和定量评估 样品中完整IGF-I的量。通过比较观察到的m/z范围为约1092至1095. 3的光谱与根据天 然存在的同位素分布计算的光谱，进行定性评估（即，基于同位素"签字"确认IGF-I的同 一性）。观察的和计算的光谱分别显示在图8A和8B中。
[0124] 用来自单同位素形式（对应的理论m/z为约1093. 5209)的数据和来自多同位 素形式的求和数据进行量化评估。来自单同位素形式的数据用于产生柱上20fmol至 2600fmol完整IGF-I的线性校准曲线。这对应于样品浓度为约8. 2ng/mL至约1054ng/ mL(样品大小为IOOyL)的线性观察。完整IGF-I和内标收集的数据呈现在下面表1中。 校准曲线显示在图9A(测试的整个浓度范围）和9B(浓度范围下端的放大图）。完整IGF-I 的拟合优度（R2)值为〇. 9996。
[0125] 表1.用于校准曲线的完整IGF-I和内标（完整重组小鼠IGF-I)测定
[0126]
[0127]实施例4:高分辨率/高准确度TOFMS量化完整IGF-I的准确度和精确度
[0128] 分析来自6个QC库（室内QC库和Bio-Rad肿瘤标记对照）的每个的10个重复样 品，产生分析间精确度（intra-assayprecision)。通过以 100ng/mL、400ng/mL和 741ng/ mL的水平将已知量的IGF-I掺入处理血清（strippedserum)制备3个QC库。样品的10 个重复的变异系数（CV)用于评估定量的再现性。来自这些分析的数据呈现在表2(室内QC 库）和表3 (Bio-Rad肿瘤标记对照）中。
[0129] 表2.使用室内QC库的完整IGF-I分析间变异
[0130]
[0131] 表3.使用Bio-Rad肿瘤标记对照的完整IGF-I分析间变异
[0132]
[0133] 对定量结果进行的统计表明6个QC库的再现性（CV)对于掺入的室内QC库范围 为从2. 4%至4. 4%而对于Bio-Rad肿瘤标记对照范围为从1. 8%至2. 2%。
[0134] 分析间变异定义为分析之间测量的再现性。与上面相同的6个QC库评估5天。来 自这些分析的数据呈现在表4 (室内QC库）和表5 (Bio-Rad肿瘤标记对照）中。
[0135] 表4.室内QC样品的完整IGF-I分析间变异
[0140] 这些测量的结果表明库的分析间变异（％CV)，对于掺入的室内QC库范围为从 1. 3%至6. 1 %并且对于Bio-Rad肿瘤标记对照范围为从0. 8%至3. 3%。对于低、中和高度 掺入的室内QC样品，总体变异分别为5. 0 %、5. 2 %和3. 5 %，而对于低、中和高度的Bio-Rad QC材料，总体变异分别为3. 3%、3. 1 %和2. 8%。
[0141] 分析间准确度定义为单个分析内测量的准确度。每个室内QC库被重复10次分 析，以测定重复测量完整IGF-I的准确度。QC库的结果为3个库分别产生约103%、99%和 102 %的准确度。
[0142] 分析间准确度定义为分析之间的测量准确度。4天5次试验7次重复分析3个QC 库，以测定测量完整IGF-I的准确度。QC库的分析结果为3个库分别产生104%、103%和 103%的总体准确度。这些结果在可接受的准确度范围80%至120%内。
[0143]实施例4:用高分辨率/高准确度TOFMS量化完整IGF-I的分析物测量范闱
[0144] 制备9个掺入浓度范围为15ng/mL至2000ng/mL的完整IGF-I的处理血清样品。 这些样品接着在分开的5天进行分析以评估分析物检测范围和检测的线性。来自5个连续 分析的加权线性回归产生〇. 995或更大的相关系数，准确度±20%。因此，分析可量化的范 围是至少15ng/mL至2000ng/mL。表明反应线性的结果图显示在图10中。
[0145]实施例5:用高分辨率/高准确度TOFMS限宙完整IGF-I量化的检测限/下限
[0146] 检测限（LOD)是如此点，在该点下测量值大于与其相关的不确定度并被任意地定 义为与零浓度的四倍的标准差（SD)。空白被测量22次并且所得面积比被反算，以确定完整 IGF-I的LOD为 4. 9ng/mL。
[0147] 定量的下限（LLOQ)是测量的值是量化上有意义的点。在该LLOQ下，分析物的响应 是可鉴定的、离散的和可重现的，精确度优于或等于20%，准确度在85%至120%之间。通 过在接近期望的LLOQ浓度（4. 9ng/mL、7. 8ng/mL、15. 6ng/mL、31. 2ng/mL和 62. 5ng/mL)分 析5个不同样品确定LLOQ，并在5天7个试验中评估分析间再现性。这些分析表明对于完 整IGF-I，LLOQ是 15ng/mL。
[0148]实施例6:用高分辨率/高准确度TOFMS掺入回收（加标回收，SDikerecovery) 完整IGF-I
[0149] 通过用具有另外的完整IGF-I的已知低水平的完整IGF-I掺入患者血清达到 50ng/mL、100ng/mL、400ng/mL和lOOOng/mL的最终浓度，进行回收研究。分析掺入的样品， 并且结果对完整IGF-I的背景水平进行校正。对每个掺入的浓度计算回收，平均回收分别 是约100%、96%、97%和92%。来自这些研究的数据显示在表6中。
[0150] 表6.患者血清中完整IGF-I的掺入回收研究
[0151]
[0152]实施例7:量化完整IGF-I的方法间相关性（Inter-methodcorrelation)
[0153] 分开来自100个患者的样品并用上述LC-MS方法分析。部分样品也使用下列进行 分析：Siemens IMMULITE 2000 免疫分析系统（Siemens Healthcare Diagnostics，Inc.)、 the Meso Scale Discovery SECTOR 系统（Meso Scale Discovery)和 RIA 方法（通过 Esoterix，Inc.，测试编号500282，酸：醇提取后阻断RIA)。100个分开的样品中，60个用IMMULITE系统分析。
[0154] 通过Deming回归分析来自4种方法的数据。比较的结果显示在表7中。LC-MS分 析被表明与RIA方法具有最好的一致性（agreement)。
[0155] 表7.比较4个完整IGF-I分析方法的Deming回归分析
[0156]
[0157]实施例8:完整IGF-I干扰研究
[0158] 通过滴定溶解的红血细胞至患者血清，确定评估的血红蛋白浓度为Omg/mL、 2. 5mg/mL、5mg/mL、7. 5mg/mL、lOmg/mL和 20mg/mL，来评估溶血对完整IGF-I测定的影响。如 所描述滴定3个不同患者样品，并提取用于完整IGF-I分析。结果与非掺入库结果相比较 并且计算差值百分数。该比较产生的数据呈现在表8中。
[0159] 表8.患者血清样品中完整IGF-I的溶血性干扰研究
[0160]
[0161] 如在表8中可见，所有全血掺入的样品产生可接受的结果（80%-120%的对照值） 并且表明完整IGF-I检测和血红蛋白浓度之间没有依赖性。因此，显示轻微至中度溶血的 样品是可接受的。
[0162] 通过滴定脑脂质提取物至患者血清中，确定评估的脂质浓度为0mg/mL、2. 5mg/mL、 5mg/mL、7. 5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL，来评估脂血对完整IGF-I测定的影响。如所描述的， 滴定3个不同患者样品，并提取用于IGF-I分析。结果与非掺入库结果相比较并且计算差 值百分数。该比较产生的数据呈现在表9中。
[0163] 表9.患者血清样品中完整IGF-I的脂血性干扰研究
[0164]
[0165] 如在表9中可见，所有脂质掺入的样品产生可接受的结果（对照值的 80% -120% )并且表明完整IGF-I检测和脂质浓度之间没有依赖性。因此，显示轻微至中 度脂血的样品是可接受的。
[0166] 通过滴定胆红素至患者血清，以确定评估的胆红素浓度为0mg/mL、0. 25mg/mL、 0? 5mg/mL、0. 75mg/mL、lmg/mL和2mg/mL，而评估胆红素对完整IGF-I测定的影响。如所描 述的，滴定3个不同患者样品，并提取用于完整IGF-I分析。结果与非掺入库结果相比较并 且计算差异百分数。该比较产生的数据呈现在表10中。
[0167] 表10.患者血清样品中完整IGF-I的胆红素干扰研究
[0168]
[0169] 如在表10中可见，所有胆红素掺入的样品产生可接受的结果（对照值的 80% -120% )并且表明完整IGF-I检测和胆红素浓度之间没有依赖性。因此，显示轻微至 中度胆红素的样品是可接受的。
[0170] 通过滴定重组IGFBP-3至患者血清，确定评估的IGFBP-3浓度为0mg/L、2mg/L、 5mg/L、8mg/L和9mg/L，来评估IGFBP-3对完整IGF-I测定的影响。如所描述的，滴定3个 不同患者样品，并提取，在它们制备的3小时内进行完整IGF-I分析。另一组15个患者样 品用IGFBP-3掺入至最终浓度为5mg/L并在4°C下平衡3天然后提取。在两个实验中，结果 与非掺入库结果相比较并且计算差值百分数。这些比较产生的数据分别呈现在表11和12 中。
[0171] 表11.患者血清样品（制备后3小时提取）中IGFBP-3对完整IGF-I的干扰研究
[0172]
[0173] 表12.患者血清样品（制备后3天提取）中IGFBP-3对完整IGF-I的干扰研究
[0174]
[0175] 如在表11和12中可见，所有IGFBP-3掺入的样品产生可接受的结果（对照值的 80% -120% )并且表明完整IGF-I检测和IGFBP-3浓度之间没有依赖性。因此，IGFBP-3 没有显示出对IGF-I分析的干扰。
[0176]实施例9:IGF-I样品类铟研究
[0177] 在4个Vacutaine丨货类型：血清、柠檬酸盐血浆、肝素血浆和EDTA血浆中收集10 个患者库。检测来自每个样品类型的样品中的完整IGF-I水平。成双方差分析（ANOVA)仅 指出血清和柠檬酸盐血浆之间的统计学显著差异。这指示血清、肝素血浆和H)TA血浆是可 接受的样品类型。来自这些研究的数据呈现在表13中。
[0178] 表13.样品类型对IGF-I定量的影响
[0179]
[0180]实施例10 :富集IGF-II蛋白或片段
[0181] 使用脱机样品制备和随后的联机SPE和HPLC的组合从校准样品、QC样品和患者 血清样品中提取完整人IGF-II。如下进行酸乙醇提取。
[0182] 100^的每个样品用400 1^的酸/乙醇（87.5%￡切11/12.5%21111(：1)处理以形 成沉淀。混合物进行离心以获得上清液和颗粒状物。接着取出350yL的上清液，与60yL 1.5MTris碱混合，并在-20°C下温育1小时。温育的混合物接着进行离心并丢弃用添加 Tris碱形成的任何沉淀。上清液接着直接施加至HPLC柱用于质谱分析。
[0183] 上面的样品制备后，所得溶液被注入CohesiveLC系统用于联机SPE和HPLC处 理，然后进行质谱分析。使用Phenomenex单片OnyxC18保护柱体（10X4. 6mm)作为联 机SPE柱完成联机提取和富集完整人IGF-II。通过HPLC用PhenomenexOnyx单片C18柱 (50X2.Omm)完成分析分离。
[0184]实施例11:用高分辨率/高准确度TOFMS检测和量化完整IGF-II
[0185]使用Agilent6530Accurate_MassQ-TOFMS系统（AgilentTechnologies， Inc.)进行MS。该系统采用具有高分辨率/高准确度MS的高分辨率/高准确度TOFMS 分析仪。当测量完整IGF-II时，该仪器展示的分辨本领为约21，000FWHM，并且质量准确 度为约 3ppm。下列软件用于这些实验：AgilentMassHunterWorkstationAcquisition B. 02.01 ；Agilent MassHunter Quantitative Software B. 03. 02 ；Agilent MassHunter Qualitative software B.02.00 ;和Cohesive Aria OS v.I.5.I。
[0186] 从完整人IGF-II的高分辨率/高准确度质谱分析产生的、表明完整IGF-II离子 处于8+、7+、6+和5+电荷状态的示例性光谱显示在图11中。在约400至2000的m/z范围收 集该光谱。如在图11中所显示，来自不同电荷状态的峰出现在约934. 57、1067. 94、1245. 76 和 1494. 71 的m/z处。
[0187] 从完整人IGF-II的高分辨率/高准确度质谱分析产生的、表明完整IGF-II离子 处于7+电荷状态的示例性光谱显示在图12中。在约1066至1070的m/z范围收集该光 谱。如在图12中所显示，来自天然存在的同位素的峰出现在约1067. 36、1067. 51、1067. 65、 1067.80、1067. 94、1068. 08、1068. 23、1068. 37、1068.51、1068.65、1068. 80、1068. 94 和 1068. 08 的m/z比处。
[0188] 收集m/z为约1067. 94和1068. 08的两个同位素形式的完整人IGF-II离子的数 据，并且定性和定量评估样品中完整人IGF-II的量。通过将在106. 94和1068. 08处峰的实 验同位素比例与从天然存在的同位素分布计算的理论比例进行比较，进行定性评估（即， 基于同位素"签字"确认IGF-II的同一性）。
[0189] 用上面所指出的两种同位素形式的求和进行量化评估。产生约15ng/mL至约 2000ng/mL的完整人IGF-II的校准库浓度的线性校准曲线。对完整人IGF-II收集的数据 呈现在下面表14中。所测试的全浓度范围的校准曲线显示在图13中。完整人IGF-II的 拟合优度（R2)值是〇. 9998。
[0190] 表14.用于校准曲线的完整人IGF-II测定
[0191]
[0192]实施例12:用高分辨率/高准确度TOFMS量化完整IGF-II的准确度和精确度
[0193] 分析来自6个QC库（3个室内QC库和3〇ff-the-cl〇t(未凝结的）人血清样品） 的每个的8个重复样品产生分析间精确度。样品的8次重复的变异系数（CV)用于评估定 量的再现性。来自这些分析的数据呈现在表15(室内QC库）和表16(〇ff-the-cl〇t人血 清样品）中。
[0194] 表15.使用室内QC库的完整IGF-II分析间变异
[0195]
[0199] 对定量结果进行的统计表明6个QC库的再现性（CV)对于掺入的室内QC库范围 为从2. 1%至4. 7%和对于off-the-clot人血清样品范围从2. 0%至7. 7%。
[0200] 分析间准确度定义为单个分析内测量的准确度。室内QC库中完整人IGF-II的 重复测量对于200ng/mL、500ng/mL和1200ng/mL的库分别产生约100. 7 %、100. 7 %和 100. 4 %的精确度。
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