专利名称：一种巴马香猪体细胞克隆的方法
技术领域：
本发明涉及动物繁殖、动物胚胎生物技术，具体是一种巴马香猪体细胞克隆的方法。
背景技术：
至今并未发现有与本发明相同或相似的报导。
发明内容
本发明的目的是为了 1.解决人类异种器官移植所进行转基因猪研究必需的关键技术问题，为基因打靶猪和异种器官移植等研究奠定基本而又必要的研究手段。2.为具有重要经济价值的优良地方品种巴马香猪的保种开辟了一条新的途径，也可大量繁育其它具有优良性状的种猪，解决优良种猪引种、保种和品种改良等问题，大大加快优良种猪引种、保种和品种改良的速度。3.对探讨猪早期胚胎发育的全能性，揭示猪胚胎、组织、个体发育中基因组印迹现象的本质，对研究发育过程中同种动物或异种动物核质互作关系，特别是对解决核遗传物质(核DNA)与细胞质遗传物质(线粒体DNA)的调控和相容性等发育核心问题均具有重要价值。提供一种具有重要经济价值的优良地方品种巴马香猪体细胞克隆的方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种巴马香猪体细胞克隆的方法，是按以下步骤进行操作1.相关试剂的配制 1)磷酸盐缓冲液DPBS的配制磷酸盐缓冲液DPBS的配制称取DPBS粉剂9. 5克/L，青霉素66 μ g/L，和链霉素 100 μ g/L,超纯水定容，待药品充分溶解后，用灭菌的滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分
装，4°C保存。2)体细胞培养液DMEM的配制体细胞培养液DMEM的成分为DMEM粉剂9. 5g/L，44mM NaHCO3, ImM丙酮酸钠， 66mg/L青霉素钠和100mg/L硫酸链霉素，体积百分浓度10% -15%的FCS和体积百分浓度
的非必需氨基酸。根据以上配方，将DMEM粉末溶于超纯水中，加入NaHCO3，丙酮酸钠，青霉素钠和硫酸链霉素，然后调PH至7. 2-7. 4，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤除菌，分装后储于4°C 备用；使用前添加FCS和非必需氨基酸；使用前放在培养箱内预热平衡。3)细胞传代消化液胰蛋白酶的配制细胞传代消化液胰蛋白酶的成分为2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. ^igAilEDTA-Nii4。根据以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Nii4溶解于磷酸缓冲液中，充分溶解完后，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤除菌，分装后储于-20°C备用。4)体细胞冷冻液的配制体积百分浓度10-15% FCS的DMEM培养液中加入体积百分浓度10% DMSO ；5)洗卵液的配制洗卵液为改良TL-ifepes-PVA液，调pH至7. 3-7. 4后，用滤膜孔径为0. 22 μ m滤器过滤分装，放于4°C保存，1-4周内用完，使用前放在35-39°C恒温箱中预热。6)猪卵泡液的配制抽取猪卵巢上直径3_8mm卵泡的卵泡液，将抽取液放入离心管中离心，收集上清液，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，-20°c至_80°C保存备用。7) FSH和LH储存液的配制取体外成熟液储液放入小瓶内，称量少量BSA或者血清溶解于该储存液中，再加入FSH，充分溶解后，过滤除菌，分装，-20°C至_80°C保存备用；使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0. 5-1. 0 μ g/ml。取TCM-199成熟液的储存液放入小瓶内，称量少量BSA或者血清溶解于该储存液中，再加入LH，充分溶解后，过滤除菌，分装，-20°C至-80°C保存备用；使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0. 5-1. 0 μ g/ml。8) EGF储液的配制称量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液储存液中，分装，_20°C至_80°C 保存备用；使用时稀释，最终使用浓度为lOng/ml。9)体外成熟液的配制体外成熟液储液为改良的TCM-199，其成分为3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate, 26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA · Na4 · 2H20, 75 μ g/mlPenicillin G,50y g/ml Str印tomycin，用滤孔为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存备用；使用前，在成熟液储液中添加最终使用浓度为0. 57mM的半胱氨酸、最终使用浓度为lOng/ml的EGF、最终使用浓度为0. 5-1 μ g/ml的FSH、最终使用浓度为0. 5-1 μ g/ml的LH和最终使用浓度为10%的卵泡液，再次用滤孔为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，放入二氧化碳培养箱中平衡备用。10)胚胎培养液的配制采用NCSU-23或者PZM-3培养液用于重构胚胎的体外培养，调节pH为7. 2-7. 3，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存，1-4周内用完。11)核移植操作液的配制在洗卵液中添加体积百分浓度5-15% FCS和5_7. 5 μ g/ml细胞松弛素B，使用前将其放在35-39°C恒温箱中预热。12)融合激活液称取0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0. 5mM Hepes,0. 3% BSA或者0. lg/L PVA0用超纯水定容，调整pH值7. 3-7. 4，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4 °C保存，使用前在30-39 °C恒温箱中预热。13)细胞松弛素B的配制用DMSO溶解细胞松弛素B，分装到Eppendorf管中，_20°C至_80°C冻存，最终工作浓度为 5-7. 5 μ g/ml。
14)透明质酸酶储存液的配制透明质酸酶储存液的配制称取透明质酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中， 过滤，分装到Eppendorf管中，-20°C至_80°C保存；使用时稀释，使用最终浓度为Hmg/ml。2.巴马香猪睾丸细胞的体外培养采集当地巴马香猪养殖场给雄性巴马香猪去势的睾丸组织，将其放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液或者生理盐水中清洗，然后用体积百分浓度75%酒精快速清洗后，再用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液或者生理盐水中彻底清洗；在超净工作台内，把去势的睾丸组织块移到灭菌过的小瓶中，用眼科剪将其剪碎， 加入磷酸缓冲液或者生理盐水，移到灭菌离心管中离心，洗涤，弃掉上清，向沉淀中加入少许DMEM培养液，移到培养皿中摊均勻，转入体积百分浓度5% CO2、温度37°C和最大饱和湿度的培养箱中培养，第二天加入DMEM培养液；以后每2-3天换液一次，待细胞长到70-80% 汇合时，轻轻拨掉组织块，然后将其和培养液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化，然后加入DMEM终止消化，并轻轻吹打；然后将液体移到灭菌的离心管中，离心，弃掉上清，再向离心管中加入新鲜的DMEM培养液，重悬细胞，调整浓度后，接种到培养皿中，继续培养，每2-3天换液一次。70-90%汇合时，将细胞传代或冷冻。3.巴马香猪睾丸细胞的冷冻睾丸细胞体外培养长到70-90%汇合时，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分细胞变圆部分细胞已脱壁时迅速加入DMEM终止消化，吹打至细胞完全脱壁，把细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入细胞冻存液，吹打均勻后分装到细胞冻存管内，于4°C冰箱中置0. 5个小时，再放入-80°C冰箱过夜，过夜后直接将冻存管放入液氮中。4.冷冻睾丸细胞的解冻从-80°C液氮中取出冻存管，快速投入30-37°C温水中，不断摇动冻存管，待冰块全部融化后，将细胞悬液转移至离心管中，加入预热的DMEM培养液，离心清洗，然后用预热的DMEM调整到所需的细胞浓度后接种到培养皿培养。5)猪卵母细胞的采集和体外成熟培养从当地生猪肉类加工厂收集猪卵巢，放入含有含青、链霉素的30-37°C生理盐水或者磷酸盐缓冲液中，送回实验室，用含青、链霉素的生理盐水或者磷酸盐缓冲液冲洗，带入无菌操作室，用装有针头的注射器抽取卵巢表面直径为2 6mm的卵泡，将抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，静置0. 5-1小时，用洗卵液稀释后放在实体显微镜下，用玻璃吸管挑选带有2层以上卵丘细胞、胞质均勻的卵母细胞，在洗卵液中洗涤，用预平衡的成熟液洗涤，最后放入含FSH和LH的成熟液滴中，培养20-22小时，然后移入不含激素的新鲜成熟液滴中继续培养20-22小时，培养条件为体积百分浓度5% CO2、最大饱和湿度、38. 5_39°C。6.核移植1)卵母细胞的准备将体外培养40_44h的猪卵母细胞在透明质酸酶中作用，轻轻吹打除去周围卵丘细胞，用玻璃拨卵针在实体显微镜下轻轻转动卵母细胞，挑选出胞质均勻且有极体排放的卵母细胞为核移植备用。2)巴马香猪睾丸细胞的准备
选择3-10代生长状态良好的细胞，去除培养液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的细胞已脱壁时，加入预热的DMEM终止消化，轻轻吹打，然后将细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入核移植操作液，重悬睾丸细胞离心洗涤，弃上清后加入核移植操作液，重悬睾丸细胞，然后再向混合液中加入细胞松弛素B，使最终使用浓度为 5-7. 5μ g/ml。3)操作滴的准备用上述调整好的睾丸细胞悬液，做成长条型液滴，上面覆盖矿物油，将挑选出的卵母细胞放在上述长条型液滴中，在显微操作仪下去核操作；吸取中等大小圆形、表面光滑， 细胞膜折光度较好的睾丸供体细胞通过透明带切口注射到透明带下方，并轻点透明带使睾丸供体细胞与卵母细胞膜接触良好，形成了重构卵。4)重构卵的融合/激活和培养将重构卵放在含有细胞松弛素B的胚胎培养液滴中，然后把恢复好的重构卵移到融合液中洗涤，然后进行融合/激活，融合后的重构卵用胚胎培养液洗涤，放入平衡好的含细胞松弛素B的胚胎培养液滴中培养3个小时，挑选融合好的重构卵，用胚胎培养液洗涤， 然后移到胚胎培养液滴中培养，培养条件为39°C，体积百分浓度5% CO2，最大饱和湿度，得到体细胞核移植胚胎，将体细胞核移植胚胎移植到受体雌猪体内相应部位，怀孕到期后产下体细胞克隆的巴马香猪。发明的有益效果是1.对社会的意义1)为加快国内转基因猪技术和人类异种器官移植的研究做出了贡献；2)加快了广西乃至全国畜牧业发展水平的速度；3)为国内同类研究奠定了技术基础；4)对培养人才、推广科学知识起到了积极作用。2.对科技进步的意义1)在学术上填补了国内空白；2)在国内学术界有广泛而深远的影响。
图1是本发明有关克隆巴马香猪的照片。图中A是新生克隆巴马香猪及其代孕母亲陆川猪的照片；B是成年后的该克隆巴马香猪的照片；C是新生Fl代杂交猪及其母亲陆川猪的照片；D是断奶后的Fl代杂交猪的照片；E是F2代杂交猪的照片。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。必须说明在权利要求书中所有工艺条件下进行克隆试验结果与本实施例结果相似。实施例1.相关试剂的配制(1)磷酸盐缓冲液DPBS的配制
磷酸盐缓冲液DPBS的配制称取DPBS粉剂9. 5克/L，青霉素66 μ g/L，和链霉素 100 μ g/L,超纯水定容，待药品充分溶解后，用灭菌的滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存；(2)体细胞培养液DMEM的配制体细胞培养液DMEM的成分为DMEM粉剂9. 5g/L,44mM NaHC03, ImM丙酮酸钠， 66mg/L青霉素钠和100mg/L硫酸链霉素，体积百分浓度15%的FCS和体积百分浓度1 %的
非必需氨基酸；根据以上配方，将DMEM粉末溶于超纯水中，加入NaHCO3,丙酮酸钠，青霉素钠和硫酸链霉素，然后调PH至7. 2-7. 4，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤除菌，分装后储于4°C 备用；使用前添加FCS和非必需氨基酸；使用前放在培养箱内预热平衡；(3)细胞传代消化液胰蛋白酶的配制细胞传代消化液胰蛋白酶的成分为2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. 2mg/mlEDTA-Na4 ；根据以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Nii4溶解于磷酸缓冲液中，充分溶解完后，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤除菌，分装后储于-20°c备用；(4)体细胞冷冻液的配制体积百分浓度15% FCS的DMEM培养液中加入体积百分浓度10% DMSO ；(5)洗卵液的配制洗卵液为改良TL-ifepes-PVA液，调pH至7. 3-7. 4，用滤膜孔径为0. 22 μ m滤器过滤分装，放于4°C保存，4周内用完，使用前放在39。C恒温箱中预热(6)猪卵泡液的配制抽取猪卵巢上直径3_8mm卵泡的卵泡液，将抽取液放入离心管中离心，收集上清液，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，-20°c保存备用；(7) FSH和LH储存液的配制取体外成熟液的储存液放入小瓶内，称量少量BSA或者血清溶解于该储存液中， 再加入FSH，充分溶解后，过滤除菌，分装，-20°C保存备用；使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0. 5 μ g/ml ；取TCM-199成熟液的储存液放入小瓶内，称量少量BSA或者血清溶解于该储存液中，再加入LH，充分溶解后，过滤除菌，分装，-20°C保存备用；使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0. 5 μ g/ml ；(8)体外成熟液的配制体外成熟液储液为改良的TCM-199，其成分为3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate,26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA · Na4· 2H20,75 μ g/mlPenicillin G,50 μ g/ml Str印tomycin，用滤孔为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存备用；使用前，在成熟液储液中添加最终使用浓度为0. 57mM的半胱氨酸、最终使用浓度为lOng/ml的EGF、最终使用浓度为0. 5 μ g/ml的FSH、最终使用浓度为0. 5 μ g/ml的LH和最终使用浓度为10%的卵泡液， 再次用滤孔为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，放入二氧化碳培养箱中平衡备用；(9)胚胎培养液的配制采用NCSU-23培养液用于重构胚胎的体外培养，调节pH为7. 2-7. 3，用滤膜孔径为 0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存，4周内用完；
(10)核移植操作液的配制在洗卵液中添加体积百分浓度15% FCS和7. 5 μ g/ml细胞松弛素B，使用前将其放在39°C恒温箱中预热；(11)融合激活液称取0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0· 5mMHepes,0. lg/L PVA。用超纯水定容，调整pH值7. 3-7. 4，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存，使用前在39°C恒温箱中预热；(12)细胞松弛素B的配制用DMSO溶解细胞松弛素B，分装到Eppendorf管中，-20至_80°C冻存，最终工作浓度为7. 5 μ g/ml ；(13)透明质酸酶储存液的配制透明质酸酶储存液的配制称取透明质酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中， 过滤，分装到Eppendorf管中，_20°C保存；使用时稀释，使用最终浓度为2mg/ml ；(14) EGF储液的配制称量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液储存液中，分装，_20°C保存备用； 使用时稀释，最终使用浓度为lOng/ml ；2.巴马香猪睾丸细胞的体外培养采集当地巴马香猪养殖场给雄性巴马香猪去势的睾丸组织，将其放入含青、链霉素的磷酸缓冲液或者生理盐水中清洗，然后用体积百分浓度75%酒精快速清洗后，再用含青、链霉素的磷酸缓冲液或者生理盐水中彻底清洗；在超净工作台内，把去势的睾丸组织块移到灭菌过的小瓶中，用眼科剪将其剪碎， 加入磷酸缓冲液或者生理盐水，移到灭菌离心管中离心，洗涤，弃掉上清，向沉淀中加入少许DMEM培养液，移到培养皿中摊均勻，转入体积百分浓度5% CO2、温度37°C和最大饱和湿度的培养箱中培养，第二天加入DMEM培养液；以后每2天换液一次，待细胞长到70-80%汇合时，轻轻拨掉组织块，然后将其和培养液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化， 然后加入DMEM终止消化，并轻轻吹打；然后将液体移到灭菌的离心管中，离心，弃掉上清， 再向离心管中加入新鲜的DMEM培养液，重悬细胞，调整浓度后，接种到培养皿中，继续培养，每2天换液一次。70-90%汇合时，将细胞传代或冷冻；3.巴马香猪睾丸细胞的冷冻睾丸细胞体外培养长到70-90%汇合时，用磷酸缓冲液清洗细胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分细胞变圆部分细胞已脱壁时迅速加入DMEM终止消化，吹打至细胞完全脱壁，把细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入细胞冻存液，吹打均勻后分装到细胞冻存管内，于4°C冰箱中置0. 5个小时，再放入-80°C冰箱过夜，过夜后直接将冻存管放入液氮中；4.冷冻睾丸细胞的解冻从-80°C液氮中取出冻存管，快速投入37°C温水中，不断摇动冻存管，待冰块全部融化后，将细胞悬液转移至离心管中，加入预热的DMEM培养液，离心清洗，然后用预热的 DMEM调整到所需的细胞浓度后接种到培养皿培养；5.猪卵母细胞的采集和体外成熟培养
从当地生猪肉类加工厂收集猪卵巢，放入含有青、链霉素的30-37°C生理盐水或者磷酸缓冲液中，送回实验室，用含青、链霉素的生理盐水或者磷酸盐缓冲液冲洗，带入无菌操作室，用装有针头的注射器抽取卵巢表面直径为2 6mm的卵泡，将抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，静置0. 5小时，用洗卵液稀释后放在实体显微镜下，用玻璃吸管挑选带有 2层以上卵丘细胞、胞质均勻的卵母细胞，在洗卵液中洗涤，用预平衡的成熟液洗涤，最后放入含FSH和LH的成熟液滴中，培养20-22小时，然后移入不含激素的新鲜成熟液滴中继续培养20-22小时，培养条件为体积百分浓度5% CO2、最大饱和湿度、39°C ；6.核移植(1)卵母细胞的准备将体外培养40_44h的猪卵母细胞在透明质酸酶中作用，轻轻吹打除去周围卵丘细胞，用玻璃拨卵针在实体显微镜下轻轻转动卵母细胞，挑选出胞质均勻且有极体排放的卵母细胞为核移植备用；(2)巴马香猪睾丸细胞的准备选择3-10代生长状态良好的细胞，去除培养液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的细胞已脱壁时，加入预热的DMEM终止消化，轻轻吹打，然后将细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入核移植操作液，重悬睾丸细胞离心洗涤，弃上清后加入核移植操作液，重悬睾丸细胞，然后再向混合液中加入细胞松弛素B，最终使用浓度为 7. 5 μ g/ml ；(3)操作滴的准备用上述调整好的睾丸细胞悬液，做成长条型液滴，上面覆盖矿物油，将挑选出的卵母细胞放在上述长条型液滴中，在显微操作仪下去核操作；吸取中等大小圆形、表面光滑， 细胞膜折光度较好的睾丸供体细胞通过透明带切口注射到透明带下方，并轻点透明带使睾丸供体细胞与卵母细胞膜接触良好，形成了重构卵；(4)重构卵的融合/激活和培养将重构卵放在含有细胞松弛素B的胚胎培养液滴中，然后把恢复好的重构卵移到融合液中洗涤，然后进行融合/激活，融合后的重构卵用胚胎培养液洗涤，放入平衡好的含细胞松弛素B的胚胎培养液滴中培养3个小时，挑选融合好的重构卵，用胚胎培养液洗涤， 然后移到胚胎培养液滴中培养，培养条件为39°C，体积百分浓度5% CO2，最大饱和湿度，得到体细胞核移植胚胎，将体细胞核移植胚胎移植到受体雌猪体内相应部位，怀孕到期后产下体细胞克隆的巴马香猪。7.结果2007年度进行巴马香猪体细胞核移植胚胎的胚胎移植4头·次，结果于2007年 10月产下一头体细胞克隆的雄性巴马香猪，从毛色、体型、性别和DNA鉴定，都证明是巴马香猪克隆猪。该雄性克隆巴马香猪成年后与13头陆川猪母猪配种，其中3头母猪返情，受胎10 头，产仔10窝共98头仔猪，活产93头，即该雄性克隆巴马香猪已经繁殖出了 93头活仔猪后代，说明该雄性克隆巴马香猪具有正常的繁殖能力。随机选择该雄性克隆巴马香猪的雌性后代3头，进行人工输精配种，受胎3头，产仔3窝共22头仔猪，活产14头，说明该雄性克隆巴马香猪的后代也具备正常的繁殖能力。
表1 克隆巴马小型猪及其Fl后代遗传分析
权利要求
1. 一种巴马香猪体细胞克隆的方法，其特征在于，按以下步骤进行操作1)相关试剂的配制(1)磷酸盐缓冲液DPBS的配制磷酸盐缓冲液DPBS的配制称取DPBS粉剂9. 5克/L，青霉素66 μ g/L，和链霉素 100 μ g/L,超纯水定容，待药品充分溶解后，用灭菌的滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存；(2)体细胞培养液DMEM的配制体细胞培养液DMEM的成分为DMEM粉剂9. 5g/L，44mM NaHC03, ImM丙酮酸钠，66mg/L 青霉素钠和100mg/L硫酸链霉素，体积百分浓度10% -15%的FCS和体积百分浓度1 %的非必需氨基酸；根据以上配方，将DMEM粉末溶于超纯水中，加入NaHCO3，丙酮酸钠，青霉素钠和硫酸链霉素，然后调PH至7. 2-7. 4，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤除菌，分装后储于4°C备用； 使用前添加FCS和非必需氨基酸；使用前放在培养箱内预热平衡；(3)细胞传代消化液胰蛋白酶的配制细胞传代消化液胰蛋白酶的成分为2. 5mg/ml胰蛋白酶和0. 2mg/mlEDTA-Na4 ；根据以上配方，取胰蛋白酶和EDTA-Na4溶解于磷酸缓冲液中，充分溶解完后，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤除菌，分装后储于_20°C备用；(4)体细胞冷冻液的配制体积百分浓度10-15% FCS的DMEM培养液中加入体积百分浓度10% DMSO ；(5)洗卵液的配制洗卵液为改良TL-ifepes-PVA液，调pH至7. 3-7. 4后，用滤膜孔径为0. 22 μ m滤器过滤分装，放于4°C保存，1-4周内用完，使用前放在35-39°C恒温箱中预热；(6)猪卵泡液的配制抽取猪卵巢上直径3-8mm卵泡的卵泡液，将抽取液放入离心管中离心，收集上清液，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，-20°C至_80°C保存备用；(7)FSH和LH储存液的配制取TCM-199成熟液的储存液放入小瓶内，称量少量BSA或者血清溶解于该储存液中，再加入FSH，充分溶解后，过滤除菌，分装，-20°C至_80°C保存备用；使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0. 5-1.0 μ g/ml ；取TCM-199成熟液的储存液放入小瓶内，称量少量BSA或者血清溶解于该储存液中，再加入LH，充分溶解后，过滤除菌，分装，-20°C至-80°C保存备用；使用时将其添加到猪卵母细胞成熟液中，最终浓度为0. 5-1.0 μ g/ml ；(8)EGF储液的配制称量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液储存液中，分装，_20°C至_80°C保存备用；使用时稀释，最终使用浓度为lOng/ml ；(9)体外成熟液的配制体外成熟液储液为改良的TCM-199，其成分为3. 05mM D-glucose，0. 91mM Sodium pyruvate,26. 19mM NaHCO3,0. 09mM EDTA ‘ Na4‘ 2H20,75 μ g/mlPenicillin G，50 μ g/ml Str印tomycin，用滤孔为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存备用；使用前，在成熟液储液中添加最终使用浓度为0. 57mM的半胱氨酸、最终使用浓度为lOng/ml的EGF、最终使用浓度为0. 5-1 μ g/ml的FSH、最终使用浓度为0. 5-1 μ g/ml的LH和最终使用浓度为10%的卵泡液，再次用滤孔为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，放入二氧化碳培养箱中平衡备用；(10)胚胎培养液的配制采用NCSU-23或者PZM-3培养液用于重构胚胎的体外培养，调节pH为7. 2-7. 3，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存，1-4周内用完；(11)核移植操作液的配制在洗卵液中添加体积百分浓度5-15% FCS和5-7. 5 μ g/ml细胞松弛素B，使用前将其放在35-39°C恒温箱中预热；(12)融合激活液称取 0. 3M 甘露醇，0. ImM CaCl2 · 2H20，0. ImM MgS04 · 7Η20，0· 5mMHepes,0. 3% BSA 或者0. lg/L PVA。用超纯水定容，调整pH值7. 3-7. 4，用滤膜孔径为0. 22 μ m的滤器过滤，分装，4°C保存，使用前在30-39°C恒温箱中预热；(13)细胞松弛素B的配制用DMSO溶解细胞松弛素B，分装到Eppendorf管中，_20°C至_80°C冻存，最终工作浓度为 5-7. 5 μ g/ml ；(14)透明质酸酶储存液的配制透明质酸酶储存液的配制称取透明质酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中，过滤，分装到Eppendorf管中，_20°C至_80°C保存；使用时稀释，使用最终浓度为Hmg/ml ；2)巴马香猪睾丸细胞的体外培养采集当地巴马香猪养殖场给雄性巴马香猪去势的睾丸组织，将其放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液或者生理盐水中清洗，然后用体积百分浓度为75%酒精快速清洗后，再用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液或者生理盐水中彻底清洗；在超净工作台内，把去势的睾丸组织块移到灭菌过的小瓶中，用眼科剪将其剪碎，加入磷酸缓冲液或者生理盐水，移到灭菌离心管中离心，洗涤，弃掉上清，向沉淀中加入少许 DMEM培养液，移到培养皿中摊均勻，转入体积百分浓度5% CO2、温度37°C和最大饱和湿度的培养箱中培养，第二天加入DMEM培养液；以后每2-3天换液一次，待细胞长到70-80 %汇合时，轻轻拨掉组织块，然后将其和培养液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化， 然后加入DMEM终止消化，并轻轻吹打；然后将液体移到灭菌的离心管中，离心，弃掉上清， 再向离心管中加入新鲜的DMEM培养液，重悬细胞，调整浓度后，接种到培养皿中，继续培养，每2-3天换液一次。70-90%汇合时，将细胞传代或冷冻；3)巴马香猪睾丸细胞的冷冻睾丸细胞体外培养长到70-90%汇合时，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分细胞变圆部分细胞已脱壁时迅速加入DMEM终止消化，吹打至细胞完全脱壁，把细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入细胞冻存液，吹打均勻后分装到细胞冻存管内，于4°C冰箱中置0. 5个小时，再放入-80°C冰箱过夜，过夜后直接将冻存管放入液氮中；4)冷冻睾丸细胞的解冻从-80°C液氮中取出冻存管，快速投入30-37°C温水中，不断摇动冻存管，待冰块全部融化后，将细胞悬液转移至离心管中，加入预热的DMEM培养液，离心清洗，然后用预热的 DMEM调整到所需的细胞浓度后接种到培养皿培养；5)猪卵母细胞的采集和体外成熟培养从当地生猪肉类加工厂收集猪卵巢，放入含有含青、链霉素的30-37°C生理盐水或者磷酸盐缓冲液中，送回实验室，用含青、链霉素的生理盐水或者磷酸盐缓冲液冲洗，带入无菌操作室，用装有针头的注射器抽取卵巢表面直径为2 6mm的卵泡，将抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，静置0. 5-1小时，用洗卵液稀释后放在实体显微镜下，用玻璃吸管挑选带有2层以上卵丘细胞、胞质均勻的卵母细胞，在洗卵液中洗涤，用预平衡的成熟液洗涤，最后放入含FSH和LH的成熟液滴中，培养20-22小时，然后移入不含激素的新鲜成熟液滴中继续培养20-22小时，培养条件为体积百分浓度5% CO2、最大饱和湿度、38. 5-39°C ；6)核移植(1)卵母细胞的准备将体外培养40-44h的猪卵母细胞在透明质酸酶中作用，轻轻吹打除去周围卵丘细胞， 用玻璃拨卵针在实体显微镜下轻轻转动卵母细胞，挑选出胞质均勻且有极体排放的卵母细胞为核移植备用；(2)巴马香猪睾丸细胞的准备选择3-10代生长状态良好的细胞，去除培养液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90%的细胞已脱壁时，加入预热的DMEM终止消化，轻轻吹打，然后将细胞混合液移到离心管中，离心，弃掉上清液，加入核移植操作液，重悬睾丸细胞离心洗涤，弃上清后加入核移植操作液，重悬睾丸细胞，然后再向混合液中加入细胞松弛素B，使最终使用浓度为 5-7. 5 μ g/ml ；(3)操作滴的准备用上述调整好的睾丸细胞悬液，做成长条型液滴，上面覆盖矿物油，将挑选出的卵母细胞放在上述长条型液滴中，在显微操作仪下去核操作；吸取中等大小圆形、表面光滑，细胞膜折光度较好的睾丸供体细胞通过透明带切口注射到透明带下方，并轻点透明带使睾丸供体细胞与卵母细胞膜接触良好，形成了重构卵；(4)重构卵的融合/激活和培养将重构卵放在含有细胞松弛素B的胚胎培养液滴中，然后把恢复好的重构卵移到融合液中洗涤，然后进行融合/激活，融合后的重构卵用胚胎培养液洗涤，放入平衡好的含细胞松弛素B的胚胎培养液滴中培养3个小时，挑选融合好的重构卵，用胚胎培养液洗涤，然后移到胚胎培养液滴中培养，培养条件为39°C，体积百分浓度5% CO2，最大饱和湿度，得到体细胞核移植胚胎，将体细胞核移植胚胎移植到受体雌猪体内相应部位，怀孕到期后产下体细胞克隆的巴马香猪。
全文摘要
本发明公开了一种巴马香猪体细胞克隆的方法。方法按以下步骤进行操作1)相关试剂的配制；2)巴马香猪体细胞的培养；3)巴马香猪体细胞的冷冻；4)冷冻体细胞的解冻；5)猪卵母细胞的采集和体外成熟培养；6)体细胞核移植及胚胎移植。本发明的有益效果是1)加快国内转基因猪技术和人类异种器官移植的研究。2)加快了广西乃至全国畜牧业发展水平的速度。3)在学术上填补了国内空白。
文档编号C12N15/877GK102321670SQ20111031119
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者卢克焕, 卢晟盛 申请人:广西大学