0、1093. 5167、1093. 6597、 1093. 8028、1093. 9458、1094. 0889、1094. 2319、1094.3754、1094.5185、1094.6606、和 1095. 3717被观察到。但是，注意因为仪器的不同，观察到的任何离子的同位素变体的精确 质量可能稍微不同（例如，±0. 1)。
[0094] 表明m/z范围在约1067. 0-1069. 5内的、这种多重同位素形式的IGF-II离子的另 一示例性光谱见图12。如示例性光谱所见，在下列m/z观察到来自各种同位素形式的峰： 约 1067.36、1067.51、1067.65、1067.80、1067.94、1068.08、1068.23、1068.37、1068.51、 1068. 65、1068. 80、1068. 94和1068. 08。再一次，因为仪器的不同，观察到的任何离子的同 位素变体的精确质量可能稍微不同。
[0095] 在质谱技术中，一般而言，可使用数种检测模式检测离子。例如，所选择的离子可 被检测，即，使用选择性离子监测模式（S頂)，或可选地，可使用扫描模式检测离子。当以 扫描模式操作时，质谱仪通常向使用者提供离子扫描；即，具体质量/电荷在给定范围（例 如，100至1000 amu)的每种离子的相对丰度。进一步，当使用能够成倍增加质谱事件（mass spectrometricevent)的仪器如某些离子讲或三重四极仪器时，源自碰撞诱导的离解或中 性损失的质量转移可被监测，例如，多反应监测（MRM)或选择反应监测（SRM)。
[0096] 分析物分析的结果，S卩，通过本领域已知的许多方法，质量光谱可与初始样品中分 析物的量相关。例如，假设取样和分析参数被小心地控制，给定离子的相对丰度可与将该相 对丰度转换为初始分子的绝对量的表相比较。可选地，内标或外标可与样品一起过柱，并且 基于从这些标准所产生的离子构建标准曲线。使用这种标准曲线，给定离子的相对丰度可 转换成初始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，一种或多种标准用于产生标准曲线， 用来计算IGF-I和/或IGF-II蛋白的数量。产生和使用这种标准曲线的方法是本领域已 知的并且技术人员能够选择合适的内标。例如，在优选的实施方式中同位素标记的或未标 记的完整非人IGF-I和/或IGF-II(例如，重组小鼠IGF-I和/或IGF-II)或同位素标记 的完整人IGF-I和/或IGF-II可用作标准。将离子的量与初始分子的量关联的许多其他 方法是本领域技术人员熟知的。
[0097] 如本文所使用，当通过质谱技术分析时，"同位素标记"在标记的分子中相对于未 标记的分子产生质量移动。合适的标记的例子包括氘（ 2H)、13C和15N。同位素标记可结合在 分子的一种或多种位置上并且一种或多种类型的同位素标记可用在相同的同位素标记的 分子上。
[0098] 方法的一个或多个步骤可使用自动化机器实施。在某些实施方式中，一种或多种 纯化步骤联机实施，并且更优选地所有纯化和质谱法步骤可以以联机方式进行。
[0099] 在一些实施方式中，如下使用MS检测和/或量化样品中的完整IGF-I和/或 IGF-II。样品进行液相色谱法，优选地HPLC;来自色谱柱的液体溶剂流进入ESI电离源的加 热的喷雾器界面；和在界面的加热的带电管中，将溶剂/分析物混合物转变为蒸汽。通过施 加大电压至溶剂/分析物混合物，包含在溶剂中的分析物（例如，完整IGF-I和/或IGF-II) 被电离。随着分析物离开界面的带电管，溶剂/分析物混合物雾化并且溶剂蒸发，留下各种 电荷状态的分析物离子。接着收集一种或多种离子的强度的定量数据。接着收集一种或多 种离子的信号强度的定量数据并且与样品中完整IGF-I和/或IGF-II的数量相关联。
[0100] 对于完整IGF-I，可观察下列m/z范围的各种电荷状态的离子：约850. 8±2(9+)、 957. 1±2(8+)、1093.7±2(7+)和 1275.8±2(6+)。在一些实施方式中，收集m/z在约 1093. 7±2范围内的一种或多种IGF-I离子的数据并用于定量。该m/z范围内的示例性离 子包括下列m/z的IGF-I离子：约 1091. 9±0. 1、1092. 8±0. 1、1092. 9±0. 1、1093. 1±0. 1、 1093. 2±0. 1、1093. 4±0. 1、1093. 5±0. 1、1093. 7±0. 1、1093. 8±0. 1、1093. 9±0. 1、 1094. 1±0. 1、1094. 2±0. 1、1094. 4±0. 1、1094. 5±0. 1、1094. 7±0. 1 和 1095. 4±0. 1。 该列举并不意味着是限制性的。许多其他离子可适合用于该即时方法（instant method)，如显示在图3中的光谱所表明（其表明检测m/z为下列的同位素离子组：约 828. 0509±2、850. 7373±2、871. 8730±2、920. 5544±2、939. 6930±2、956. 9532±2、 975. 4576±2、1034. 8128±2、1051. 6337±2、1073. 9335±2、1093. 6597±2、1114. 5219±2、 1207. 9401±2、1226. 5705±2、1252. 5871±2 和 1275. 6019±2;但是，注意如上在这些范围 内单个同位素的离子主要落在所叙述m/z±l的范围内。而且，在该精确度水平上，因为仪 器的不同，观察到的任何离子的质量可能稍微不同，例如±0. 1)。
[0101] 对于完整IGF-II，可观察m/z在下列范围内的各种电荷状态的离子：约 934. 69 ± 2 (8+)、1068. 07 ± 2 (7+)、1245. 92 ± 2 (6+)和 1494. 89 ± 2 (5+)。在一些实施方 式中，收集来自m/z范围在约1068. 07±2内的一种或多种IGF-II离子的数据并用于定 量。该m/z范围内的不例性尚子包括具有下列m/z的IGF-II尚子：约1067. 36±0. 1、 106 7. 51+0.Ul067. 65 + 0.Ul067. 80 + 0.Ul067. 94 + 0.Ul068. 08 + 0.U 1068. 23±0. 1、1068. 37±0. 1、1068. 51±0. 1、1068. 65±0. 1、1068. 80±0. 1、1068. 94±0. 1 和1069. 08±0. 1。在一些实施方式中，一种或多种IGF-II离子选自m/z为约1067. 94±0. 1 和1068. 08±0. 1的IGF-II离子。该列举并不意味着是限制性的，并且其他离子可适合用 于该即时方法。
[0102] 在一些实施方式中，使用高分辨率/高准确度质谱仪可允许选择来自单个离子单 个同位素形式的峰的信号强度（如显示在图4中单个IGF-I离子峰的m/z为约1093. 66,或 显示在图12中的单个IGF-II峰的m/z为约1067. 80)用于获取数据。可选地，来自单个离 子的一种或多种同位素形式（如图4和12中所表明的一种或多种IGF-I或IGF-II同位素 形式）的信号强度的定量数据，或窄m/z范围的信号强度（如m/z范围为约1093. 7±1的 所有IGF-I信号强度，或m/z范围为约1068. 2±1的所有IGF-II信号强度）可被收集并与 样品中完整IGF-I和/或IGF-II的数量相关联。
[0103] 在一些实施方式中，收集来自至少两个不同电荷状态的一种或多种IGF-I和/或 IGF-II离子的信号强度的定量数据。这些离子的强度可接着用于量化评估样品中的完整 IGF-I和/或IGF-II。例如，IGF-I可用一种或多种8+电荷状态的IGF-I离子（S卩，m/z范 围为约957. 1±2内的IGF-I离子）和一种或多种7+电荷状态的IGF-I离子（S卩，m/z范 围1093. 7±2内的IGF-I离子）的信号强度量化。在收集两个或多个离子的信号强度的定 量数据的实施方式中，该强度可结合本领域任何数学方法（如求和，或平均曲线下面积）， 用于量化评估样品中完整IGF-I和/或IGF-II。
[0104] 当离子碰撞探测器时，它们产生电子脉冲，其被转变成数字信号。获得的数据依赖 于计算机，其绘制所收集离子的计数对时间的图。所得质量色谱图类似于传统HPLC-MS方 法产生的色谱图。可测量对应于具体离子的峰下面积，或这种峰的振幅，并使之与关注分 析物的量相关联。在某些实施方式中，测量曲线下面积，或峰的振幅以确定IGF-I和/或 IGF-II蛋白或片段的量。如上述，可基于内分子标的一种或多种离子的峰，使用校准标准曲 线将给定离子的相对丰度转化为初始分析物的绝对量。
[0105] 在一些实施方式中，IGF-I和IGF-II同时被量化。在这些实施方式中，IGF-I和 IGF-II每个可通过上面提供的任何方法量化。
[0106] 在某些优选的实施方式中，对于IGF-I，定量的下限（LLOQ)在约15.Ong/mL至 200ng/dL范围内，包括 15.Ong/mL和 200ng/dL;优选地在约 15.Ong/dL至lOOng/mL范围 内，包括15. 0ng/dL和100ng/mL;优选地在约15. 0ng/mL至50ng/mL范围内，包括15.Ong/ mL和 50ng/mL;优选地在约 15.Ong/mL至 25ng/mL范围内，包括 15.Ong/mL和 25ng/mL;优 选地在约15.Ong/mL至15ng/mL范围内，包括15.Ong/mL和15ng/mL;优选地在约15.Ong/ mL至lOng/mL范围内，包括 15.Ong/mL和lOng/mL;优选地约 15.Ong/mL。
[0107] 在某些优选的实施方式中，对于IGF-II，定量的下限（LLOQ)在约30.Ong/mL至 200ng/dL范围内，包括 30.Ong/mL和 200ng/dL;优选地在约 30. 0ng/dL至lOOng/mL范围 内，包括30. 0ng/dL和lOOng/mL;优选地在约30.Ong/mL至50ng/mL范围内，包括30.Ong/ mL和50ng/mL;优选地在约30.Ong/mL至25ng/mL范围内，包括30.Ong/mL和25ng/mL;优选 地在约30.Ong/mL至15ng/mL范围内，包括约30.Ong/mL和15ng/mL;优选地在约30.Ong/ mL至lOng/mL范围内，包括 30.Ong/mL和lOng/mL;优选地约 30.Ong/mL。
[0108] 在某些优选的实施方式中，对于IGF-I，检测限（LOD)在约4. 9ng/mL至200ng/mL 范围内，包括4. 9ng/mL和200ng/mL;优选地在约4. 9ng/mL至lOOng/mL范围内，包括4. 9ng/ mL和100ng/mL;优选地在约4. 9ng/mL至50ng/mL范围内，包括4. 9ng/mL和50ng/mL;优选 地在约4. 9ng/mL至25ng/mL范围内，包括4. 9ng/mL和25ng/mL;优选地在约4. 9ng/mL至 20ng/mL范围内，包括 4. 9ng/mL和 20ng/mL;优选地约 4. 9ng/mL。
[0109] 在某些优选的实施方式中，对于IGF-II，检测限（LOD)在约8. 2ng/mL至200ng/mL 范围内，包括8. 2ng/mL和200ng/mL;优选地在约8. 2ng/mL至lOOng/mL范围内，包括8. 2ng/ mL和lOOng/mL;优选地在约8. 2ng/mL至50ng/mL范围内，包括8. 2ng/mL和50ng/mL;优选 地在约8. 2ng/mL至25ng/mL范围内，包括8. 2ng/mL和25ng/mL;优选地在约8. 2ng/mL至 20ng/mL范围内，包括 8. 2ng/mL和 20ng/mL;优选地约 8. 2ng/mL。
[0110] 下列实施例用于图解本发明。这些实施例绝不打算限制本方法的范围。尤其，下 列实施例通过使用具体内标的质谱法表明IGF-I和IGF-II蛋白或片段的量化。使用所指 出的内标并不意味着以任何方式是限制性的。容易被本领域人员测定的任何合适的化学种 类可用作内标。
[0111] 实施例
[0112] 实施例1 :富集IGF-I蛋白或片段
[0113] 使用简单制备和随后的联机SPE的组合从血清样品中提取完整的IGF-I。如下进 行酸乙醇提取。
[0114] 100 1^的每个血清样品用400 1^的酸/乙醇（87.5%￡切11/12.5%21111(：1)处理 以形成沉淀。混合物进行离心以获得上清液和颗粒状物（沉淀，pellet)。接着取出400yL 的上清液并与60yL1.5MTris碱混合。添加Tris碱形成的任何沉淀被滤除并丢弃。滤 出液通过联机稀释系统用水中5%的甲酸稀释以降低乙醇浓度至溶液中的IGF-I可结合至 提取柱的足够水平。
[0115] 稀释的提取样品被注入CohesiveLC系统用于联机SPE和HPLC处理，然后进行质 谱分析。使用Phenomenex单片OnyxC18保护柱体（10X4. 6mm)作为联机SPE柱完成IGF-I 的联机提取和富集。通过HPLC用PhenomenexOnyx单片C18柱（50X2.Omm)完成分析分 离。
[0116]实施例2:用高分辨率/高准确度轨道阱MS检测和量化完整IGF-I
[0117] 使用ThermoExactiveMS系统（ThermoElectron公司）进行MS。该系统采用具 有高分辨率/高准确度MS的轨道阱MS分析仪。当测量完整IGF-I时，该仪器展示的分辨 本领为约25, 000FWHM，并且质量准确度为约lppm。
[0118] 用ESI源以阳离子模式，进行电离。用约851、957、1094和1275的m/z，对应于 [IGF-I+nH]n+(n分别=9+、8+、7+和6+)的离子，观察多电荷完整IGF-I离子的种类。显示 1094离子的同位素"签字"的全扫描光谱和该光谱的放大部分分别出现在图3和4中。
[0119] 单个同位素形式的两个最强离子--对应于m/z为约956. 9532和1093. 6592的 离子同位素形式一一所收集的数据被求和并用于量化评估样品中完整IGF-I的量。从柱上 31fmol至4000fmol的完整IGF-I制作的校准曲线中，观察到了线性。该曲线显示在图5 中。天然完整IGF-I的拟合优度（R2)值是0. 9984。
[0120] 实施例3:用高分辨率/高准确度TOFMS检测和量化完整IGF-I
[0121] 也使用Agilent6530Accurate_MassQ-TOFMS系统（AgilentTechnologies， Inc.)进行MS。该系统采用具有高分辨率/高准确度MS的高分辨率/高准确度TOFMS 分析仪。当测量完整IGF-I时，该仪器展示的分辨本领为约25, 000FWHM，并且质量准确 度为约 3ppm。下列软件用于这些实验：AgilentMassHunterWorkstationAcquisition B. 02.01；AgilentMassHunterQuantitativeSoftwareB. 03. 02；AgilentMassHunter QualitativesoftwareB.02.00 ;和CohesiveAriaOSv.I.5.I。
[0122] 100yL空白血清中40fmol和650fmol样品产生的、m/z范围为约1090至1098的 示例性光谱分别显示在图6A和7A中。对应图6A和7A中所示光谱的提取离子色谱图（EIC) 分别显示在图6B和7B中。
[0123] 收集m/z为约1093. 7±2的同位素形式的IGF-I离子的数据，并定性