3. 52094、120ppm的质量准确度（图2A)、50ppm的质 量准确度（图2B)、20ppm的质量准确度（图2C)和IOppm的质量准确度（图2D)的理论峰， 仪器响应与所研究离子的真实m/z的可能偏差。
[0058] 图3显示用轨道阱质谱仪产生的完整IGF-I的m/z范围为约800至1300的示例 性光谱。细节在实施例2中讨论。
[0059] 图4显示用轨道阱质谱仪产生的完整IGF-I的m/z范围为约1091至1096的示例 性光谱。细节在实施例2中讨论。
[0060] 图5显示完整IGF-I各种柱上数量的分析结果的图。细节在实施例2中讨论。
[0061] 图6A显示m/z范围为约1090至1098的约40fmol(柱上）完整IGF-I的示例性 光谱。图6B显示相应的提取离子色谱图（EIC)。细节在实施例3中讨论。
[0062] 图7A显示m/z范围为约1090至1098的约650fmol(柱上）完整IGF-I的示例性 光谱。图7B显示相应的提取离子色谱图（EIC)。细节在实施例3中讨论。
[0063] 图8A和8B显示观察的和计算的m/z范围为约1092至1095. 3的完整IGF-I光谱。 细节在实施例3中讨论。
[0064] 图9A-B显示完整IGF-I各种柱上量的分析结果图。测试的全浓度范围描绘在图 9A中，浓度范围的下端的放大图描绘在图9B中。细节在实施例3中讨论。
[0065] 图10显示对在浓度范围从15ng/mL至2000ng/mL的完整IGF-I响应的线性图。细 节在实施例4中讨论。
[0066] 图11显示用高分辨率/高准确度TOF质谱仪产生的完整IGF-II的m/z范围为约 500至1900的示例性光谱。细节在实施例11中讨论。
[0067] 图12显示用高分辨率/高准确度TOF质谱仪产生的完整IGF-II的m/z范围为约 1066至1070的示例性光谱。细节在实施例11中讨论。
[0068] 图13显示完整IGF-II在浓度范围从15ng/mL至2000ng/mL线性响应的图。细节 在实施例11中讨论。
[0069] 图14显示通过即时LC-MS方法量化完整IGF-II的分析结果与通过IRMA分析的 比较。细节在实施例15中讨论。
[0070] 图15A、15B和15C显示来自同时量化IGF-II和IGF-I的示例性总离子色谱图 (TIC)和提取离子色谱图（EIC)。图15A显示TIC，图15B显示IGF-II的EIC，和图15C显 示IGF-I的EIC。细节在实施例18中讨论。
【具体实施方式】
[0071] 描述了测量IGF-I和/或IGF-II蛋白的量的方法。更具体而言，高准确度/高分 辨率质谱方法被描述为电离完整IGF-I和/或完整IGF-II，或其片段，并检测从而产生的离 子。这些方法可包括在电离和质谱法之前纯化样品中的完整IGF-I和/或完整IGF-II，或 其片段。但是，可以不使用色谱法纯化样品实施该方法。优选的实施方式尤其非常适合应 用于大的临床实验室用于自动量化完整IGF-I和/或完整IGF-II，或片段。另外，本文出现 的某些实施方式提供用于IGF-I和/或IGF-II定量的方法，该方法对于也存在样品中的结 合蛋白的干扰不敏感，如，例如IGFBP-3。
[0072] 虽然下面讨论的实施例表明量化完整的人IGF-I和/或IGF-II，但是其他IGF-I 和/或IGF-II蛋白可也通过本文描述的方法分析。例如，完整非人IGF-I和/或IGF-II(例 如，同位素标记的或未标记的完整重组鼠IGF-I和/或IGF-II)、同位素标记的完整人 IGF-I和/或IGF-II，或长R3IGF-I，或其片段，在合适的测试样品中可都用下面的方法量 化。
[0073] 用于本发明方法的合适的测试样品包括可包含关注分析物的任何测试样品。在一 些优选的实施方式中，样品是生物学样品；即，从任何生物来源如动物、细胞培养物、器官培 养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物，如狗、猫、马等获得。尤其 优选的哺乳动物是灵长类，最优选男性人类或女性人类。优选的样品包括体液如血液、血 浆、血清、唾液、脑脊液、或组织样品；优选血浆和血清。这种样品可获得自，例如患者；即， 诊断、预后的临床条件中或疾病或病症的治疗中存在的活体本身，男性或女性。
[0074]本发明也考虑IGF-I和/或IGF-II蛋白定量分析的试剂盒。IGF-I和/或IGF-II蛋白定量分析的试剂盒可包括含有本文提供的组合物的试剂盒。例如，试剂盒可包括包装 材料和量足够至少一次分析的测量量的同位素标记内标。通常，试剂盒也包括以有形形 式记录的说明书（例如，包含在纸上或电子介质上）：使用包装的试剂用于IGF-I和/或 IGF-II蛋白定量分析。
[0075] 用在本发明实施方式中的、具有已知浓度的质量控制（QC)库（pools)优选地使用 与期望的样品基质类似的基质制备。
[0076] 用于质谱分析的样品制备
[0077]在准备质谱分析时，可通过本领域已知的各种方法相对于样品中的一种或多种其 他组分（例如其他蛋白质）富集IGF-I蛋白，所述方法包括例如，固相提取（SPE)、LC、过 滤、离心、薄层层析（TLC)、电泳一一包括毛细管电泳、亲和分离一一包括免疫亲和分离、提 取法一一包括乙酸乙酯或甲醇提取、和使用离液剂或任何上述组合等。在一些实施方式中， 可结合使用液相色谱法和/或SPE，和/或蛋白质沉淀。
[0078] 蛋白质沉淀是制备测试样品特别是生物学样品例如血清或血浆的一种方 法。蛋白纯化方法是本领域熟知的，例如PoIson等，JournalofChromatographyB 2003, 785:263-275，描述适合用于本发明方法的蛋白质沉淀技术。蛋白质沉淀可用于从样 品除去大多数蛋白质，在上清液中留下IGF-I和/或IGF-II蛋白。样品可被离心以将液体 上清液与沉淀蛋白质分离；可选地，可过滤样品以除去沉淀蛋白质。然后，所得到的上清液 或滤液可直接应用到质谱法；或可选地，应用到固相提取和/或液相色谱和随后的质谱法。 在某些实施方式中，利用蛋白质沉淀例如酸乙醇蛋白质沉淀可避免在质谱法或HPLC和质 谱法之前对TFLC、SPE或其他联机提取的需要。
[0079]在优选的实施方式中，液液提取方法（如酸乙醇提取）用于从样品中提取天然完 整IGF-I和/或IGF-II。在这些实施方式中，10y1和500y1之间，如25y1和250y1之 间，如约100y1的样品被添加至部分提取溶剂。提取溶剂的量与样品体积相称并可根据使 用的提取溶剂而变化，但优选地在约50y1和1000y1之间。样品/溶剂混合物被混合并 离心，并且部分上清液或有机相（取决于使用的溶剂）被取出用于进一步分析。溶剂可从 取出部分清除，例如在氮气流下，并且残余物在用于液液提取的不同溶剂中中重构。至少部 分所得溶液在质谱法之前可接着经历另外的处理步骤，如SPE和/或IX。
[0080] 可在质谱法之前使用的其他样品纯化方法是液相色谱（LC)。液相色谱的某些方 法，包括HPLC，依赖于相对慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充物，其中通过该 柱的样品的层流是将关注分析物从样品分离的基础。本领域普通技术人员将理解在这类柱 中的分离是扩散过程，并且可选择LC，包括适用于IGF-I和/或IGF-II使用的HPLC仪器和 柱。一般地，色谱柱包括介质（即填充材料）以促进化学部分的分离（即分级）。介质可包 括微小的颗粒，或可包括具有多孔通道的单片材料。介质的表面通常包括与不同的化学部 分相互作用以促进化学部分分离的键合表面（bondedsurface)。一种适当的键合表面是疏 水键合表面，例如烷基键合或氰基键合表面。烷基键合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18 键合的烷基。在优选的实施方式中，柱是C-18烷基键合柱（如PhenomenexOnyx单片C-18 柱）。色谱柱包括用于接收样品的入口和用于排放包括分馏样品的流出液的出口。样品可 直接，或从SPE柱，如联机SPE保护柱体或TFLC柱供应至入口。
[0081]在一个实施方式中，样品可在入口处被施加到LC柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱， 并在出口处排放。可选择不同的溶剂模式以洗脱关注分析物（一种或多种）。例如，可使 用梯度模式、等度模式或多型（polytyptic)(即混合的）模式进行液相色谱。在色谱法期 间，物质的分离通过多个变量例如洗脱液（也称为"流动相"）、洗脱方式、梯度条件、温度等 的选择来实现。
[0082]在某些实施方式中，可在关注分析物通过柱填充物质可逆地保留而一种或多种其 他物质不保留的条件下，通过将样品施加到柱来纯化分析物。在这些实施方式中，可以使用 第一流动相条件，其中关注分析物被柱保留，并且在未保留物质被洗涤通过后，可随后使用 第二流动相条件以从柱移出保留的物质。可选地，可以在其中关注分析物以与一种或多种 其他物质相比的差别速度下洗脱的流动相条件下，通过将样品施加到柱来纯化分析物。这 类过程可相对于样品的一种或多种其他组分，富集一种或多种关注分析物的量。
[0083]在一些实施方式中，HPLC用烷基键合的分析柱色谱系统进行。在某些实施方式中， 使用C-18分析柱（例如，PhenomenexOnyx单片C18,或等价物）。在某些实施方式中，使用 在水中HPLC级0. 2 %甲酸作为流动相A和乙腈中0. 2 %的甲酸作为流动相B进行HPLC和 / 或TFLC。
[0084]通过小心选择阀和连接器管道（connectorplumbing)，两个或更多色谱柱可根据 需要连接，以便物质从一个通过到下一个，而无需任何手动步骤。在优选的实施方式中，阀 和管道的选择通过预编程的计算机控制，以进行必要的步骤。最优选地，也以这样的联机方 式连接色谱系统至检测器系统，例如MS系统。因此，操作员可将样品托盘置于自动采样器 中，并且剩余操作在计算机控制下进行，这导致所有选择的样品的纯化和分析。
[0085] 在一些实施方式中，TFTLC可被用于在质谱法之前纯化IGF-I蛋白或片段。在这 类实施方式中，可以使用俘获分析物的TFLC柱提取样品，然后洗脱并在第二TFLC柱或分 析HPLC柱上进行色谱，然后离子化。例如，用TFLC提取柱的样品提取可用大粒子尺寸的 (50ym)填充柱完成。然后，该柱洗脱出的样品可被转移到HPLC分析柱，以在质谱法之前进 一步纯化。因为涉及这些色谱过程的步骤可以以自动方式连接，所以在分析物纯化期间操 作员介入的需要可被最小化。该特征可导致节约时间和成本，并且消除操作员错误的机会。 [0086] 在一些实施方式中，蛋白质沉淀用来自血清的酸乙醇提取完成，并且所得溶液进 行SPE，优选地用C-18提取柱（例如，PhenomenexOnyxC-18保护柱体，或等价物）联机进 行。在质谱分析之前，来自SPE柱的洗脱液可接着施加至分析LC柱，如以联机方式的HPLC 柱。
[0087]通讨质谱法检测和宙量
[0088]使用质谱仪进行质谱法，所述质谱仪包括用于电离样品和产生带电分子以进行进 一步分析的离子源。在各种实施方式中，IGF-I和/或IGF-II蛋白可通过技术人员已知的 任何合适的方法电离。例如，样品的电离可通过如下进行：电子电离、化学电离、电喷射电离 (ESI)、光子电离、大气压化学电离（APCI)、光致电离、大气压光致电离（APPI)、快原子轰击 (FAB)、液体次级电离（LSI)、基质辅助激光解吸电离（MLDI)、场致电离、场解吸、热喷射/ 等离子体喷射电离、表面增强的激光解吸电离（SELDI)、电感耦合等离子体（ICP)和粒子束 电离。本领域普通技术人员将理解选择电离方法可基于待被测量的分析物、样品类型、检测 器类型、正对负模式的选择等进行确定。根据使用的具体电离方法和条件，IGF-I和IGF-II 蛋白可被电离为许多不同的电荷状态。可选择电离源以使所产生的电荷状态的分散最小 化。在一些实施方式中，ESI(任选地加热）被用作电离源，并且电离条件被最优化以使观 察到的多电荷IGF-I和/或IGF-II蛋白离子的分配最小化。
[0089] 可以以正模式或负模式电离IGF-I和/或IGF-II蛋白。在优选的实施方式中， 一种或多种IGF-I和/或IGF-II蛋白以正模式被电离。在一些实施方式中，产生m/z比 在下列范围内的多电荷完整IGF-I离子：约850. 8±2、957. 1±2、1093. 7±2和1275. 8±2。 在一些实施方式中，产生m/z比在下列范围内的多电荷完整IGF-II离子：约934. 69±2、 1068. 07±2、1245. 92±2和1494. 89±2。大部分产生的在这些范围内的多电荷离子可落在 更窄的子范围内，如所述的m/z± 1。
[0090]在质谱法技术中，一般而言，样品已经被电离之后，从而产生的带正电的离子或带 负电的离子可被分析以检测质荷比（m/z)。用于测定m/z的各种分析仪包括四极分析仪、 离子阱分析仪，和飞行时间分析仪，和轨道阱分析仪。根据本发明的方法，高分辨率/高准 确度质谱法用于定量分析IGF-I和/或IGF-II蛋白。即，质谱法用对于关注的离子能够 展示至少10, 000的分辨本领（FWHM)、约50ppm或更小的准确度的质谱仪进行；优选地用展 示下列分辨本领和准确度的质谱仪进行：分辨本领（FWHM)为20, 000或更好和准确度为约 20ppm或更小；如分辨本领（FWHM)为25, 000或更好和准确度为约5ppm或更小；如分辨本 领（FWHM)为25, 000或更好和准确度为约3ppm或更小。对于IGF-I和/或IGF-II蛋白离 子能够展示性能必要水平的三个示例性质谱仪是包括轨道阱质量分析器、某些TOF质量分 析器或傅里叶变换离子共振质量分析器的那些。
[0091]在生物活性分子中出现的元素，如碳、氧和氮以许多不同的同位素形式自然存在。 例如，大部分碳以12C出现，但所有天然存在的碳的约1 %以13C存在。因此，一部分天然存 在的含碳分子包含至少一个13C原子。分子中包含天然存在的元素同位素产生多重分子同 位素形式。分子同位素形式的质量差是至少1个原子质量单位（amu)。这是因为元素同位 素至少有一个中子的不同（一个中子的质量~Iamu)。当分子同位素形式被电离为多电荷 状态，同位素形式之间的质量差别可变得难以区分，因为质谱检测基于质荷比（m/z)。例如， 都被电离为5+状态的质量差别Iamu的两种同位素形式，它们的m/z差仅为0. 2 (Iamu的差 别/5的电荷状态）。高分辨率/高准确度质谱仪能够在高度多重带电荷离子的同位素形式 (如带电荷±5、±6、±7、±8、±9或更尚的呙子）之间进行区分。
[0092] 由于天然存在元素同位素，多重同位素形式通常存在于每种分子离子中（如果用 足够灵敏的质谱仪器分析，其每个可产生可分开检测的光谱峰）。多重同位素形式的m/z比 和相对丰度共同包括分子离子的同位素"签字"。在一些实施方式中，两种或多种分子同位 素形式的m/z比和相对丰度可用于确认所研究的分子离子的同一性。在一些实施方式中， 来自一种或多种同位素形式的质谱峰用于量化分子离子。在一些相关实施方式中，来自一 种同位素形式的单个质谱峰用于量化分子离子。在其他相关实施方式中，多个同位素峰用 于量化分子离子。在这些后面的实施方式中，多个同位素峰可进行任何合适的数学处理。数 种数学处理是本领域已知的，包括但不限于对多重峰下面积的求和，或对来自多重峰的响 应平均。
[0093] 表明m/z范围为约1091-1095. 5的这种多重同位素形式的IGF-I离子的示例 性光谱见图4。如在示例性光谱中所见，来自各种同位素形式的峰在m/z约1091.9447、 1092. 8031、1092. 9445、1093. 0881、1093. 2308、1093. 374