一种肝脏体外培养的方法

一种肝脏体外培养的方法
【专利摘要】本专利涉及一种肝脏体外培养的方法，该方法包括肝脏原位灌注、肝脏离体和肝脏体外培养。肝脏原位灌注包括利用低温条件、自制培养液和重力灌注方式对肝脏进行原位灌注。肝脏离体时在继续灌注的前提下通过常规肝脏分离手术获取离体肝脏。肝脏体外培养模拟肝脏体内生理环境，包括循环方式、肝脏灌注压、肝脏灌注量、供氧方式、稳定酸碱度、温度恒定、力学条件，利用自制肝脏体外培养系统培养离体肝脏。本发明通过模拟肝脏生理条件，为幼体肝脏培养成成体肝脏研究提供了一种方法。
【专利说明】
-种肝赃体外培养的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，主要用于哺乳动物肝脏体外培养，特别是大鼠和小香 猪肝脏体外培养。
【背景技术】
[0002] 目前国内外终末期肝病治疗唯一有效手段是肝移植，而在中国乃至世界范围内， 肝移植供体来源极度紧缺。而目前无论肝脏保存技术如何发展，都无法根本性解决肝移植 供体供需比极度失衡的问题。因此肝脏器官培养成为开辟肝移植供体来源的新途径。
[0003] 目前在已有技术中，肝脏器官培养还存在于细胞团组织培养层面上，如美国专利 US20080193421 Al和中国专利CN102391983B，名义上是S维培养，但其实质仍然是的氧气 和营养的渗透性供给，不能给予肝脏合适的存活和生长条件。美国专利US5976870 A，还停 留在组织切片培养层面上，不能形成具有正常结构和功能的肝脏。另一方面，人工肝技术虽 然发展快速，但是肝脏细胞脱离正常生理环境下的状态与功能很难长时间维持，人工肝技 术存在实践上的诸多困难。再者如美国专利US8802361 B2,目前肝脏体外循环灌注培养类 技术如肝脏机械灌注与保存中，通常利用低溫和机械灌注，其中低溫会导致肝脏低溫损伤 和肝脏ATP消耗，机械灌注中蠕动累或离屯、累提供动力的灌输方式会导致肝脏微结构和微 循环的损伤，诸多因素导致肝脏无法长期在机械灌注模式中存活。迄今为止完全模拟肝脏 生理状态的培养方法仍然没有实现。肝脏体外培养技术还处于理论验证阶段，其中设及多 学科多领域的交叉融合应用，肝脏从体外保存到实现体外生长，需要在参考模拟肝脏在体 内的生理环境基础上创造有利于肝脏恢复与生长的溫和环境。

【发明内容】

[0004] 本发明主要解决的技术问题是如何模拟肝脏体内生理环境从而实现肝脏体外培 养。
[0005] 本发明针对现有技术问题所提出的技术方案为:提供一种哺乳动物肝脏体外培养 的方法。
[0006] 本发明方法包括W下步骤： a、原位灌注，手术暴露肝脏后，对肝脏利用低溫培养液进行原位灌注，减轻缺氧缺血损 伤W及避免凝血栓塞。
[0007] b、肝脏离体，通过常规肝脏分离手术获取离体肝脏； C、体外培养，将离体肝脏接入体外培养系统，通过各种培养条件的模拟，实现肝脏体外 培养。
[000引其中上述方法所述肝脏为成年SD大鼠和2月龄香猪的健康肝脏； 其中上述方法所述培养液为W经过应用验证的细胞培养基RPMI1640培养基为基础，加 入血清10%-90%，脂肪乳1%-5%，抗生素终浓度为青霉素 lOOU/mL，链霉素 lOOU/mL、山梨酸钟 5mL/L，右旋糖酢40为0.1%等，具有能够为肝脏提供营养、生理渗透压、防止感染等作用。 RPMI1640培养基成分如下：
其中上述方法中步骤C所述各种条件模拟包括W下条件： a)循环方式:模拟肝脏肝动脉和肝口静脉入肝-肝静脉出肝的血液循环方式，通过高 度差提供压力输入，从肝动脉和肝口静脉输入培养液，培养液从肝静脉流出，并利用蠕动累 将流出培养液抽回高处储液器完成循环。
[0009] b)肝脏灌注压：利用低于生理血压的条件，肝动脉入肝灌注压约为肝动脉入肝血 压的30%，即500mm出0,而口脉入肝灌注压约为50 mm此0,约为正常口脉压（110-180 mm此0) 的 30〇/〇-50〇/〇。
[0010] C)肝脏灌注流量:正常入肝血流中，肝动脉占比25%，口脉占 75%。为减少口脉灌注 对肝窦的伤害，经过测试，确定流量分配比例如下:动脉流量为0.5mL/min ? g肝脏，占总入肝 流量50%，口脉流量为0.5mL/min ? g肝脏，占总入肝流量50%。
[0011] d)供氧方式:利用鼓泡式超饱和氧合为肝脏供氧，气泡直径小于50WH，并利用95% 化-5%0)2和100%〇2联合并设置不同比例供氧，且能调节C〇2供应量。
[0012] e)稳定酸碱度:利用C〇2供应量变化W及酸碱调节试剂如化H(X)3的添加，稳定培养 液pH为7.35-7.45，模拟血液生理pH条件。
[0013] f)溫度恒定:利用精密控溫水浴为肝脏提供恒溫38.5°C条件。
[0014] g)物理条件:通过悬吊+液体悬浮模式为肝脏提供模拟体内力学环境的条件。详见 图1，即将利用与肝脏相连的隔肌W及血管进行水平和垂直方向的=维悬吊固定，并利用肝 脏浸没在培养液中产生的浮力，使得肝脏处于受力平衡和舒展状态，保证肝脏微结构的正 常和微循环的通杨。
[0015] 其中，上述方法所述肝脏体外培养系统为自行研制肝脏体外培养系统，详见图2， 包括W下组件： a) 、动力组件:最大流量为500mL/min的蠕动累； b) 、氧合组件:包括氧气瓶，氧气减压阀，氧气洗瓶，氧气流量计，氧气除菌过滤器，氧气 分散器； C )、储液组件:包括氧合储液器，HA储液器，肝室，PV储液器，回流储液器，透气装置； d )、溫控组件:双孔和四孔恒溫水浴槽； e)、监控组件:在线溶解氧检测仪和在线pH检测仪； 本发明的有益效果在于:本发明利用高度差提供灌注压，即利用高度差产生的压力使 得培养液进入肝脏，灌注压的标定直接根据高度差单位mm出0来确定与表示。随时根据肝脏 状态变化调整高度差W调节灌注压。不仅能够为肝脏提供足够的液体进出量W实现氧气和 营养的供给，而且降低了对于肝脏微结构和微循环的剪切力伤害，是实现肝脏长期体外培 养的必要条件。本发明实现了无载体供氧，利用大剂量的氧气与培养液鼓泡超饱和氧合，使 得氧气在培养液中超饱和，并在氧气逸出前将随着培养液带入肝脏，从而使得肝脏获得足 够的氧气供给，实现无载体下的足量氧气供给。无载体供氧避免了血液W及血液制品使用 带来的感染危险，W及溶血、凝血等不利情况，同时还避免了免疫排斥反应对于肝脏造成的 损伤。
[0016] 目前同行业并无同类型技术，类似技术均为肝脏体外循环灌注。本技术能够实现 体外培养肝脏，模拟肝脏生理环境，使得肝脏各项指标接近生理标准，并且化加细胞增殖实 验表明，在本技术中，肝脏细胞实现了体外培养条件下的增殖。该证据充分表明本技术已经 在一定程度上实现了肝脏体外培养。本发明将直接作用于肝移植供体来源，利用人类幼体 肝脏，利用本发明技术进行体外培养，达到临床肝脏移植标准，供给临床肝脏移植需要。本 发明的的推广将实现肝移植供体来源的多元化，改变目前肝移植供体短缺的现状，并且对 于其他器官培养的实现具有参考价值和指导意义。
【附图说明】
[0017] 图1、悬吊式肝脏固定方式。
[0018] 图2、本发明的肝脏体外培养系统示意图。
[0019] 图3、大鼠肝脏体外培养化加细胞增殖检测结果。
【具体实施方式】
[0020] W下通过【具体实施方式】，对本发明进行详细说明。
[0021] 本发明提供了一种哺乳动物肝脏体外培养的方法，包括W下步骤： 1、术前准备： a、 动物麻醉，备皮，固定，并为动物提供保溫垫，麻醉方式为静脉注射，所用麻醉剂为戊 己比妥钢，用量为30mg/kg; b、 器械摆放:用干净桐巾将猪及手术台铺好，将手术刀，手术剪，綴子等器械按照手术 器械摆放原则摆放。
[0022] 2、原位灌注： a、 舰酒消毒:将舰酒棉球将猪右腿擦拭一遍，换另一干净棉球，将腹部中间向四周画圈 擦拭3次； b、 全身肝素化：用辅料綴挑起左腿皮肤(舰酒消毒），用剪刀剪开皮肤，暴露血管，注入 肝素至150U/kg; C、打开腹腔:器械开腹，用止血错将腹壁与桐巾夹住，拉至两边，用拉钩将术野暴露开， 搬移肠和脂肪； d、 动脉插管:将腹主动脉与下腔静脉剥离脊柱，埋入捆绑带与线，将下腔静脉与腹主动 脉剥离，将静脉结扎，将动脉上下端断流，其间剪口，插管，用预埋捆绑带捆好，再用预埋缝 合线结扎固定； e、 输尿管、膀脫、胆管的处理:用止血错夹紧胆囊，剥离肝脏与胆囊，在此操作之前将进 入胆囊的血管结扎，胆囊剥离下来之后结扎（SD大鼠操作时无需分离胆囊）。膀脫分离后清 除残余尿液，从尿道抽取，完毕结扎膀脫； f、 打开胸腔及上腔静脉插管:打开并暴露胸腔，找到肝脏与屯、脏之间的上腔静脉，用綴 子剥离，并利用上述方法d中动脉同样方法插管； g、 原位灌注:调节培养液动脉灌注流速，使其达到〇.5mL/minig肝脏，并将上腔静脉插 管引流废液导出； h、 n脉插管:找到口脉，埋线，剪开小日，插管，结扎。然后结扎口脉分支，并调节培养液 肝口静脉灌注流速，使其达到0.5mL/min ? g肝脏。
[0023] 3、肝脏离体： a、 肠系、脾胃结扎:先结扎肠系分支血管，肠系处的血管分支较多，结扎需分次逐步结 扎;然后结扎胃血管，且边结扎边分离;最后结扎脾血管分支。结扎完成后，远端剪断分离； b、 肾脏结扎:将肾脏周围的脂肪剥离，结扎肾脏动静脉血管，将肾脏分离;或者在步骤 2-d中将动脉插管深入，超过肾脏分支，则不必结扎； C、主动脉分支结扎:暴露主动脉分支，将分支逐一埋线，结扎，将肝脏上端主动脉结扎， 留线，方便固定； d、肝脏离体:将肝脏与其他组织连接剥离，保留整个隔肌，将肝脏完全分离。肝脏离体 前记录肝脏溫度;且在肝动脉、n静脉接上插管后待肝脏残血冲洗干净后测肝静脉溶解氧 值。原位灌注时要培养液需要保持低溫4°C。
[0024] 4、体外培养： a、 肝脏的固定及接入循环系统:首先将与肝脏连接的隔肌固定到硅胶板上，肝脏的主 动脉上端固定在与其相垂直的硅胶板上，找好位置，使得血管不扭转，将肝叶位置摆好，再 将主动脉与口脉用灭菌胶带和不诱钢图钉固定，将上腔静脉管固定好，使其流出顺杨，注意 流速保持低速，固定好后用止血错夹住插管，接入已经过排气操作的循环系统。将上腔静脉 流出管接到储液瓶相应管道上。记录流速情况； b、 调节溫度:通过恒溫水浴槽的溫度调节，保证肝脏处于恒溫38.5°C ; C、调节灌注压力:肝动脉入肝压力约为500mmH2〇，而口脉入肝压力约为50 mmH2〇; d、 调节灌注流量:调节入肝流量，动脉流量为0.5mL/min每克肝脏，n脉流量为0.5mL/ min每克肝脏； e、 调节溶解氧浓度:通过调节氧合鼓泡中氧气流速，使得测定的溶解氧值超出其量程 20mg/l; f、 调节抑:通过调节氧气与二氧化碳的输入比例，W及添加化HCO-3,使得培养液抑稳 定在7.35-7.45之间； g、 生化检测及血气分析:每30min取肝静脉流出液，测量其抑、溶解氧(DO值）、盐度、葡 萄糖浓度。每化取20mL流出液进行血气分析，检测项目为化\r、Cr、TC〇2、AnGap、Hct、pH、 PC02、W03\BUN、BE。
[0025] h、每隔24h取肝脏组织进行活检，将肝脏取不同部位的肝叶，大小为0.5x0.5cm的 小方块样，分别取肝内外胆管，放入装有甲醒的1.5mL离屯、管内保存。用封蜡切片法切片，在 光学显微镜下进行观察，取培养液离屯、检测细菌污染情况。
[0026] i、化加细胞增殖检测：在循环系统连接好之后加入化du，在培养中组织取样时用 I3rdu试剂盒进行检测。本实验所用的试剂盒为BioGenex生产的Super SensitiveTM* Polyme;r_HRP Detection System试剂盒，操作步骤按照试剂盒上的流程进行。若结果呈阳 性，则说明肝脏细胞出现增殖； j、每隔12h将系统中培养液进行更新，优化肝脏培养条件。
[0027] 实施例一使用本发明方法体外培养成体SD大鼠肝脏。
[00%] 1、用舰伏给大鼠腹部消毒3遍，将干净的灭菌过的小桐巾将大鼠盖好，暴露腹部， 盖上桐巾。摆好手术器械； 2、 打开腹腔，用止血错将皮肤与桐巾夹住，翻到两边，用敷料綴找出口脉与胆管，用止 血错将胆管处的肠子夹住，是胆管暴露清楚，用弯针埋线，胆管剪口，插入硬膜外导管，将埋 入的线绑紧，调节管道位置与角度，使胆汁自然流出； 3、 将腹主动脉与主静脉一起剥离脊柱，埋入线，用敷料綴与弯头綴将腹主动脉与主静 脉分离，用止血错断流，用小组织剪将腹主动脉剪口，插入1*2硅胶管，打结绑好，注意松紧 度； 4、 打开胸腔，将肝上下腔静脉找到，剥离粘附脂肪等，埋线，用止血错夹住主动脉弓，剪 口，插入输液管最前端细管，绑好，松开动脉处止血错，开始灌注，冲洗肝内血液； 5、 n脉埋线，剪口，插入1*2硅胶管，绑紧线，结扎左右两处口脉分支，开始口脉灌注； 6、 结扎到肠系的分支，有两支，注意别结扎到肝动脉； 7、 纯性分离胃与肝脏、脾脏，在胃与脾的口脉分支埋线，结扎，分离，剪掉食道与肝脏隔 肌之间的连接，剥离胃； 8、 将肾脏结扎分离，尤其是右肾的分支较短，穿针埋线时要注意 9、 暴露腹主动脉，结扎分支，在肝动脉分支处上部的腹主动脉上结扎留线； 10、 将肝脏黏连的隔肌，脂肪等分离，使肝脏离体； 11、 用1冲BS清洗肝脏； 12、 肝脏置于硅胶板上，在保证血管不扭曲的前提下，利用预留线与图钉固定主动脉， 将HA硅胶管用纱布擦干，绑灭菌胶带，用图钉固定在硅胶板上;相同方法固定PV，胆管及HV。 将硅胶板放入肝碗，并将硬膜外导管留出肝碗，用止血错夹住硅胶管HA与PV; 13、 通过管道连接接入循环系统； 14、 调节溫度:预先通过恒溫水浴槽的溫度调节，保证肝脏处于恒溫38.5°C ; 15、 调节灌注压:肝动脉入肝压力约为500mm出O，而口脉入肝压力约为50 mm出O; 16、 调节培养液流量：调节入肝流量，动脉流量为0.5mL/min每克肝脏，n脉流量为 0.5mL/min每克肝脏； 17、 调节溶解氧浓度:通过调节氧合鼓泡中氧气流速，使得测定的溶解氧值超出其量程 20mg/l; 18、 调节抑:通过调节氧气与二氧化碳的输入比例，W及添加化肥0-3,使得培养液抑稳 定在7.35-7.45之间； 19、 生化检测及血气分析:每30min取肝静脉流出液，测量其抑、溶解氧(DO值）、盐度、葡 萄糖浓度。每化取20mL流出液进行血气分析，检测项目为化\r、Cr、TC〇2、AnGap、Hct、pH、 PC02、W03\BUN、BE。
[0029] 20、每隔24h取肝脏组织进行活检，将肝脏取不同部位的肝叶，大小为0.5x0.5cm的 小方块样，分别取肝内外胆管，放入装有甲醒的1.5mL离屯、管内保存。用封蜡切片法切片，在 光学显微镜下进行观察，取培养液离屯、检测细菌污染情况。
[0030] 21、化加细胞增殖检测:在循环系统连接好之后加入化du，在培养中组织取样时用 I3rdu试剂盒进行检测。本实验所用的试剂盒为BioGenex生产的Super SensitiveTM* Polyme;r_HRP Detection System试剂盒，操作步骤按照试剂盒上的流程进行。若结果呈阳 性，则说明肝脏细胞出现增殖； 22、每隔12h将系统中培养液进行更新，优化肝脏培养条件。
【主权项】
1. 一种方法涉及(但不限于)体外培养已经离体的肝脏器官。2. 其特征在于模拟肝脏生理环境，提供肝脏生长所需要的各种条件，促进离体肝脏存 活和生长。3. 该方法包括:该方法包括肝脏原位灌注、肝脏离体和肝脏体外培养。4. 肝脏原位灌注包括利用低温条件、自制培养液和高度差灌注方式对肝脏进行原位灌 注。5. 肝脏离体时在继续灌注的前提下通过常规肝脏分离手术获取离体肝脏。6. 肝脏体外培养模拟肝脏体内生理环境，包括循环方式、肝脏灌注压、肝脏灌注量、供 氧方式、稳定酸碱度、温度恒定、力学条件，并利用自制肝脏体外培养系统培养离体肝脏。7. 如权利要求4所述，肝脏原位灌注是利用4 °C低温条件，降低肝脏细胞代谢速率，减小 肝脏原位灌注过程中的热缺血损伤。8. 如权利要求4所述，自制培养液为在细胞培养基RPMI1640培养基基础上，加入血清， 脂肪乳，青霉素，链霉素。9. 如权利要求6所述，循环方式为模拟肝脏两进一出的血液循环方式，通过高度差提供 压力输入，从肝动脉和肝门静脉灌注培养液，培养液从肝静脉流出并，并利用蠕动栗将流出 培养液抽回高处储液器。10. 如权利要求6所述，肝脏灌注压为肝动脉入肝压约为肝脏正常生理压力的20%-50%， 艮口35〇-80〇111111!12〇，而门脉入肝压约为5〇-10〇111111!12〇，约为正常门脉压（11〇-18〇111111!12〇)的 50%-80%〇11. 如权利要求6所述，肝脏灌注量为：动脉流量为0.5mL/min g肝脏，占总入肝流量 50%，门脉流量为0.5mL/min g肝脏，占总入肝流量50%。12. 如权利要求6所述，供氧方式为鼓泡式超饱和氧合方式供氧，气泡直径小于50μπι，并 利用95%〇2+5%C〇2和100%〇2调节不同比例供氧，并调节C0 2供应。13. 如权利要求6所述，稳定酸碱度为利用C02供应量变化(95%〇2+5%C〇2和100%02)以及酸 碱试剂如NaHC0 3的添加，稳定培养液pH为7.35-7.45，模拟正常pH条件。14. 如权利要求6所述，温度恒定为利用多层次精密控温水浴为肝脏提供恒温38.5 °C条 件。15. 如权利要求6所述，力学条件为将肝脏利用与其相连的膈肌以及血管进行水平和垂 直方向的三维悬吊固定，并利用肝脏浸没在培养液中产生的浮力，使得肝脏处于平衡状态， 保证肝脏微结构的正常和微循环的通畅。16. 如权利要求6所述，自制肝脏体外培养系统包括动力组件、氧合组件、储液组件、过 滤组件、温控组件、监控组件和回收组件，各组件能保证肝脏培养过程循环的稳定和环境条 件的稳定。17. 如权利要求16所述，动力组件包括最大流量为2000mL/min的蠕动栗。18. 如权利要求16所述，氧合组件包括氧气瓶，氧气减压阀，氧气洗瓶，氧气流量计，氧 气除菌过滤器，氧气分散器。19. 如权利要求16所述，储液组件包括氧合储液器，HA(肝动脉)储液器，肝室，PV(肝门 静脉)储液器，回流储液器，透气装置。20. 如权利要求16所述，过滤组件包括0.22μπι滤膜、0.45μπι滤膜以及正压气栗。21. 如权利要求16所述，温控组件包括双孔和四孔精密恒温循环水浴槽。22. 如权利要求16所述，监控组件包括在线溶解氧检测仪和在线pH检测仪。23. 如权利要求16所述，回收组件包括灌注液回收栗和回收储液器。
【文档编号】C12N5/071GK105838665SQ201610308560
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】许健健, 许莉莉, 其他发明人请求不公开姓名
【申请人】合肥华琪生物工程有限公司