多肽产品出厂检验中的杂质定量的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于定量测定出现在多肽产品中的杂质的方法，其中所述杂质不能从其它杂质或主产品中分离。该方法尤其涉及高分辨率质谱(MS)检测的使用，可联用或不联用高效液相色谱法(HPLC)。该方法可用于多肽和蛋白质，尤其是药用多肽和蛋白质的质量检测。
【专利说明】多肽产品出厂检验中的杂质定量
[0001] 本发明涉及一种用于定量测定出现在多肽产品中的杂质的方法，其中所述杂质不 能从主产品或其它杂质中分离。该方法尤其涉及高分辨率质谱（MS)检测的使用，可联用或 不联用高效液相色谱法（HPLC)。该方法可用于多肽和蛋白质，尤其是药用多肽和蛋白质的 质量检测。
[0002] 使用大家熟知的重组DNA和化学固相合成技术，一些蛋白质和多肽已被合成用做 药物。但是，这些蛋白质和多肽的制备过程中，往往会导致出现多种不期望的合成副产品。 尤其是当这些蛋白质和多肽是由固相合成法生产的时候更是如此。多肽/蛋白质的长度增 力口，导致所需的合成步骤增加，这些副产品可能存在于50%至70%的粗产品中。
[0003] 因此，合成的一个重要部分是从合成副产品中纯化主产品。纯化主要是通过色谱 方法进行的。作为药物产品的活性成分，最终纯化的多肽产品需要进行纯度方面的分析，这 也大多采用色谱方法进行。由于期望的多肽产品与非期望的合成副产品的分子结构差异与 整体结构相比很微小，这些产品的色谱特性可以是相同或几乎相同。这往往导致这些杂质 与其它杂质及主产品本身在层析分离中被共洗脱。
[0004] 选择性分析方法的发展是药用多肽产品组合物出厂检验中的一个关键方面。但由 于上述原因，使用色谱分离方法，甚至经过极大的努力也可能无法分离所有相关杂质。因 此，有必要提供一种新的方法，用于多肽产品中杂质的定量测定，尤其是不能通过色谱方法 定量地从所需的主产品分离出去的杂质的定量。
[0005] 本发明提供一种定量测定多肽产品组合物中杂质的方法，这些杂质不能通过色谱 方法从主产品中分离或与组合物中的其他杂质或其他成分共洗脱。这种方法可通过多肽利 西拉肽（Lixisenatide) (AVE0010)示例，利西拉肽（AVE0010)是一种44个氨基酸长度的 GLP-I激动剂。利西拉肽的氨基酸序列见SEQ ID NO: 1:
[0006] H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A -P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0007] 利西拉肽是由化学固相合成方法生产。通过色谱纯化过程，大多数杂质能从期望 的产品中分离出去。
[0008] 然而，两种杂质，Di-Ser(33)-AVE0010和Di-Ala(35)-AVE0010不能通过色谱方法 分离出去。这两种杂质的氨基酸序列如下：
[0009] Di-Ser(33)-AVEOO10(SEQ ID NO:2)
[0010] H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-S-G -A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0011] Di-Ala(35)-AVEOO10(SEQ ID NO:3)
[0012] H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A -A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0013] 由于利西拉肽是一种药用产品，尤其用于治疗糖尿病病人，上述杂质及其含量需 要测定，才能允许批量发售。本发明的
【发明者】现在发现可通过高分辨率的质谱技术，结合或 不结合先期的色谱方法，实现对上述杂质的定量分析。
[0014] 本发明的一个主题是提供一种定量测定出现在多肽产品组合物中的杂质的方法， 包括以下步骤：
[0015] a.提供一种多肽产品组合物，其包含一种多肽产品和至少一种未知量的杂质，其 中所述杂质不能通过色谱方法与组合物的多肽产品或另一种成分相分离；
[0016] b.提供至少一份无上述杂质添加的该多肽产品组合物样品，及可选的至少一种添 加了已知量的上述杂质的多肽产品组合物样品；
[0017] c.通过质谱法定量测定步骤b中至少一份样品中的所述杂质；
[0018] d.基于步骤c的结果，计算多肽产品组合物中所述杂质的量。
[0019] 本发明进一步的主题是提供一种用于定量测定存在于多肽产品组合物中的杂质 的方法，包括下列步骤：
[0020] a.提供一种多肽产品组合物，其包含一个多肽产品和至少一种未知量的杂质，其 中所述杂质不能通过色谱方法与组合物的多肽产品或另一种成分相分离；
[0021] b.提供至少三份多肽产品组合物样品，其中第一份样品含未添加所述杂质的多肽 产品组合物，并且其中至少两份另外的样品含有分别添加了不同已知量的上述杂质的多肽 产品组合物；
[0022] c.通过质谱法定量测定步骤b中至少三份样品中的所述杂质含量，及
[0023] d.基于步骤c的结果，计算多肽产品组合物中所述杂质的量。
[0024] 本发明进一步的主题是提供一种用于定量测定利西拉肽（AVE 0010)产品组合物 中杂质含量的试剂盒，包括：
[0025] (i)至少一种 Di-Ser (33)-AVE0010 备用品（stock preparation)，和 / 或
[0026] (ii)至少一种 Di-Ala(35)-AVE0010 备用品
[0027] 另外，本发明的进一步主题是提供一种对含有唾液素（exendin)多肽产品的 组合物进行质量控制的方法，其中的唾液素多肽产品包含氨基酸序列S-S-G-A，优选 的是含有利西拉肽（AVE0010)产品的组合物，该方法也包括对Di-Ser(33)_肽，例如 Di-Ser (33) -AVE0010,和 / 或 Di-Ala (35)-肽，例如 Di-Ala (35) -AVE0010 的定量测定。
[0028] 本发明涉及检测出现在一种多肽产品组合物中的杂质。术语"多肽产品"包括具 有至少5或10个氨基酸和高达50或100氨基酸或更长的多肽和蛋白质。多肽产品可含有 遗传编码的氨基酸结构单元或含有非遗传编码的氨基酸结构单元，例如非天然存在的氨基 酸，D氨基酸或化学修饰氨基酸，或含有几条相连的肽链，例如通过二硫键相连。多肽产品 可另外有N，C端，和/或侧链的修饰，例如酰化，酰氨化，或添加非肽侧链基团，例如亲脂基 团。多肽产品可以是线性，也可以是环状。优选的，多肽产品长度为5到100个氨基酸。
[0029] 多肽产品的合成中可涉及重组DNA方法和/或化学合成方法。优选的，所述多肽 产品化学合成，尤其是通过该领域大家所公认的固相合成技术，例如合成过程涉及与载体， 例如合成树脂，结合的肽链逐步延伸。在本发明的一个优选实施例中，所述多肽产品是唾液 素肽，例如唾液素-4,利拉鲁肽（Liraglutide)或利西拉肽（AVE0010)。多肽产品进一步的 例子是胰岛素和胰岛素类似物或DPP-4抑制剂。更优选地，所述肽产品是唾液素肽，例如包 含有氨基酸序列S-S-G-A的唾液素肽，最优选为利西拉肽（AVE0010)。
[0030] 本发明涉及多肽产品合成后其中杂质的定量测定，例如通过固相合成法合成后或 储存中的降解产品。所说杂质通常都多肽杂质，例如，和期望的多肽产品相差至少一个氨基 酸结构单元和/或化学修饰的多肽。例如，杂质可能是与期望的多肽产品相差至少一个二 聚氨基酸结构单元，例如一个Di-serine或Di-alanine结构单元。在唾液素肽例子中，例 如一个唾液素肽含有S-S-G-A氨基酸序列，杂质可能是例如一个Di-Ser (33)-唾液素肽，一 个Di-Ala (35)-唾液素肽或它们的组合。在利西拉肽的例子中，杂质可能是例如Di-Ser (3 3)-AVEOO10, Di-Aia (35)-AVEOO10 或它们的组合。
[0031] 本发明的方法包括定量测定多肽产品组合物中至少一种杂质。多肽产品组合物包 含至少一种多肽产品和至少一种需要定量的杂质。进一步，多肽产品组合物可含有其他成 分，例如包括杂质的肽类或非肽类成分。多肽产品组合物可以是例如药物制剂或用于生产 药物制剂，例如批量合成的多肽产品。
[0032] 本发明的方法中，多肽产品包含至少一种未知量的杂质，该杂质不能通过色谱方 法与多肽产品定量分离，或者和多肽产品样品中的其他杂质或成分共洗脱。在一些例子中， 多肽产品组合物含有一种未知量的杂质。在另一些例子中，多肽产品混合含有至少两种，例 如2, 3,4, 5,或更多种，这些未知量的杂质不能通过色谱方法与多肽产品定量分离，或者可 与多肽产品样品中其他杂质或成分共洗脱。优选地，该至少一种杂质不能与多肽产品定量 分离。
[0033] 术语"色谱方法"涉及适合用于多肽产品纯化的任一种色谱方法，包括例如：离子 交换层析，疏水相互作用层析，亲和层析，尺寸排阻色谱法，尤其是高效液相色谱（HPLC)，更 尤其是反相HPLC，或者几种方法的组合。
[0034] 本发明的方法所确定的杂质不能与多肽产品或该组合物的其它成分定量分离。这 意味着，色谱分离步骤之后，杂质与期望的多肽产品或其他杂质或成分共洗脱或基本上共 洗脱，尤其是在上述的色谱分离过程后更是如此，以至通过光学分析方法定量，例如紫外或 荧光检测是不可能的。这意味着，通过合理的努力，该杂质依然不能与期望的多肽产品或其 它成分分离，它在给定批次的多肽产品组合物中的含量需要通过本发明的方法定量测定。
[0035] 本发明的方法步骤a提供一种多肽产品组合物，其含有至少一种未知量的杂质， 这种杂质不能通过上述色谱方法与组合物的多肽产品或另一种成分分离。这种多肽产品可 能是例如药物用途产品，比如用于人兽医疗的药物。
[0036] 本发明的方法步骤b涉及提供至少一种无上述杂质添加的多肽产品组合物样品， 及可选的至少另一种添加了已知量的上述杂质的多肽产品组合物样品。在一个优选的是实 施例中，步骤b涉及提供至少三份多肽产品组合物样品，其中第一份样品含未添加所述杂 质的多肽产品组合物，并且其中至少两份另外的样品含有分别添加了不同已知量的上述杂 质的多肽产品组合物。
[0037] 至少一个样品是指未添加杂质的包含多肽产品组合物的样品，即未加标样品，含 有未知量的待测定杂质。除了这个样品，提供至少一份，例如两份，三份，四份另外的样品， 这些样品为加标样品，包含有未知量杂质的多肽产品组合物，以及另外添加的不同已知量 的待测定杂质。这些加标样品可以通过向未加标多肽产品组合物样品中添加杂质来制备， 杂质来自杂质备用品，优选通过至少两个包含不同浓度的杂质备用品制备。杂质备用品可 以是任何适当的形式，例如干或液体形式的制剂。优选的备用品为储存液。
[0038] 测试样品包括含有未知量待测定杂质的多肽产品及可选的添加杂质。这些化合 物以不同的浓度存在，允许通过质谱方法分析。多肽产品的浓度变动范围很大。可以是在 0· OOl ?50mg/ml，优选 0· 01-10mg/ml 或更优选是 0· 02 - 5. Omg/ml，例如约 I. Omg/ml。在 加标样品，加入的杂质量优选为样品中多肽产品浓度的〇. I %?5%，优选是0. 1-2%。
[0039] 在一个优选的实施例中，本发明的方法包括：对一个未加标的多肽产品样品进行 检测，同时对至少一份，优选是至少两份，三份或四份或更多的用至少一种杂质加标的样品 进行检测。在一个不同的实施例中，本发明的方法涉及仅对一个加标多肽产品样品进行检 测。未加标样品中的未知量杂质可以通过参考加标样品的测量来确定，和/或通过比较未 加标样品中杂质测量值与参照系，例如标准或校正曲线来确定。
[0040] 本发明的方法步骤c包括通过高分辨率质谱定量测定所述步骤b中至少一份样品 中的杂质。除了质谱法，测定方法可包括一个前期的色谱方法，比如为了使其他杂质与组合 物中的多肽产品或其他成分分离。优选质谱分析结合HPLC。每个样品可能要经过几次独立 测定，以提高测量的精确度。
[0041] 质谱是建立在测定带电粒子的质荷比基础上的。在一个典型的质谱过程中，样品 被加载到质谱分析仪上并气化。样品组分被电离，所得离子在质量分析器中被电磁场分 离。所得离子的探测信号被处理成质谱。对多肽产品的电离，电喷雾电离（ESI)和基质辅 助激光解吸/电离（MLDI)都可以使用。所得离子可以通过高度敏感的方法进行探测，例 如轨道讲（Orbitrap)或傅里叶变换（FT) -离子回旋共振（Fourier Transform(FT)-Ion Cyclotron Resonance) (ICR)探测系统。
[0042] 根据步骤c，至少一个与待测定杂质关联的峰通过质谱法进行分析。这个峰可以 是源自去卷积或非去卷积质谱。优选地，该方法涉及与待测定杂质相关联的一个或多个单 一同位素峰的判定。在杂质是Di-Ser (33)-AVE0010的情况下，在非去卷积质谱中例如位于 1237. 1529Da的四重带电峰或去卷积质谱中位于4944. 5822Da的四重带电峰都可以应用。 在杂质是Di-Ala (35)-AVE0010的情况下，在非去卷积质谱中例如位于1233. 1550Da的四重 带电峰或去卷积质谱中位于4928. 5908Da的四重带电峰都可用于分析。
[0043] 应用上述高分辨率设置和高灵敏度探测，可以在质谱中确定所述的至少一个需要 进行分析的杂质峰。
[0044] 步骤d包括基于所述质谱分析结果计算多肽产品组合物中杂质的含量。在一个更 优的实施例中，计算可以通过包括回归分析的方法，尤其是线性回归的方法来完成。回归分 析可以包括：从至少两份加标样品，即含未知量杂质的多肽产品组合物并分别添加了不同 已知量杂质的两份样品，从它们的杂质测量值生成一条曲线，例如一条直线（或从标准或 校正测量产生的此类样品的参考值）。在这条曲线上，比如一条直线，插入非加标样品中杂 质的测量值，并以此定量测定样品中未知量杂质的含量。
[0045] 优选地，通过如下线性直线方程来计算：
[0046] y = ax+b
[0047] 其中，y对应于样品中杂质的测定的峰面积（可以是加标或未加标样），X对应于 加标样品中杂质的已知添加量，a是直线的斜率，b是直线与y轴截距，对应于未添加杂质的 样品中杂质的测量信号（X = O)。未加标样品中的杂质xt，可以使用如下获得的回归参数 定量：
[0048] xt = b · a-1
[0049] 本发明还包括一种试剂盒，用于测定利西拉肽产品中的杂质含量，包括至少一种 Di-Ser(33)-AVE0010和/或Di-Ala(35)-AVE0010备用品，及可选的进一步试剂例如溶 齐U，缓冲液等。试剂盒可作为利西拉肽产品的一种质量控制方法，测定利西拉肽产品中的 Di-Ser (33)-AVE0010和/或Di-Ala (35)-AVE0010含量。优选地，定量测定通过质谱方法来 完成，比如上述质谱方法。
[0050] 本发明通过以下图表和实施例更详细地进行解释。
【专利附图】
【附图说明】
[0051] 图 1 显示了利西拉肽（AVE0010)，Di-Ser(33)-AVE0010 和 Di-Ala(35)-AVE0010 在 高效液相色谱中的共洗脱峰。
[0052] 图 2 显示了利西拉肽（AVE0010)及杂质 Di-Ser (33)-AVEOO10 和 Di-Ala (35)-AVEOO10的四重带电分子离子质谱。
[0053] 图3显示了非加标和加标（每种杂质1% )的AVEOO10制剂的质谱比较。
[0054] 图 4 显示了 Di-Ser (33)-AVE0010 在 m/z400 时，分辨率在 6, 000 和 100, 000 时各 自的质谱范围放大视野及重叠物质的理论计算模型。
[0055] 图5显示了重叠物质的理论计算模型的去卷积质谱。
[0056] 图6显示了用于定量Di-Ser (33)-AVE0010的杂质峰的放大视野。
[0057] 图7显示了一个检验样品中的Di-Ser(33)-AVE0010和Di-Ala(35)-AVE0010的四 重带电离子同位素的提取单离子色谱被显示为非去卷积质谱。
[0058] 图8显示了一个检验样品中的Di-Ser(33)-AVE0010和Di-Ala(35)-AVE0010的四 重带电离子同位素的提取单离子色谱被显示为去卷积质谱。
[0059] 图9显示了计算一个检验样品中杂质Di-Ala(35)_AVE0010浓度的例子。 实施例
[0060] Di-Ser (33)-利西拉肽和Di-Ala (35)-利西拉肽通过HPLC/S的定量分析方法。
[0061] 1.材料与方法
[0062] I. 1相关材料
[0063] 利西拉肽（AVE0010)相关材料：通过固相合成，随后进行纯化。
[0064] Di-Ser (33)-AVE0010相关材料：通过两步偶联的33位的丝氨酸保护固相合成，随 后进行纯化。
[0065] Di-Ala(35)-AVE0010相关材料：通过两步偶联的35位的丙氨酸保护固相合成，随 后进行纯化。
[0066] 利西拉肽的未加标样品试剂（含有未知量的杂质Di-Ser (33) -AVEOO10和 Di-Ala(35)-AVE0010)制备浓度为l·0mg利西拉肽/ml。
[0067] 四个加标样品试剂中杂质Di-Ser (33)-AVE0010或Di-Ala(35)-AVE0010的浓度 为：分别为LOmg利西拉肽/ml试剂质量的0.2% ,0.4% ,0.6%和0.8%。
[0068] L 2分析条件
[0069] 一个梯度高效液相色谱系统包括：二元HPLC泵，自动进样器，柱温箱，和一个高分 辨率质谱仪，例如m/z400分辨率在100, 000的LTQ-Orbitrap (ThermoFisher)，或其等效者。 [0070] 由C18反相HPLC分析柱（Jupiter C18 3um 300A)进行色谱，其长度为150mm，内 径为2. Omm。
[0071] 流动相A包含850体积单位的水，150体积单位的乙腈和1体积单位的三氟乙酸。 流动相B包含250体积单位的水，750体积单位的乙腈和1体积单位的三氟乙酸。浓度梯度 设置如下：
【权利要求】
1. 一种用于定量测定存在于多肽产品组合物中的杂质的方法，包括下列步骤： a. 提供一种多肽产品组合物，其包含一个多肽产品和至少一种未知量的杂质，其中所 述杂质不能通过色谱方法与组合物的多肽产品或另一种成分相分离； b. 提供至少一种无上述杂质添加的多肽产品组合物样品，及可选的至少另一种添加了 已知量的上述杂质的多肽产品组合物样品； c. 通过质谱法定量测定b步骤所述样品中的所述杂质； d. 基于步骤c的结果，计算多肽产品组合物中所述杂质的量。
2. -种用于定量测定存在于多肽产品组合物中的杂质的方法，包括下列步骤： a. 提供一种多肽产品组合物，其包含一个多肽产品和至少一种未知量的杂质，其中所 述杂质不能通过色谱方法与组合物的多肽产品或另一种成分相分离； b. 提供至少三份多肽产品组合物样品，其中第一份样品含未添加所述杂质的多肽产品 组合物，并且其中至少两份另外的样品含有分别添加了不同已知量的上述杂质的多肽产品 组合物； c. 通过质谱法定量测定b步骤所述样品中的所述杂质，及 d. 基于步骤c的结果，计算多肽产品组合物中所述杂质的量。
3. 如权利要求1或2的所述方法，其中的多肽产品具有5到100个长度的氨基酸。
4. 如权利要求1到3中任一项所述的方法，其中的多肽产品通过化学方法合成，尤其是 通过固相合成或通过重组DNA途径生产。
5. 如权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述多肽产品组合物为药物制剂或用 于生产药物制剂的组合物。
6. 如权利要求1到5中任一项所述的方法，其中多肽产品是一种唾液素多肽，尤其是利 西拉肽（AVE0010)。
7. 如权利要求1到6中任一项所述的方法，其中杂质是多肽杂质。
8. 如权利要求1到7中任一项所述的方法，其中杂质不能通过高效液相色谱（HPLC)， 尤其是通过反相HPLC的方法与该组合物的多肽产品或另一种成分定量分离。
9. 如权利要求1到8中任一项所述的方法，其中多肽产品包含至少2种未知量的杂质， 该杂质不能通过色谱方法与该组合物的多肽产品或另一种成分定量分离。
10. 如权利要求1到9中任一项所述的方法，将杂质加入到至少一个多肽产品组合物样 品中，该样品来自备用品，优选的，来自含有不同浓度杂质的至少两种备用品。
11. 如权利要求1到10中任一项所述的方法，其中，提供至少3个或4个其它添加了不 同已知量杂质的样品，并进行质谱测定。
12. 如权利要求1到11中任一项所述的方法，其中，所述质谱法是高分辨率质谱法，如 包括傅立叶变换质谱法。
13. 如权利要求1到12中任一项所述的方法，其中计算包括线性回归分析方法。
14. 权利要求13所述的方法，其中计算通过以下方程进行： y = ax+b 其中a =斜率 y =样品中杂质的测定的峰值面积 X =样品中杂质的添加量 b =截距 杂质的未知量xt可通过以下方程求得 xt = b · a-1
15. -种用于测定利西拉肽（AVE 0010)产品组合物中杂质含量的试剂盒，包括 (i) 至少一种Di-Ser (33) -AVE0010备用品，和/或 (ii) 至少一种 Di-Ala(35)-AVE0010 备用品
16. -种用于含有唾液素多肽产品的组合物质量控制的方法，唾液素多肽产品中有 S-S-G-A氨基酸序列，优选的该组合物包括利西拉肽（AVE0010)产品，该方法也包括定量测 定上述组合物中的 Di-Ser (33)-肽，如 Di-Ser (33) -AVE0010 和 / 或 Di-Ala (35)-肽，如 Di-Ala(35)-AVE0010。
17. 如权利要求16所述的方法，其中根据权利要求1到14中任一项的方法进行定量测 定。
【文档编号】G01N33/68GK104246508SQ201380020553
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月25日 优先权日:2012年4月27日
【发明者】M·沃格尔, W·米勒 申请人:赛诺菲-安万特德国有限公司