一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素 e 后提高促性腺激素表达水平的方法
【专利摘要】本发明涉及一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，步骤如下：(1)半滑舌鳎垂体细胞的分离与培养：首先配制L?15细胞培养基，然后用所配培养基进行原代细胞的培养：(2)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E：配制维生素E溶液，向步骤(1)中所培养的细胞中添加维生素E，在添加后第四天进行样品收集；(3)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E后FSH和LH的定量PCR分析；取步骤(2)中的细胞沉淀进行RNA的提取及反转录，然后进行实时荧光定量PCR反应；(4)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E后FSH和LH的ELISA分析；以步骤(2)中收集的上清液为材料依次进行标准品的稀释与加样、加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止、测定。
【专利说明】
一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法
技术领域
[0001]本发明属于水产生物技术中的水产养殖领域，具体涉及一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法。
【背景技术】
[0002]维生素E(Vitamin E)包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，S卩α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚。α-生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富、活性最高的维生素E形式。维生素E可以参与调解组织呼吸和氧化磷酸化过程，具有促进生殖、抗氧化、免疫调节等功能(麦康森，水产动物营养与饲料学，中国农业出版社，2011)。
[0003]半滑舌觸(Cynoglossys semilaevis)是我国近海特有的暖温性大中型底层鱼类，主要分布于黄海、渤海，生长速度快，肉味鲜美，营养价值很高(邓景耀等，海洋水产研究，1988，9:10-98)。近年来，半滑舌鳎已成为我国海水鱼类养殖的主导品种之一。但是，由于半滑舌鳎亲鱼繁殖性能较差，人工育苗中出苗率只有30%左右(柳学周等，海洋水产研究，2006，27:17-24;朱丽华等，河北渔业，2011，5:51-52)，严重制约半滑舌鳎养殖业发展。研究发现饲料中添加适量维生素E会促进半滑舌鳎亲鱼性腺发育，增加产卵量，提高卵子和仔鱼的质量(肖登元等，渔业科学进展，2015，36:125-132)。其他水产动物中研究也发现饲料中添加维生素E能够提高亲鱼、亲虾的性腺系数、产卵量、卵子和精子质量、受精率、孵化率、子代成活率等(Izquierdo et al.,Aquaculture，2001，197: 25-42 ;Watanabe et al.,Aquaculture, 2003,227:35-61 ；Nguyen et al.,Aquaculture, 2012,336-337:73-81)。上述研究认为由于维生素E具有很强的抗氧化功能，能够清除体内不利的自由基而防止脂质过氧化，从而保持细胞膜的完整性和正常的生理功能，提高了动物的繁殖性能。然而，肉种鸡陆生动物的早期组织学和免疫组化研究发现，饲料中补充维生素E能够增强垂体分泌促性腺激素(Gonadotropin Hormone，GtH)的功能，表现为垂体细胞体积的增大以及GtH含量的增加，不过相关研究仅停留在组织学层面，研究报道也十分有限(Herrick et al.，Proceedings of the society for experimental b1logy and medicine,1952,79:441-444；Khan et al.,ActaHistochemica,2013,115:698-704)0
[0004]GtH是一种能影响性腺发育和机能的激素，其作为下丘脑-垂体-性腺内分泌系统的中间信号分子，在鱼类的生殖发育、内分泌调控中起着至关重要的作用(林浩然，鱼类生理学，2011，中山大学出版社)。鱼类GtH由脑垂体分泌，包括促滤泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和促黄体激素(luteinizing hormone，LH)。目前，在鱼类中，尚未见维生素E与脑垂体分泌的促性腺激素之间关系的研究报道。深入探讨维生素E与垂体分泌的促性腺激素之间的关系，有助于阐明维生素E提高亲鱼繁殖性能的调控机制。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E以提高促性腺激素的表达水平的方法，为阐明维生素E提高半滑舌鳎繁殖性能的调控机制奠定基础。
[0006]对于上述技术问题，本发明是通过如下步骤实现的:
[0007](I)半滑舌鳎垂体细胞的分离与培养:首先取9.6克L-15培养基和4.76克Hepes，充分溶解混匀4小时后，用NaOH调节pH，然后抽滤，分装后进行保存;在加入胎牛血清、青霉素、链霉素以后，进行保存，最后用所配培养基将原代细胞在24°C的培养:
[0008](2)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E:配制低浓度为70μπιΟ1/πι1和高浓度为210μπιο?/ml维生素E溶液，向步骤(I)中所培养的细胞中添加维生素Ε，在添加后第四天进行样品收集；
[0009](3)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E后FSH和LH的定量PCR分析:取步骤(2)中的细胞沉淀进行RNA的提取及反转录，然后进行实时荧光定量PCR反应；
[0010](4)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E后FSH和LH的ELISA分析:以步骤(2)中收集的上清液为材料依次进行标准品的稀释与加样、加样、30分钟的温育、配液、洗涤、加酶标试剂50μ 1、温育、洗涤、显色15分钟、终止、测定。
[0011 ]步骤(I)中的PH为7.4，保存温度为4°C，胎牛血清的终体积为5%、青霉素的终浓度为100U/ml、链霉素的终浓度为100yg/ml。
[0012]步骤(I)中的原代细胞摘取卵巢发育处于m期的半滑舌鳎的垂体细胞。
[0013]步骤(I)中将垂体细胞置于装有L-15完全培养基的一次性细胞培养皿中，PBS冲洗一次，然后将所述将垂体组织剪成大约Imm3的小块，再用PBS冲洗一次，加入约组织块10倍体积的0.25%的胰蛋白酶进行消化，加入PBS将垂体组织吹打分散，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，将滤过液收集至15ml离心管中，以100g/min离心10分钟，去上清然后重悬沉淀，按照Iml/孔的量分装至六孔板中，正置于24°C培养箱中培养。
[0014]步骤(2)配制的维生素E所用溶剂为无水乙醇。
[0015]向步骤(2)中的细胞添加维生素E的操作方法为取所述垂体细胞3孔置于15ml离心管中，以100g/min的速度离心5min，去上清后用1.5ml L-15完全培养基重悬细胞，准备三种实验组，半滑舌鳎垂体细胞平均分装于六孔板中的3孔，其中2孔分别加入终浓度为35μπι01/ml和105ymol/ml的维生素Ε，另外I孔作为对照。
[0016]步骤(2)的样品收集方法为将所述垂体细胞置于15ml离心管中，以100g/min离心1min0
[0017]步骤(2)三种实验组分别为:
[0018]实验组A:0.5ml细胞悬液+0.5ml LI5完全培养基
[0019]实验组B:0.5ml细胞悬液+0.5ml 70ymol/ml维生素E
[0020]实验组C:0.5ml细胞悬液+0.5ml 210ymol/ml维生素E
[0021]步骤(3)中的RNA的提取工具为总RNA极速抽提试剂盒，反转录的方法为通过M-MLV反转录酶反转录成cDNA。
[0022]步骤(3)中的实时荧光定量PCR反应所需的各引物序列如下:
[0023]FSHF:TGATGGGTGTCCAGAGGAAG
[0024]FSHR:CAACAAACCGTCCACAGTCC
[0025]LHF:AGACGGTGTCTCTGGAGAAAGAAG
[0026]LHR:ACGGCACCTTGATGTTTGGT
[0027]I8SF:GGTCTGTGATGCCCTTAGATGTC
[0028]I8SR:AGTGGGGTTCAGCGGGTTAC
[0029]所需的反应体系以及反应条件如下:
[0030]20μ1反应体系
[0031]10μ1 SYBR Taq
[0032]0.4μ1 primer F
[0033]0.4μ1 Primer R
[0034]0.4μ1 Rox RD II
[0035]0.5μ1 cDNA
[0036]8.3μ1 H2O
[0037]步骤(4)的标准品的稀释与加样方法为取48孔酶标板，设置6组以IX、3Χ，5Χ，8Χ，14Χ，28Χ梯度稀释的标准品样品，每个样品2孔，每孔加样量为50μ1;加样方法为设置空白孔2个和待测样品A、B、C各三个孔，每孔加样量为50μ1(样品稀释液40，待测样品ΙΟμΙ);温育方法为用封板膜封板后置于37°C温育;配液方法为将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；洗涤方法为小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干;加酶方法为每孔加入酶标试剂，空白孔除外;温育方法为用封板膜封板后置于37°C温育30min;洗涤方法为用PBS冲洗一次；显色方法为每孔先加入显色剂A50μ1，再加入显色剂B 50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色;终止方法为每孔加终止液50μ1，终止反应;测定方法为将空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。
[0038]上述结果表明，利用本发明建立的半滑舌鳎垂体原代细胞可维持正常生长状态10天以上，可以作为研究垂体分泌激素的体外材料。同时，向垂体细胞添加适量维生素E之后，可以提高FSH和LH在mRNA和蛋白质水平的表达量。本发明初步表明维生素E可以通过提高FSH和LH水平刺激垂体成熟，为阐明维生素E作用于鱼类生殖调控的分子机制奠定了重要基础。
【附图说明】
图1为本发明一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法的原代培养中的性腺切片的细胞图；
图2为本发明一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法的原代培养后期细胞图；
图3为本发明一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法的的FSH和LH mRNA相对表达水平曲线图；
图4为本发明一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法的上清中大的FSH和LH含量曲线图。
【具体实施方式】
[0039]下面结合附图实施例对本发明的方法做进一步说明。但本实施例仅限于说明本发明的步骤，并不限于此。以下实施例中未注明的具体的实验条件，通常可按常规条件操作。
[0040](I)半滑舌鳎垂体细胞的分离与培养[0041 ] I)配制细胞培养液:取9.6克L-15培养基和4.76克Hepes，充分溶解混匀4小时后，用NaOH调节pH为7.4，然后抽滤，分装，即为L-15基础培养基，4°C保存;L-15基础培养基中加入终体积为5 %的胎牛血清、终浓度为100U/ml的青霉素、终浓度为100yg/ml的链霉素，即为L-15完全培养基，4°C保存。
[0042]2)原代培养:摘取卵巢发育处于m期(性腺切片如图1所示)的半滑舌鳎的垂体，置于装有L-15完全培养基的一次性细胞培养皿中，PBS冲洗一次，将垂体组织剪成大约Imm3的小块，再用I3BS冲洗一次，加入约组织块10倍体积的0.25 %的胰蛋白酶进行消化。加入I3BS将垂体组织吹打分散，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，将滤过液收集至15ml离心管中，以100g/min离心10分钟，去上清然后重悬沉淀，按照Iml/孔的量分装至六孔板中，正置于24°C培养箱中培养，培养后第2，3，4天连续拍照观察(如图2所示)。
[0043](2)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E
[0044]I)配制维生素E溶液
[0045]将细胞培养用的维生素E用无水乙醇分别配制为低浓度是70μπιΟ1/πι1和高浓度是210ymol/ml的两种浓度。
[0046]2)向垂体细胞添加维生素E
[0047]取培养4天后的半滑舌鳎垂体细胞3孔置于15ml离心管中，以100g/min的速度离心5min，去上清后用1.5ml L-15完全培养基重悬细胞，准备如下三种实验组:
[0048]实验组A:0.5ml细胞悬液+0.5ml LI5完全培养基
[0049]实验组B:0.5ml细胞悬液+0.5ml 70ymol/ml维生素E
[0050]实验组C:0.5ml细胞悬液+0.5ml 210ymol/ml维生素E
[0051]这样，将半滑舌鳎垂体细胞平均分装于六孔板中的3孔，其中2孔分别加入终浓度为35ymol/ml和105ymol/ml的维生素E，另外I孔作为对照。
[0052]3)样品收集
[0053]维生素E添加后第4天，收集3组垂体细胞置于15ml离心管中，以100g/min离心1min之后，细胞沉淀用于后续提取RNA实验，上清用于ELISA实验。
[0054](3)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E后FSH和LH的定量PCR分析
[0055]I)半滑舌鳎细胞RNA的提取及反转录:取A、B、C三个实验组的细胞沉淀，用总RNA极速抽提试剂盒(Fastagen)提取总RNA，采用常规方法通过M-MLV反转录酶(Takara)反转录成cDNA。
[0056]2)实时荧光定量PCR反应
[0057]根据半滑舌觸FSH(GenBankNumber: JQ277933.I)、LH基因(GenBank Number:JQ277934.1)的cDNA序列以及18S序列设计实时荧光定量PCR引物对半滑舌鳎垂体细胞中FSH、LH基因的表达进行分析测定。
[0058]各引物序列如下:
[0059]FSHF:TGATGGGTGTCCAGAGGAAG
[0060]FSHR:CAACAAACCGTCCACAGTCC[0061 ] LHF:AGACGGTGTCTCTGGAGAAAGAAG
[0062]LHR:ACGGCACCTTGATGTTTGGT
[0063]I8SF:GGTCTGTGATGCCCTTAGATGTC
[0064]I8SR:AGTGGGGTTCAGCGGGTTAC
[0065]实时荧光定量PCR反应体系以及反应条件:
[0066]20μ1反应体系
[0067]10μ1 SYBR Taq
[0068]0.4μ1 primer F
[0069]0.4μ1 Primer R
[0070]0.4μ1 Rox RD II
[0071]0.5μ1 cDNA
[0072]8.3μ1 H2O
[0073]发现垂体细胞在添加维生素E之后FSH和LH相对表达水平具有不同程度的升高，且与维生素E浓度之间存在剂量依存关系(如图3所示)。
[0074](4)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E后FSH和LH的ELISA分析
[0075]采用北京冬歌博业生物科技有限公司的鱼促卵泡素(FSH)ELISA检测试剂盒和鱼黄体生成素(LH) ELI SA检测试剂盒，以步骤(2)中收集的A、B、C三组样品的上清液为材料，按照试剂盒说明书进行操作，简要步骤如下:
[0076]I)标准品的稀释与加样:取48孔酶标板，设置6组以1Χ、3Χ，5Χ，8Χ，14Χ，28Χ梯度稀释的标准品样品，每个样品2孔，每孔加样量为50μ1 ；
[0077]2)加样:设置空白孔2个、样品A、B、C各三个待测孔(样品稀释液40μ1+待测样品10μI);
[0078]3)温育:用封板膜封板后置于37°C温育30min;
[0079]4)配液:将30 (48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 (48T的20倍)倍稀释后备用；
[0080]5)洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
[0081 ] 6)加酶:每孔加入酶标试剂50μ1，空白孔除外；
[0082]7)温育:用封板膜封板后置于37°C温育30min;
[0083]8)洗涤:用PBS冲洗一次；
[0084]9)显色:每孔先加入显色剂A 50μ1，再加入显色剂B 50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟；
[0085]10)终止:每孔加终止液50μ1，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
[0086]11)测定:将空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0087]结果显示样品六、8、(:中？3!1的浓度分别为2.65，3.41，4.4311111]/11^，1^浓度分别为10.10，15.84，19.6711111]/11^(如图4所示)。
[0088]上述结果表明，利用本发明建立的半滑舌鳎垂体原代细胞可维持正常生长状态10天以上，可以作为研究垂体分泌激素的体外材料。同时，向垂体细胞添加适量维生素E之后，可以提高FSH和LH在mRNA和蛋白质水平的表达量。本发明初步表明维生素E可以通过提高FSH和LH水平刺激垂体成熟，为阐明维生素E作用于鱼类生殖调控的分子机制奠定了重要基础。
【主权项】
1.一种向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)半滑舌鳎垂体细胞的分离与培养:首先取9.6克L-15培养基和4.76克Hepes，充分溶解混匀4小时后，用NaOH调节pH值，然后抽滤，分装后进行保存;在加入胎牛血清、青霉素、链霉素以后，进行保存，最后用所配培养基将原代细胞在24°C的培养: (2)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E:配制低浓度为70μπιΟ1/πι1和高浓度为210μmol/ml维生素E溶液，向步骤(I)中所培养的细胞中添加维生素Ε，在添加后第四天进行样品收集； (3)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E后FSH和LH的定量PCR分析:取步骤(2)中的细胞沉淀进行RNA的提取及反转录，然后进行实时荧光定量PCR反应； (4)向半滑舌鳎垂体细胞中添加维生素E后FSH和LH的ELISA分析:以步骤(2)中收集的上清液为材料依次进行标准品的稀释与加样、加样、温育30分钟、配液、洗涤、加酶标试剂50μ?、温育、洗涤、显色15分钟、终止、测定。2.根据权利要求1所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，步骤(I)中的PH为7.4，保存温度为4°C，胎牛血清的终体积为5%、青霉素的终浓度为100U/ml、链霉素的终浓度为100yg/ml。3.根据权利要求1所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的原代细胞摘取卵巢发育处于m期的半滑舌鳎的垂体细胞。4.根据权利要求3所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，将所述的垂体细胞置于装有L-15完全培养基的一次性细胞培养皿中，PBS冲洗一次，然后将所述将垂体组织剪成大约Imm3的小块，再用PBS冲洗一次，加入约组织块10倍体积的0.25 %的胰蛋白酶进行消化，加入PBS将垂体组织吹打分散，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，将滤过液收集至15ml离心管中，以100g/min离心10分钟，去上清然后重悬沉淀，按照Iml/孔的量分装至六孔板中，正置于24°C培养箱中培养。5.根据权利要求1所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，所述步骤(2)配制的维生素E所用溶剂为无水乙醇。6.根据权利要求1所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，向所述步骤(2)中的细胞添加维生素E的操作方法为取所述垂体细胞3孔置于15ml离心管中，以100g/min的速度离心5min，去上清后用1.5ml L-15完全培养基重悬细胞，准备三种实验组，半滑舌鳎垂体细胞平均分装于六孔板中的3孔，其中2孔分别加入终浓度为35ymol/ml和105ymol/ml的维生素E，另外I孔作为对照。7.根据权利要求1所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，所述步骤(2)的样品收集方法为将所述垂体细胞置于15ml离心管中，以 100g/min离心lOmin。8.根据权利要求6所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，所述三种实验组分别为: 实验组A:0.5ml细胞悬液+0.5ml L15完全培养基 实验组B: 0.5ml细胞悬液+0.5ml70ymol/ml维生素E 实验组C:0.5ml细胞悬液+0.5ml210ymol/ml维生素E。9.根据权利要求1所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的RNA的提取工具为总RNA极速抽提试剂盒，所述反转录的方法为通过M-MLV反转录酶反转录成cDNA。10.根据权利要求1所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的实时荧光定量PCR反应所需的各引物序列如下: FSHF:TGATGGGTGTCCAGAGGAAG FSHR:CAACAAACCGTCCACAGTCC LHF:AGACGGTGTCTCTGGAGAAAGAAG LHR:ACGGCACCTTGATGTTTGGT 18SF:GGTCTGTGATGCCCTTAGATGTC 18SR:AGTGGGGTTCAGCGGGTTAC 所需的反应体系以及反应条件如下: 20μ1反应体系 10μ1 SYBRTaq 0.4μ1 primer F 0.4μ1 Primer R 0.4μ1 Rox RD II 0.5μ1 cDNA 8.3μ1 Η2Ο ο11.根据权利要求1所述的向半滑舌鳎垂体细胞添加维生素E后提高促性腺激素表达水平的方法，其特征在于，所述步骤(4)的标准品的稀释与加样方法为取48孔酶标板，设置6组以1Χ、3Χ，5Χ，8Χ，14Χ，28Χ梯度稀释的标准品样品，每个样品2孔，每孔加样量50μ1 ；加样方法为设置空白孔2个、样品A、B、C各三个待测孔(样品稀释液40μ1+待测样品ΙΟμΙ);温育方法为用封板膜封板后置于37°C温育;配液方法为将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用; 洗涤方法为小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干;加酶方法为每孔加入酶标试剂，空白孔除外;温育方法为用封板膜封板后置于37°C温育30min;洗涤方法为用PBS冲洗一次； 显色方法为每孔先加入显色剂A 50μ1，再加入显色剂B 50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色；终止方法为每孔加终止液50μ1，终止反应;测定方法为将空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。
【文档编号】C12N5/071GK105838663SQ201610237755
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】王娜, 王蔚芳, 黄滨, 史宝, 王若青, 马佳璐, 陈松林
【申请人】中国水产科学研究院黄海水产研究所