院公司