结晶型抗-hTNFα抗体的制作方法

结晶型抗-hTNFα抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及结晶型抗-hTNFα抗体。本发明涉及用于将抗-hTNFα抗体结晶的分批结晶方法，其允许以工业规模制备该抗体；根据该方法获得的抗体晶体；含有所述晶体的组合物以及使用所述晶体和组合物的方法。
【专利说明】结晶型抗-hTNFa抗体
[0001]本申请是国际申请日为2007年10月25日的国际申请PCT/US2007/022622进入中国、申请号为200780040145.2的题为“结晶型抗-hTNFa抗体”的发明专利申请的分案申请。

【技术领域】
[0002]本发明涉及用于将抗-hTNFa抗体结晶的分批结晶法，其允许以工业规模制备该抗体；根据该方法获得的抗体晶体；含有所述晶体的组合物以及使用所述晶体和组合物的方法。

【背景技术】
[0003]a)抗体晶体
[0004]目前有超过100种单克隆抗体正处于临床研究第2期或第3期评估，mAb市场可视为最具前景的生物医药市场之一。由于所述药物必须以通常超过10mg的单剂量递送，因此急需发现满足稳定性、安全性和患者顺应性的适当配制策略。
[0005]然而，高度浓缩的液态mAb制剂展示增加的粘度、阻碍注射器通过患者友好细针的能力。此外，当与中度浓缩的溶液相比时，mAb分子在所述高浓度下的聚集趋势呈指数增加。总的，就安全性和稳定性要求而言，其不可接受。
[0006]因此，高mAb剂量的递送受限于大体积，其通常必须经由输液递送。此给药方式成本高且显著降低患者的顺应性。
[0007]因此，高度需要用于皮下注射的医药学上可应用的低体积mAb晶体悬浮液。理论上，归因于蛋白质结构运动受阻的晶格的刚性，影响mAb完整性的降解途径应显著减速。此外，可预期当将高度浓缩的晶体悬浮液与液体制剂相比时粘度增加将显著降低。关于持续释放，可能以使蛋白质晶体进入患者体内时缓慢溶解的方式产生或改造蛋白质晶体。由于将防止损害mAb结构的赋形剂和方法广泛应用，因此此举将为递送持续释放型制剂的极适宜方式。
[0008]尽管使用蛋白质晶体作为药物具有极大潜力，但已进行少数尝试以系统地评估此策略。
[0009]一熟知实例为胰岛素，其在数十年以前已成功结晶。现今，已充分描述胰岛素晶体悬浮液的用途，其提供已在市场上充分公认的稳定且长效的制剂。开发胰岛素晶体与使所有其它蛋白质结晶的间的差异可能与有序胰岛素聚集体在胰腺中天然形成的事实有关。因此，当使胰岛素与过量锌离子接触时，胰岛素晶体易于获得。多数其它蛋白质趋向于形成无序沉淀物而非晶体，且因此发现蛋白质的结晶条件为耗时且不简单的任务。
[0010]尽管对收集蛋白质晶体用于X射线绕射分析已产生极大关注，但由于基本上任何蛋白质均表现不同，因此发现适当结晶条件的探索仍为经验科学。至今，尚未发现可仅通过理性可靠地预测所选蛋白质的成功结晶条件的通则。因此，获得给定蛋白质的晶体始终被称为稍后无论设计任何预定应用的“瓶颈”。
[0011]为使事物甚至更具挑战性，归因于分子的可挠性，抗体经描述为尤其硬以便结晶。
[0012]然而,长时间以来已知免疫球蛋白晶体的实例。150年前由英国医师Henry BenceJones描述免疫球蛋白晶体的第一个实例，其自骨髓瘤患者的尿中分离出异常Ig轻链二聚体的晶体(Jones 1848)。自此,所述异常Ig被称作Bence Jones蛋白质。1938年,来自骨髓瘤患者血清的不同异常Ig的自发结晶得以描述(von Bonsdorf,Groth等人1938),其显然为Ig重链寡聚物(MW 200kDa)。
[0013]在接下来的三十年里，描述具有正常结构(两个重链与两个轻链相连接)的结晶型人类免疫球蛋白，其也主要自骨髓瘤患者(Putnam 1955)分离。Davies和合作者最先使用X-射线晶体绕射表征称为“Dob”的完整人类骨髓瘤抗体的结构(Terry，Matthews等人1968)，且在1971年确定其三维结构(Sarma，Silverton等人1971)。其它人继续其先行工作，得到 IgG" Kol " (Huber, Deisenhofer 等人 1976)、IgG “Meg” (Rajan, Ely 等人 1983)和犬淋巴瘤IgG2a(Harris, Larson等人1992)的晶体结构。
[0014]免疫球蛋白晶体在再溶解后保留其特殊免疫学活性。Nisonoff等人于1968年报导易于结晶的兔抗-对-氮杂苯甲酸酯抗体“X4”。抗体X4在结晶前以及在晶体再溶解后经广泛表征。发现[125I]-对-碘苯甲酸酯与再溶解的X4特异性地且有效结合；再溶解的晶体也显示对未纯化兔血清典型的多特异性Ouchterlony免疫扩散反应(Nisonoff,Zappacosta等人1968)。Connell和合作者描述称为“Tem”的人类骨髓瘤Y -免疫球蛋白-1 K (IgG-κ )，其在低温下自血清自发地结晶(Connell, Freedman等人1973)。发现Tem晶体充分形成且具有菱面体对称。含有Tem的血清经琼脂糖免疫扩散技术广泛表征。Tem晶体的再溶解溶液的电泳和免疫扩散展示其与通过冷冻沉淀法获自血清的物质相同且与分离的骨髓瘤蛋白相同(Connell，Freedman等人1973)。
[0015]Mills和合作者于1983年报导由白蛋白的人类单克隆抗体导致的异常晶体冷球蛋白血症(Mills,Brettman等人1983)。此处，自两个患者中分离到极相似立方形晶体。将晶体再溶解接着进行电泳和免疫电泳指示所述晶体包含两种比率为1:2的蛋白质组份，单克隆IgG-λ和人类血清白蛋白(Jentoft, Dearborn等人1982)。通过溶解原始晶体接着进行管柱层析以制备规模分离所述组份。尽管任一分离组份自身并不结晶，但重组合后原始二分复合物重新形成且随后结晶。再溶解、分离的IgG和其Fab片段与人类血清白蛋白的独特沉淀特征和免疫学反应性的深入研究指示两个再溶解、分离的组份的重新缔合在性质上具有免疫性，亦即结晶型抗体再溶解后仍具有其原生的高度特异性(对于人类血清白蛋白)结合特征(Mills, Brettman等人1983)。
[0016]近来，Margolin和合作者报导结晶型抗体的潜在治疗用途(Yang, Shenoy等人2003)。其发现治疗性单克隆抗体曲妥珠单抗(trastuzumab) (Herceptin ? )可结晶(Shenoy, Govardhan等人2002)。结晶型曲妥珠单抗悬浮液在小鼠肿瘤模型中具有治疗功效，因此证明结晶型曲妥珠单抗保留其生物活性(Yang, Shenoy等人2003)。
[0017]b)结晶技术
[0018]不同于某些其它科学或工程学努力，各种蛋白质的结晶不能使用确定的方法或算法成功进行。当然，如世界著名蛋白质结晶专家A.McPherson所解释,在最近20-30年间存在极大技术进步。McPherson提供关于大分子结晶的策略、对策、试剂和装置的广泛细节。然而其并未提供确保任何给定大分子实际上可通过本领域技术人员以合理成功期望值结晶的方法。McPherson说明(例如):“无论任何程序必须投入精力改善并优化系统(包括溶剂与溶质两者)的参数，以促使且促进分子的间的特异性结合相互作用且使其形成后稳定。问题的此后一方面通常依赖于所结晶的特定蛋白质或核酸的特定化学和物理特性” (McPherson 1999，第 159 页)。
[0019]蛋白质结晶领域技术人员广泛公认不存在获得所关注的新蛋白质、应用确定加工步骤且由此获得所需晶体的算法。
[0020]数种市售筛选系统(例如Hampton I和2、Wizzard I和II)允许以微升规模筛选特定蛋白质的潜在适当结晶条件。然而，该筛选系统获得的阳性结果未必允许以较大、工业上可应用的批次规模成功结晶。微升尺度的结晶试验向工业尺度的转化经描述为具有挑战性的任务(参见Jen等人，2001)。
[0021]Baldock等人(1996)报导微批次与汽相扩散用于初始筛选结晶条件的比较。使用一组结晶溶液筛选六种市售蛋白质。使用最普通汽相扩散法和三种微分批结晶法的变化形式(包括新颖蒸发技术)进行所述筛选。在所鉴别出的58个结晶条件中43个(74% )由微批次鉴别出，而41个(71%)由汽相扩散鉴别出。26个条件由两种方法共同发现，且若根本未使用微批次则17个(29% )条件将错失。此展示最通常用于初始结晶筛选的汽相扩散技术并不保证阳性结果。
[0022]c)hTNFa 抗体晶体
[0023]认为人类TNF a (hTNF a )为许多疾病的病原体。因此存在对治疗所述hTNF α相关病症的适当方法的巨大需要。一种具有前景的治疗方法包含施用医药学上有效剂量的抗人类TNF α抗体。近来命名为D2E7或通称名为阿达木单抗(adalimumab)的一种该抗体已进入市场且以商标HUMIRA ?销售。
[0024]W0-A-02/072636揭示完全、完整抗体利妥昔单抗(Rituximab)、英夫单抗(Infliximab)和曲妥珠单抗(Trastuzumab)的结晶。以毒性尚不清楚的化学物质进行多数结晶实验，如咪唑、2-环己基-乙烷磺酸酯(CHES)、甲基戊二醇、硫酸铜和2-吗啉代-乙烷磺酸酯(MES)。多数实例使用晶种以启始结晶。
[0025]W0-A-2004/009776揭示使用沉滴汽相扩散技术通过混合等体积(I μ I)的不同结晶缓冲液和D2E7F(ab)' 2或Fab片段进行的微升规模的结晶实验。尽管报导所述片段中的每一个的数种实验条件，但未报导完全、完整D2E7抗体的成功结晶。
[0026]因此不可获得制备任何给定抗人类TNF α完全抗体、尤其D2E7的晶体的方法。
[0027]因此根据本发明待解决的问题为开发用于抗-hTNFa抗体、尤其人类抗-hTNF a抗体D2E7的适当分批结晶条件，且确定可应用于对于工业抗体晶体制备相关的体积的结晶过程条件。同时应确定并不利用可负面影响所述抗体的医药适用性的毒性剂的结晶方法。


【发明内容】

[0028]令人惊奇地，通过以下观测结果解决上述问题:可能通过应用生理学上可接受的无机磷酸盐作为结晶诱导剂，以高于微升规模的分批结晶体积获得完全抗-hTNF α抗体的晶体。
[0029] 优选实施方案
[0030]本发明的第一方面涉及用于将抗-hTNFa抗体结晶的分批结晶法，其包含以下步骤:
[0031]a)如(例如)通过混合该抗体的水溶液(其中抗体优选以溶解形式存在)与包含作为结晶剂的呈溶解形式的无机磷酸盐的结晶水溶液，或者通过添加该呈固体形式的结晶剂，提供该抗体与作为结晶剂的无机磷酸盐混合的水溶液；和
[0032]b)培育所述含水结晶混合物直至形成所述抗体的晶体。
[0033]通常在约pH 3至约5、尤其约3.5至约4.5或约3.7至约4.2的范围内的所述含水结晶混合物的pH值下进行本发明的结晶方法。
[0034]此外，所述含水结晶混合物可含有至少一种缓冲剂。所述缓冲剂可尤其包含乙酸盐组份作为主要组份，尤其碱金属盐、尤其乙酸钠。通过添加酸、尤其乙酸将所述盐调节至所需PH值。在结晶方法的一优选实施方案中，所述含水结晶混合物中的缓冲剂浓度(总乙酸盐)为O至约0.5M或约0.02至约0.5M，例如约0.05至约0.3M或约0.15至约0.2M。
[0035]在本发明的结晶方法的另一特定实施方案中，用作沉淀剂的磷酸盐是选自磷酸氢盐，诸如磷酸单氢盐或磷酸二氢盐、尤其铵盐或碱金属盐，例如含有Na+或K+离子的盐或其包含至少两种不同盐的混合物。适当实例为:NaH2P04、Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, NH4H2PO4,(NH4)2HPO4及其混合物。
[0036]尤其，结晶混合物中的磷酸盐浓度在约I至约6M的范围内，例如约1.0至约4.0M或约1.0至约3.0M或约1.5至约2.8M或约2.0至约2.6M的范围内。
[0037]在本发明的一优选实施方案中，以约1:1的比率组合蛋白质溶液和结晶溶液。因此，原始结晶溶液中缓冲剂/结晶剂的摩尔浓度约高达结晶混合物中的2倍。
[0038]通常，以约Iml至约20000升，或Iml至约15000升，或Iml至约12000升，或约Iml至约10000升，或Iml至约6000升，或Iml至约3000升，或Iml至约1000升，或Iml至约100升，例如约50ml至约8000ml，或约10ml至约5000ml，或约100ml至约3000ml，或约I升至约1000升，或约10升至约500升范围内的每批体积进行结晶方法。
[0039]另外，可进行本发明的结晶方法以便获得以下另外结晶条件中的至少一种:
[0040]a)进行培育历时约I小时至约60天的间，例如约I至约30天或约2至10天；
[0041]b)在介于约0°C与约50°C的间，例如约4°C和约37°C的温度下进行培育；
[0042]c)结晶混合物中的抗体浓度(亦即蛋白质浓度)在约I至200mg/ml或I至10mg/ml的范围内，例如1.5至20mg/ml,尤其在约2至15mg/ml或5至10mg/ml范围内。可根据蛋白质测定的标准程序测定蛋白质浓度。
[0043]根据一尤其优选方法，在以下结晶混合物的条件下进行结晶:
[0044]磷酸盐=NaH2PO41.5 至 2.5M
[0045]缓冲剂:总乙酸盐O至0.3M
[0046]pH:3.6 至 4.2
[0047]抗-hTNFα 浓度:3 至 10mg/ml
[0048]温度:18至 24 °C
[0049]每批体积:1至1001
[0050]搅拌--无
[0051]持续时间:4至15天
[0052]通常通过添加在溶液中或呈固体形式的结晶剂至蛋白质溶液中来获得如上文概述的结晶混合物。两种溶液可但不必经缓冲。由于结晶混合物用蛋白质溶液“稀释”，因此原始结晶溶液中的结晶剂摩尔浓度和缓冲剂摩尔浓度通常高于结晶混合物中的浓度。
[0053]在另一实施方案中，本发明的结晶方法可进一步包括干燥所得晶体的步骤。适当干燥方法包含蒸发式干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、流化床干燥、喷雾冷冻干燥、近临界干燥、超临界干燥和氮气干燥。
[0054]在另一实施方案中，本发明的结晶方法可进一步包括通过离心、透滤、超滤或其它常用缓冲液交换技术用不同缓冲液交换结晶母液的步骤，例如含有摩尔质量在约300至8000道尔顿范围内的聚乙二醇(PEG)或PEG混合物的缓冲液。
[0055]本发明也涉及可通过如以上所定义的结晶方法获得的抗-hTNFa抗体的晶体，且一般而言涉及抗-hTNFa抗体的晶体。
[0056]本发明的晶体的特征通常在于针状形态，其最大长度I为约2-500 μ m或约100-300 μ m，且Ι/d比率为约3至30，但也可具有其它几何外观。
[0057]该晶体可获自多克隆抗体或优选获自单克隆抗体。
[0058]特别是，该抗体选自非嵌合或嵌合抗体、人源化抗体、非糖基化抗体、人类抗体和小鼠抗体。特别是，待结晶的抗体为任选进一步加工以便改善抗原结合性的非嵌合人类抗体。
[0059]优选地，所述晶体是获自IgG抗体，诸如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体。特别是，该抗体为群IgGl的完全抗人类TNF α抗体。
[0060]在一优选实施方案中，晶体是从分离的人类抗体制备，该分离的人类抗体通过表面等离子体共振测定以I X 10_8M或更低、更优选I X 1-9M或更低且甚至更优选5 X ΙΟ,Μ或更低的Kd和I X KT3iT1或更低的Ka速率常数与hTNF α解离，且在标准体外L929测定中以I X 1-7M或更低的IC50中和hTNF α细胞毒性。
[0061]特别是，所述晶体可从分离人类抗体以以下特征制备:a)如通过表面等离子体共振测定以IX ΙΟ?或更低的kf速率常数与人类TNFa解离；b)具有轻链⑶R3域，其包含SEQ ID N0:3或通过在位置1、4、5、7或8通过单个丙氨酸取代或通过在位置1、3、4、6、
7、8和/或9通过I至5个保守氨基酸取代自SEQ ID NO:3修饰的氨基酸序列；c)具有重链CDR3域，其包含SEQ ID NO:4或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11通过单个丙氨酸取代或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12通过I至5个保守氨基酸取代自SEQ IDNO:4修饰的氨基酸序列。
[0062]更优选地，抗体或其抗原结合部分以5X ΙΟΛ—1或更低的Iitjff与人类TNF α解离。甚至更优选地，抗体或其抗原结合部分以X KT4iT1或更低的kf与人类TNF α解离。
[0063]在一尤其优选实施方案中，自具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的分离人类抗体制备所述晶体。
[0064]最优选为如W0-A-97/29131所揭示从抗体D2E7或其功能等效物制备的晶体。该抗体是在中国仓鼠卵细胞(Chinese hamster ovary cell)中重组产生且其包含SEQ ID NO:6的重链序列和SEQ ID NO:5的轻链序列。
[0065]在另一实施方案中，本发明涉及固体、液体或半固体药物组合物，其包含(a)如权利要求15至26中任一项的抗-hTNFa抗体的晶体；和(b)至少一种医药学上可接受的稳定维持所述抗体晶体的赋形剂。
[0066]本发明的另一方面涉及固体、液体或半固体药物组合物，其包含:(a)如本文中所定义的抗-hTNFa抗体的晶体；和(b)至少一种医药学上可接受的囊封或包埋所述抗体晶体的赋形剂。该组合物可进一步包含(C)至少一种医药学上可接受的稳定维持所述抗体晶体的赋形剂。此外，可联合进行囊封和包埋。
[0067]特别是,所述组合物可具有高于约lmg/ml、尤其约200mg/ml或更高、例如约200至约600mg/ml或约300至约500mg/ml的抗体晶体浓度。
[0068]所述赋形剂可包含至少一种聚合型、任选可生物降解的载体或至少一种油剂或脂质载体。
[0069]所述聚合型载体可为选自由以下各物组成的群中的一种或多种的聚合物--聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩肽(poly (depsipeptide))、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(@-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧杂环己烷酮)、聚(乙二醇)、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有机)磷氮烯(poly (organo)phosphazene)、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烧酮)、顺丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇(pluronic polyols)、白蛋白、海藻酸酯、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、甘氨基聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖、其混合物和共聚物。
[0070]所述油(或油性液体)可为选自由以下各物组成的群中的一种或多种的油(或油性液体):油性杏仁油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯、豆蘧酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、辛基十二烷醇、橄榄油、花生油、杏仁油、芝麻油、大豆油、角鲨烷、液体甘油三酯、液体蜡、高级醇。
[0071]该脂质载体可为选自下列的一种或多种的脂质:脂肪酸和脂肪酸盐、脂肪醇、脂肪胺、脂肪酸的单甘油酯、甘油二酯和甘油三酯、磷脂、糖脂、留醇和蜡和相关类似物质。蜡进一步分类为天然和合成产品。天然物质包括获自植物、动物或矿物来源的蜡，诸如蜂蜡、巴西蜡棕或褐煤蜡。氯化萘和烯系聚合物为合成蜡产品的实例。
[0072]在一优选实施方案中，该组合物为包含如以上所定义抗-hTNFa抗体晶体，且抗体晶体浓度在约10至约400或约50至约300mg/ml范围内的可注射组合物。
[0073]在另一方面中，本发明涉及包含如以上所定义的抗-hTNFa抗体晶体且抗体晶体浓度高于约100mg/ml、例如为约150至约600mg/ml或约200至约400mg/ml的晶体衆液。
[0074]本发明还涉及用于治疗哺乳动物的方法，其包含向该哺乳动物施用有效量的如以上所定义完全抗-hTNFa抗体晶体或有效量的如以上所定义组合物的步骤。优选地，通过胃肠外途径、经口途径或通过注射施用该组合物。
[0075]此外，本发明涉及治疗个体中hTNFa相关病症的方法，其包含施用治疗有效量的如以上所定义的抗体晶体。
[0076]特别是，该hTNF α相关病症是选自:
[0077]自身免疫疾病，尤其类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾病综合征；感染性疾病、移植物排斥或移植物对抗宿主疾病、恶性疾病、肺部病症、肠道病症、心脏病症、炎性骨骼病症、骨再吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、暴发型肝炎、凝血障碍、烧伤、再灌注损伤、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形成、发热、牙周疾病、肥胖症和辐射毒性；脊椎关节病、肺部病症、冠状动脉病症、代谢障碍、贫血、疼痛、肝病症、皮肤病症、指甲病症或脉管炎、白塞氏病(Behcet' s disease)、强直性脊椎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩氏病(Crohn' s disease)相关病症、青年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、慢性斑块牛皮癣、年龄相关恶病质、阿尔茨海默病、脑水肿、炎性脑损伤、慢性疲劳综合征、皮肌炎、药物反应、脊髓中和/或其周围水肿、家族性周期性发热、费尔提氏综合征(Felty' s syndrome)、纤维化、肾小球性肾炎(例如链球菌感染后肾小球性肾炎或IgA肾病)、假肢松动、显微镜下多血管炎、混合型结缔组织病症、多发性骨髓瘤、癌症和恶病质、多器官病症、骨髓发育不良综合征、睾丸炎(orchitism)、骨质溶解、包括急性、慢性和胰脓肿的胰腺炎、牙周疾病、多发性肌炎、进行性肾衰竭、假性痛风、坏疽性脓皮病、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、类肉瘤病、硬化性胆管炎、中风、胸腹主动脉瘤修复(TAAA)、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、与黄热病疫苗接种有关的症状、与耳相关的炎性疾病、慢性耳部炎症或小儿耳部炎症、葡萄膜炎、坐骨神经痛、前列腺炎、子宫内膜异位、脉络膜新血管生成、狼疮、舍格伦综合征(Sjogren' ssyndrome)和湿性黄斑变性。
[0078]此外，本发明涉及如以上所定义的完全抗-hTNFa抗体晶体用于制备用以治疗如以上所定义的hTNFa相关疾病的药物组合物的用途。
[0079]最后，本发明提供如以上所定义适用于药物的抗-hTNFa抗体晶体。

【专利附图】

【附图说明】
[0080]图1:6天后实施例37的D2E7晶体。
[0081]图2:以ImL每批体积在室温下制备的D2E7晶体。
[0082]图3:以50mL每批体积在室温下制备的D2E7晶体。
[0083]图4:以10L每批体积在室温下制备的D2E7晶体。
[0084]图5:根据本发明制备的D2E7晶体和其双折射。
[0085]图6:经由不同号针注射的不同浓度的D2E7晶体悬浮液。
[0086]图7:D2E7晶体悬浮液的FT-1R分析。

【具体实施方式】
[0087]A.定义
[0088]“分批结晶方法”包含向待结晶的抗体溶液中添加包含优选呈溶解形式的结晶剂的结晶溶液的步骤。
[0089]可基于(例如)汽相扩散的“小规模结晶方法”包含以下步骤:混合微升范围内小体积的抗体溶液与含有结晶剂的储液器缓冲液；将一滴该混合物邻近于该储液器缓冲液的等分试样放置于一密封容器中；允许液滴与储液器的间的溶剂通过汽相扩散交换，在此期间该液滴的溶剂含量变化且若达到适当结晶条件则可观测到结晶。
[0090]在磷酸盐存在情况下，“结晶剂”有利于待结晶抗体的晶体形成。
[0091]“结晶溶液”含有该呈溶解形式的结晶剂。优选地，该溶液为水性系统，亦即其液体组份主要由水组成。例如，80至100wt%*95至100wt%*98至10(^丨％可为水。
[0092]抗体“晶体”为该蛋白质的一种固态物质形式，其与第二固体形式(亦即基本上呈无组织、异质固体形式存在的非晶形状态)不同。晶体具有规则三维结构，通常称为晶格。抗体晶体包含抗体分子的规则三维阵列。参见Giege, R.和Ducruix, A.Barrett,Crystallizat1n of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach,第二版，第1-16 页，Oxford University Press, New York(1999)。
[0093]如根据本发明结晶的“完全”或“完整”抗-hTNFa抗体为能够在体外和/或体内识别其抗原人类TNF α且与其抗原人类TNF α结合的功能抗体。抗体可启始与抗体与其抗原结合相关的患者的后续免疫系统反应，尤其直接细胞毒性、补体依赖型细胞毒性(CDC)和抗体依赖型细胞毒性(ADCC)。抗体分子具有由两个彼此共价结合的相同重链(MW各为约50kDa)和两个各与重链中的一个共价结合的相同轻链(MW各为约25kDa)组成的结构。4条链以典型“Y”基元排列。各重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个域CL组成。VH和VL区可进一步再分成称为互补判定区(CDR)的高变区，其中散布有称为框架区(FR)的较保守区域。各VH和VL包含3个⑶R和4个FR，其自氨基末端至羧基末端按以下顺序排列:FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。完整抗体分子具有两个抗原结合部位，亦即其为“二价的”。该两个抗原结合部位对于一种hTNFa抗原具有特异性，亦即该抗体具有“单特异性”。
[0094]“单克隆抗体”为获自B淋巴细胞(B细胞)的单纯系且识别同一抗原决定簇的抗体。完全单克隆抗体为彼等具有上述包括两个完整重链和两个完整轻链的典型分子结构的抗体。通常通过融合产生抗体的 B细胞与永生骨髓瘤细胞以产生在细胞培养物中持续产生单克隆抗体的B细胞融合瘤来制备单克隆抗体。可利用其它制备方法，例如在细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞培养物中使用噬菌体显示技术表达单克隆抗体；在诸如已经修饰以含有且表达全部人类B细胞基因组的牛、山羊、猪、兔、鸡或转基因小鼠的遗传修饰的动物中体内制备；或在诸如烟草和玉米的遗传修饰的植物中制备。可根据本发明结晶来自所有所述来源的抗-hTNF α抗体。
[0095]待根据本发明结晶的单克隆抗体包括“嵌合”抗-hTNFa抗体，其中重链和/或轻链的一部分与获自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体的相应序列一致或同源，而链的其余部分与获自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体的相应序列一致或同源。举例而言，可提及含有鼠类抗体的可变抗原结合部分和获自人类抗体的恒定部分的小鼠/人类嵌合体。
[0096]也包括非人类(例如鼠类)抗-hTNF α抗体的“人源化”形式。其为含有获自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体为使来自人类免疫球蛋白的互补决定区(CDR)或高变环(HVL)的残基通过来自诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种的具有所需功能性的CDR或HVL的残基置换的人类免疫球蛋白。人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基可经相应非人类残基置换以改善抗原结合亲和力。此外，人源化抗体可包含相应人类或非人类抗体部分中均不存在的残基。所述修饰对于进一步改善抗体功效而言可为必需的。
[0097]“人类抗体”或“完全人类抗体”为具有对应于由人类产生或重组产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。如本文中所用，术语“人类抗体”意欲包括具有获自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可在例如CDR且尤其CDR3中包括并非由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或位点特异性突变诱发或在体内通过体细胞突变而引入的突变)。然而，如本文中所用，术语“人类抗体”不欲包括已将获自诸如小鼠的另一哺乳动物物种的种系的CDR序列嫁接于人类框架序列上的抗体。
[0098]如本文中所用，术语“重组人类抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，诸如使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，自重组、组合人类抗体文库分离的抗体，自人类免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如 Taylor, L.D.，等人(1992) Nucl.Acids Res.20 =6287-6295)，或通过任何其它涉及剪接人类免疫球蛋白基因序列至其它DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人类抗体具有获自人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而在某些实施方案中，所述重组人类抗体是经受体外突变诱发(或当使用人类Ig序列转基因动物时，则为体内体细胞突变诱发)且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为当获自人类种系VH和VL序列且与人类种系VH和VL序列相关时在体内可不天然存在于人类抗体种系库内的序列。
[0099]如本文中所用，“中和抗体”(或“中和hTNF α活性的抗体”)意欲指与hTNF α的结合引起hTNFa的生物活性受抑制的抗体。可通过测量hTNF α生物活性的一或多种指标评估hTNF α生物活性的该抑制,该或所述指标诸如hTNF α诱发的细胞毒性(体外或体内)、hTNFa诱发的细胞活化和hTNFa与hTNF α受体的结合。可通过在本领域中已知的数种标准体外或体内测定中的一种或多种评估hTNFa生物活性的所述指标。优选地，通过抑制1^929细胞中於即(1诱发的细胞毒性来评估抗体中和hTNF α活性的能力。作为hTNF α活性的另一或替代性参数，可评估抗体抑制hTNF α诱发的ELAM-1在HUVEC上表达的能力，以作为hTNF α诱发细胞活化的量度。
[0100]“亲和力成熟”抗-hTNF α抗体为一或多个高变区中具有一或多种使得与亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力改善的变化的抗体。亲和力成熟抗体对标靶抗原将具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力值。通过在本领域中已知的方法产生亲和力成熟抗体。Marks等人，B1/TechnologylO:779-783 (1992)描述通过VH和VL域改组进行亲和力成熟。Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 91:3809-3813(1994) ;Scier 等人，Genel69:147-155 (1995)；Yelton 等人，J.1mmunol.155:1994-2004(1995) ；Jackson 等人，J.1mmunol.154(7):3310-9(1995);和 Hawkins 等人，J.Mol B1l.226:889-896 (1992)描述 CDR 和 / 或框架残基的随机突变诱发。
[0101]如本文中所用，“分离抗体”意欲指大体上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合hTNFa的分离抗体大体上不含特异性结合除hTNF α以外的抗原的抗体)。然而特异性结合hTNF α的分离抗体可对其他抗原(诸如来自其它物种的hTNF a分子)具有交叉反应性。此外，分离抗体可大体上不含其它细胞物质和/或化学物质。
[0102]如本文中所用，术语“人类TNFa ”(本文中缩写为hTNFa或简写为hTNF)意欲指以17kDa分泌形式和26kDa膜结合形式存在的人类细胞激素，其生物学活性形式包含非共价结合分子的三聚体。hTNFa的结构进一步描述于(例如)Pennica, D.,等人(1984)Nature 312:724-729 ；Davis, J.M.，等人(1987)B1chemistry 26:1322-1326 ;和Jones，E.Y.，等人(1989) Nature 338:225-228中。术语人类TNF α意欲包括重组人类TNFa (rhTNFa)，其可通过标准重组表达方法制备或在市面上购得(R&D Systems,目录号210-TA, Minneapolis, MN)。
[0103]如本文中所用，术语“kf”意欲指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。
[0104]如本文中所用，术语“Kd”意欲指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
[0105]如根据本发明结晶的特异性“亲本”抗-hTNFa抗体的“功能等效物”为展示相同抗原特异性，然而关于“亲本”抗体在氨基酸水平或糖基化程度方面分子组成不同的抗体。然而，所述差异可仅使得结晶条件并未偏离如本文中揭示的参数范围。
[0106]抗体晶体的“囊封”是指所并入晶体经至少一层涂层物质个别包被的制剂。在一优选实施方案中，所述包被晶体可具有持续溶解速率。
[0107]抗体晶体的“包埋”是指经囊封或未经囊封的晶体以分散方式并入固体、液体或半固体载体中的制剂。所述包埋结晶抗体分子可以受控、持续方式从载体中释放或溶解。
[0108]B.结晶方法
[0109]本发明的结晶方法原则上可适用于任何抗-hTNF α抗体。所述抗体可为多克隆抗体或优选为单克隆抗体。该抗体可为嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体或例如小鼠抗体的非人类抗体，其各呈糖基化或非糖基化形式。该方法尤其适用于D2E7和其功能等效物。
[0110]优选地，该抗-hTNF α抗体为IgG抗体，尤其群IgGl的抗人类TNF α抗体。
[0111]除非另作说明，否则本发明的结晶方法利用在本领域中熟知的技术设备、化学物质和方法。然而，如上文所说明，本发明是基于以下意外观测结果:特定结晶条件的选择、尤其特定结晶剂的选择任选进一步与特定PH条件和/或相应试剂(缓冲剂、抗体、结晶剂)的浓度范围组合首次允许可再现地且以大规模制备针对hTNF α的抗体、尤其非嵌合人类抗体的稳定晶体，其可经进一步加工以形成优良、高度有利药物组合物的活性成份。
[0112]进行该结晶方法的原料通常包含待结晶抗体的浓溶液。蛋白质浓度可(例如)在约5至75mg/ml范围内。该溶液可含有使该溶解抗体稳定的添加剂，且预先移除所述添加剂可为明智的。这可通过进行缓冲液交换步骤来实现。
[0113]优选地，所述用以进行结晶的原料含有于具有经调节在约3.2至8.2或约4.0至
8.0、尤其约4.5至6.5、优选约5.0至5.5范围内的pH值的水溶液中的抗体。可通过以约I至50mM、尤其约I至1mM的最终浓度应用的适当缓冲剂调节pH值。该溶液可含有如盐、糖、糖醇和界面活性剂的添加剂，例如其比例以溶液的总重量计为约0.01至15或0.1至5或0.1至2wt %，以进一步稳定溶液。赋形剂优选选自生理上可接受的通常应用于医药制剂的化合物。非限制性实例可提及盐，如NaCl ;界面活性剂，如聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯20 (吐温20);糖，如蔗糖、海藻糖；糖醇，如甘露糖醇、山梨糖醇；和缓冲剂，如磷酸盐基缓冲系统(如以上所定义的磷酸氢钠和磷酸氢钾缓冲液)、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、顺丁烯二酸盐缓冲液或丁二酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液；氨基酸，如组氨酸、精氨酸和甘氨酸。
[0114]可通过例如渗析或超滤的常规方法进行缓冲液交换。
[0115] 用作原料的水溶液的初始蛋白质浓度应在约0.5至约200或约I至约50mg/ml范围内。
[0116]根据最终批次量(其可在Iml至20000( 二万)升范围内)而定，将初始体积的该水性抗体溶液置于由惰性材料(例如玻璃、聚合物或金属)制成的适当容器(例如管状容器、瓶或槽)中。该水溶液的初始体积可对应于最终批次量的约30至80%、通常约50%。
[0117]必要时，填充入该容器后可使溶液达至标准化条件下。尤其，将温度调节为在约4°C和约37°C范围内。
[0118]接着将任选以与抗体溶液相同的方式预先调节的含有适当浓度的结晶剂的结晶溶液添加至抗体溶液中。
[0119]任选在适度搅拌下持续或间断地进行结晶溶液的添加以促进两种液体的混合。优选地，在振荡下在提供蛋白质溶液的条件下进行添加且以受拉方式添加结晶溶液(或呈固体形式的结晶剂)。
[0120]通过应用如以上所定义的磷酸盐、尤其磷酸氢盐且优选碱金属盐或至少两种不同碱金属盐的混合物作为结晶剂来起始抗体晶体的形成。结晶溶液含有浓度足以在该结晶混合物中提供范围在约I至6M内的磷酸盐的最终浓度的结晶剂。
[0121]优选地，结晶溶液另外含有酸性缓冲剂，亦即不同于抗体溶液的缓冲剂的缓冲剂，其浓度适于允许将结晶混合物的PH值调节至约3至5的范围内。
[0122]在该结晶溶液的添加完成后，可将因此获得的混合物进一步培育约I小时至约60天以获得最高产量的抗体晶体。若适当，则混合物可(例如)通过搅拌、适度搅拌、横摇或以本身已知的方式移动。
[0123]最后，可通过已知方法、例如过滤或离心分离所获得的晶体，例如通过在室温或4°C下在约200-20000rpm、优选500_2000rpm下离心。可弃去或进一步处理剩余母液。
[0124]若必要，则可洗涤且随后干燥因此所分离的晶体，或可以适于储存和/或最终使用悬浮于其中的抗体的不同溶剂系统交换母液。
[0125]根据本发明形成的抗体晶体形状可变化。形状通常可包括针状、锥状、球状和海胆状形状。晶体的尺寸可为高于nm至mm尺寸级(例如长度)。在一些实施方案中，晶体尺寸为至少约ΙΟμπι且裸眼可见。对于治疗性给药，晶体的尺寸将视给药途径而不同，例如对于皮下给药，晶体的尺寸可大于用于静脉内给药的晶体尺寸。
[0126]如先前关于蛋白质晶体和低分子量有机和无机分子的晶体所描述，可通过向结晶混合物中添加特定其它添加剂来改变晶体的形状。
[0127]若必要，则可验证晶体实际上为该抗体的晶体。可以显微镜分析抗体的晶体的双折射。一般而言，除非为立方体内部对称晶体，否则晶体将使偏振光的偏振平面旋转。在另一方法中，可分离、洗涤、再溶解且通过SDS-PAGE分析晶体且任选以抗Fe受体抗体将晶体染色。任选，也可使用标准测定测试再溶解抗体与其hTNFa的结合。
[0128]如根据本发明获得的晶体也可彼此交联。该交联可增强晶体的稳定性。交联晶体的方法描述于(例如)美国专利第5，849，296号中。可使用诸如戊二醛的双官能试剂交联晶体。交联后，可将晶体冷冻干燥且储存以用于(例如)诊断或治疗性应用中。
[0129]在一些情况下，可需要干燥晶体。可通过如氮气的惰性气体、真空炉干燥、冷冻干燥、蒸发、盘式干燥、流化床干燥、喷雾干燥、真空干燥或滚筒干燥来干燥晶体。适当方法为熟知的。
[0130]可将根据本发明形成的晶体维持于原始结晶溶液中，或其可经洗涤且与如惰性载体或成份的其它物质组合，以形成包含本发明晶体的组合物或制剂。所述组合物或制剂可用于(例如)治疗性和诊断应用中。
[0131]一优选实施方案为以使得制剂的晶体经赋形剂包埋或囊封的方式组合适当载体或成份与本发明的晶体。适当载体可取自以下非限制性组:聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(@-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧杂环己烷酮)、聚(乙二醇)、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有机)磷氮烯、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、顺丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、海藻酸酯、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、甘氨基聚糖、硫酸化多糖、其混合物和共聚物、SAIB、脂肪酸和脂肪酸盐、脂肪醇、脂肪胺、脂肪酸的单甘油酯、甘油二酯和甘油三酯、磷脂、糖脂、甾醇和蜡和相关类似物质。蜡进一步分类为天然和合成产品。天然物质包括获自植物、动物或矿物来源的蜡，诸如蜂蜡、巴西蜡棕或褐煤蜡。氯化萘和烯系聚合物为合成蜡产品的实例。
[0132]C.组合物
[0133]本发明的另一方面涉及包含抗-hTNF α抗体晶体与至少一种载体/赋形剂组合的组合物/制剂。
[0134]所述制剂可为固体、半固体或液体。
[0135]通过以悬浮液形式混合具有必要纯度的抗体与生理上可接受的添加剂，如载体、赋形剂和/或稳定剂(参看例如Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16版,Osol,A.编(1980))，以适于储存和/或使用的形式制备本发明的制剂，以另一方式冻干或干燥。也可任选并入其它活性成份，例如不同抗体、生物分子、化学合成或酶促合成的低分子量分子。
[0136]可接受的添加剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性。其非限制性实例包括:
[0137]-酸化剂，如乙酸、柠檬酸、反丁烯二酸、盐酸、苹果酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸、酒石酸。
[0138]-气雾剂推进剂，如丁烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、异丁烷、丙烷、三氯单氟甲烧。
[0139]-空气置换剂，如二氧化碳、氮；
[0140]-醇变性剂，如甲基异丁基酮、蔗糖八乙酸酯；
[0141]-碱化剂，如氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、二异丙醇胺、氢氧化钾、碳酸氢钠、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺；
[0142]-消泡剂，如二甲聚硅氧烷、聚二甲硅氧烷。
[0143]-抗菌防腐剂，如氯苄烷铵、氯苄烷铵溶液、氯苄硫铵、苯甲酸、苄醇、对羟基苯甲酸丁酯、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、氯甲酚、甲酚、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯酚、苯乙醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钠、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞、瑞香草酚。
[0144]-抗氧化剂，如抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、甲醛合次硫酸钠、偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、二氧化硫、生育酚、生育酚赋形剂；
[0145]-缓冲剂，如乙酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠溶液、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、组氨酸。
[0146]-螯合剂，如依地酸二钠、乙二胺四乙酸和盐、依地酸；
[0147]-包被剂，如羧甲基纤维素钠、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙基纤维素、明胶、医药包糖衣、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物、甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、虫胶、蔗糖、二氧化钛、巴西棕榈蜡、微晶蜡、玉米蛋白、聚氨基酸、如PLGA等的其它聚合物和SAIB。
[0148]-着色剂，如氧化铁。
[0149]-络合剂，如乙二胺四乙酸和盐(EDTA)、依地酸、龙胆酸乙醇酰胺、硫酸羟基喹啉。
[0150]-干燥剂，如氯化钙、硫酸钙、二氧化硅。
[0151]-乳化和/或增溶剂，如阿拉伯胶、胆固醇、二乙醇胺(助剂)、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、单甘油酯和甘油二酯、单乙醇胺(助剂)、油酸(助剂)、油醇(稳定剂)、泊洛沙姆(PO1xamer)、聚氧化乙烯50硬脂酸酯、聚烃氧35蓖麻油、聚烃氧40氢化蓖麻油、聚烃氧10油基醚、聚烃氧20十六基十八基醚、聚烃氧40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、单硬脂酸丙二醇酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蜡。
[0152]-助滤剂，如粉末状纤维素、纯化的硅藻土。
[0153]-香料和芳香剂，如茴香脑、苯甲醛、乙基香兰素、薄荷脑、水杨酸甲酯、谷氨酸单钠、橙花油、胡椒薄荷、薄荷油、薄荷精、玫瑰油、浓玫瑰水、瑞香草酚、吐鲁香脂酊、香草、香草兰酊、香兰素。
[0154]-助流剂和/或防结块剂，如硅酸钙、硅酸镁、胶状二氧化硅、滑石。
[0155]-保湿剂，如甘油、己二醇、丙二醇、山梨糖醇；
[0156]-软膏基质，如羊毛脂、无水羊毛脂、亲水性软膏、白色软膏、黄色软膏、聚乙二醇软膏、石蜡、亲水性石蜡、白色石蜡、玫瑰水软膏、角鲨烷。
[0157]-增塑剂，如蓖麻油、羊毛脂、矿物油、石蜡、甲酸苄基苄酯、氯丁醇、邻苯二甲酸二乙酯、山梨糖醇、二乙酰化单甘油酯、邻苯二甲酸二乙酯、甘油(glycerin、glycerol)、单-乙酰化单甘油酯和二-乙酰化单甘油酯、聚乙二醇、丙二醇、三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、乙醇。
[0158]-多肽，如低分子量多肽(少于约10个残基)；
[0159]-蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；
[0160]-聚合物膜，如乙酸纤维素膜。
[0161]-溶剂，如丙酮、醇、稀醇、水合戊烯、苯甲酸苄酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米油、棉籽油、乙酸乙酯、甘油、己二醇、异丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基异丁基酮、矿物油、花生油、聚乙二醇、碳酸丙二酯、丙二醇、芝麻油、注射用水、无菌注射用水、无菌冲洗水、纯水、液体甘油三酯、液体蜡、高级醇。
[0162]-吸附剂，如粉末状纤维素、炭、纯化的硅藻土、二氧化碳吸附剂、氢氧化钡、石灰、碱石灰。
[0163]-硬化剂，如氢化蓖麻油、十六醇十八醇混合物、十六烷醇、十六基酯蜡、硬脂、石蜡、聚乙烯赋形剂、十八烷醇、乳化蜡、白蜡、黄蜡。
[0164]-栓剂基质，如可可脂、硬脂、聚乙二醇；
[0165]-悬浮和/或增粘剂，如阿拉伯胶、琼脂、藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、纯化膨润土、岩浆膨润土、卡波姆(Carb0mer)934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠
12、角叉菜胶、微晶和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、丙二醇海藻酸酯、二氧化硅、胶状二氧化硅、海藻酸钠、黄蓍胶、黄原胶；
[0166]-甜味剂，如天冬甜素、葡萄糖结合剂(dextrates)、葡萄糖、赋形剂葡萄糖、果糖、甘露糖醇、糖精、糖精钙、糖精钠、山梨糖醇、溶液山梨糖醇、蔗糖、可压缩糖、糖果店的糖、糖浆；
[0167]-片剂粘合剂，如阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、糊精、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯酮、预胶凝化淀粉、糖浆。
[0168]-片剂和/或胶囊稀释剂，如碳酸钙、磷酸氢二钙、磷酸三钙、硫酸钙、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡萄糖结合剂、糊精、葡萄糖赋形剂、果糖、高岭土、乳糖、甘露糖醇、山梨糖醇、淀粉、预胶凝化淀粉、蔗糖、可压缩糖、糖果店的糖；
[0169]-片剂崩解剂，如藻酸、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯酮、阳离子交换树脂、羟乙酸淀粉钠、淀粉、预胶凝化淀粉。
[0170]-片剂和/或胶囊润滑剂，如硬脂酸钙、二十二碳烷酸甘油酯、硬脂酸镁、轻质矿物油、聚乙二醇、硬脂基富马酸钠、硬脂酸、纯化硬脂酸、滑石、氢化植物油、硬脂酸锌；
[0171]-张力剂，如葡萄糖、甘油、甘露糖醇、氯化钾、氯化钠-载体:调味和/或增甜芳香酏剂、混合苯甲醛酏剂、异酒精性酏剂、薄荷水、山梨糖醇溶液、糖浆、叶鲁香脂(toll!balsam)糖衆。
[0172]-载体，如油性杏仁油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯、十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、十四烷醇、辛基月桂醇、橄榄油、花生油、杏仁油、芝麻油、大豆油、角鲨烷；固体载体糖球体；无菌抑菌注射用水、抑菌氯化钠注射液、液体甘油三酯、液体蜡、闻级醇。
[0173]-防水剂，如环甲聚硅氧烷、二甲聚硅氧烷、聚二甲硅氧烷；
[0174] -湿润剂和/或增溶剂，如氯苄烷铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶徵客库酷纳(docusate)、壬苯醇酿 9 (nonoxynol 9)、壬苯醇酿 10 (nonoxynol 10)、辛苯昔醇9(octoxynol 9)、泊洛沙姆、聚烃氧35蓖麻油(polyoxyl 35 castor oil)、聚烃氧40(polyoxyl 40)、氢化蓖麻油、聚烃氧50硬脂酸酯(polyoxyl 50 stearate)、聚烃氧10油基醚(polyoxyl 10 oleyl ether)、聚烃氧20 (polyoxyl 20)、十六基十八基醚(cetostearyl ether)、聚烃氧 40 硬脂酸酯(polyoxyl 40 stearate)、聚山梨醇酯 20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、月桂基硫酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、泰洛沙泊(tyloxapol)；
[0175]晶体可与聚合型载体组合以提供稳定性和/或持续释放。所述聚合物包括生物兼容性和可生物降解的聚合物。聚合型载体可为单一聚合物类型或其可由聚合物类型的混合物组成。上文已描述聚合型载体的非限制性实例。
[0176]优选成份或赋形剂的实例包括:
[0177]-诸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸的氨基酸的盐；
[0178]-单糖，诸如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖；
[0179]-二糖，诸如乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖；
[0180]-多糖，诸如麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉、糖原；
[0181]-醛醇，诸如甘露糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨糖醇；
[0182]-葡糖醛酸、半乳糖醛酸；
[0183]-环糊精，诸如甲基环糊精、羟丙基-(3-环糊精)；
[0184]-无机盐，诸如氯化钠、氯化钾、氯化镁、钠和钾的磷酸盐、硼酸碳酸铵和磷酸铵；
[0185]-有机盐，诸如乙酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐；
[0186]-乳化剂或增溶剂，如阿拉伯胶、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯和其它脱水山梨糖醇衍生物、聚烃氧(polyoxyl)衍生物、蜡、聚氧化乙烯衍生物、脱水山梨糖醇衍生物；和
[0187]-增粘试剂，如琼脂、藻酸及其盐、瓜尔胶、果胶、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、纤维素和其衍生物、碳酸丙二酯、聚乙二醇、己二醇和泰洛沙泊。
[0188]本文中所描述的制剂也包含有效量的结晶抗体。尤其，本发明的制剂可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体晶体。“治疗有效量”是指在必要剂量下和历时必要时间实现所需治疗结果有效的量。抗体晶体的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病病况、年龄、性别和体重的因素和抗体在个体中引发所需反应的能力而不同。治疗有效量也为治疗有利效应优于抗体的任何毒性或不利效应的量。“预防有效量”是指在必要剂量下和历时必要时间实现所需预防结果有效的量。通常，因为预防剂量在疾病的前或疾病早期用于个体，因此预防有效量将低于治疗有效量。
[0189]使用标准方法可易于确定适当剂量。抗体可一次或经一系列治疗适当地施用患者。根据上述因素，约I μ g/kg至约50mg/kg,例如0.l_20mg/kg的抗体为用于施用患者的初始备选剂量，无论(例如)通过一或多次独立给药或通过连续输液。视病状而定，典型日剂量或周剂量可在约I μ g/kg至约20mg/kg或更多的范围内，重复治疗直至出现疾病病症的所需抑制。然而，其它给药方案可为适用的。在一些情况下，当再溶解时制剂包含至少约lg/L或更大的抗体浓度。在其它实施方案中，当再溶解时，抗体浓度为至少约lg/L至约100g/L。
[0190]抗体的晶体或包含所述晶体的制剂可单独施用或作为医药制剂的一部分施用。其可通过胃肠外、经口或局部途径施用。例如其可通过经口、肺部、经鼻、经耳、肛门、皮肤、眼部、静脉内、肌肉内、动脉内、腹膜内、粘膜、舌下、皮下、经皮、局部或颅内途径施用或施用至颊腔中。给药技术的特定实例包含肺部吸入、病灶内应用、针注射、干粉剂吸入、皮肤电穿孔、气雾剂递送和无针注射技术，包括无针皮下给药。
[0191]现将通过以下非限制性、说明性实例更详述地说明本发明。熟习的阅读者在说明书的概括部分指导下且基于其常识，将能够提供本发明的其它实施方案而无需不当实验。
[0192]实验部分
[0193]A.材料
[0194]a)蛋白质
[0195]冷冻单克隆抗体(mAb)D2E7是获自Abbott实验室。从原始mAb浓度为50mg/mL的药品批次进行所有实验。
[0196]b)精制化学物质
[0197]乙酸钠是获自Griissing GmbH, Filsum。不同聚合度的聚乙二醇是获自ClariantGmbH, Sulzbach。此外，商业结晶筛和试剂(Hampton Research, Nextal B1technologies)是用于某些微量实验。所有其它化学物质是来自Sigma-Aldrich, Steinheim或Merck,Darmstadt。
[0198]B.通用方法
[0199]a)将D2E7药物解冻
[0200]在25 °C下于搅动水浴中将D2E7解冻。 [0201 ] b)缓冲液交换-方法A
[0202]将D2E7溶液的等分试样吸入30KDaMWCO Vivaspin 20浓缩器(Vivascience)中。以新缓冲液以1: 10的比率稀释蛋白质样品且通过在5，OOOXg在4°C下离心(Sigma 4K15实验室离心机)，使样品体积返回至原始样品体积。重复稀释/离心步骤一次，使得原始样品缓冲液的稀释度为1: 100。调节蛋白质浓度后，将溶液经0.2μπι注射器驱动的过滤单元无菌过滤。
[0203]b)缓冲液交换-方法B
[0204]将D2E7 溶液的等分试样置于 SLIDE-A-LYZER 透析盒(Pierce B1technologyInc.)中。将透析盒置于含有所选缓冲液的烧杯中，且在4°C在搅拌下隔夜进行缓冲液交换。调节蛋白质浓度后，经0.2 μ m注射器驱动的过滤单元将该溶液无菌过滤。
[0205]c)0D280_蛋白质浓度测量
[0206]使用ThermoSpectronics UVl 装置，在 280nm 的波长下，应用 1.39cm2mg_1 的消光系数评估蛋白质浓度。出于此目的，在14，OOOrpm下离心结晶浆料的等分试样且测定上清液中的残余蛋白质浓度。
[0207]d) pH 值测量
[0208]通过使用Mettler Toledo MP220 pH计进行pH值测量。使用Inlab 413电极和Inlab 423微电极。
[0209]e)结晶方法
[0210]el)微量结晶-使用Hydra II结晶机器人和Greiner 96孔板(三个滴孔,HamptonResearch)进行沉滴汽相扩散Hydra II初始结晶筛选。设置板后，以Clearseal薄膜(Hampton Research)密封各孔。
[0211]e2)微量结晶-悬滴汽相扩散
[0212]分别使用VDX板(具有密封剂,Hampton Research)和OptiClear塑料盖玻片(方形，Hampton Research)或娃化玻璃盖玻片(圆形，Hampton Research)进行悬滴汽相扩散实验。制备储液器溶液后，在盖玻片上将一滴储液器溶液与一滴蛋白质溶液混合，且以翻转盖玻片以使得液滴悬在储液器上的方式将孔密封。
[0213]e3)分批结晶-方法A (24孔板)
[0214]通过于孔中混合蛋白质溶液与等量的结晶缓冲液(500 μ I)进行分批结晶。随后以胶带密封孔以防止水蒸发。
[0215]e4)分批结晶-方法B (Eppendorff反应管)
[0216]通过于1.5mL或2mL Eppendorff反应管中混合蛋白质溶液与等量的结晶缓冲液进行分批结晶。
[0217]e5)分批结晶-方法C (Falcon管，搅动)
[0218]通过于50mL Falcon管中混合蛋白质溶液与等量的结晶缓冲液进行分批结晶。恰在封闭后，将管置于实验室摇动器(GFL 3013或GFL 3015)上或者通过翻转搅动。通过应用所述方法，避免将搅拌器引入样品中。
[0219]e6)分批结晶-方法D (I升聚丙烯容器)
[0220]通过于杀菌的I升聚丙烯瓶中混合蛋白质溶液与等量的结晶缓冲液进行分批结晶。恰在封闭后，在无搅动情况下，将容器储存在室温下。通过应用所述方法，避免将搅拌器引入样品中。
[0221]f) SDS-PAGE
[0222]通过将蛋白质浓度调节至8 μ g/20 μ L制备样品。以含有溴酚蓝的SDS/Tris/甘油缓冲液稀释样品。
[0223]使用Invitrogen NuPage 10 % Bis-Tris 凝胶、NuPage MES SDS 电泳缓冲液和Mark 12宽范围蛋白质标准进行定性SDS PAGE分析。将20 μ L样品吸入凝胶凹槽中。使凝胶电泳且以乙酸/甲醇试剂固定后，使用Novex胶状蓝染色套组进行染色。使用Invitogen凝胶-干燥干燥溶液干燥凝胶。
[0224]g)光学显微术
[0225]使用Zeiss Ax1vert 25或Nikon Labophot显微镜观测晶体。后者装备有偏振光滤器组和JVC TK C1380彩色摄像机。
[0226]h) SE-HPLC
[0227]通过SE-HPLC评估D2E7样品的聚集程度。使用D1nex P680泵、AS1-100自动进样器和 UVD170U 检测器装置。通过 Amersham B1science Superose 6 10/300GL 凝胶过滤管柱，应用生效的Abbott标准方案(CL16-PS-02，阿达木单抗纯度)将聚集的物质与单体分离。
[0228]C.汽相扩散结晶实验
[0229]以下实施例中所给出的浓度值为关于抗体溶液和储液器溶液的两种溶液混合前的初始值。
[0230]若未另外描述，则所有pH值是指乙酸盐缓冲储备液在其与如结晶剂的其它物质组合前的pH值。
[0231]若未另外描述，则所有缓冲液摩尔浓度是指在通常使用冰醋酸进行的pH值调节前的储备溶液中的乙酸钠浓度。
[0232]实施例1-以悬滴汽相扩散模式进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0233]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0234]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4，000溶液和Milli Q水(充分脱盐且任选预先蒸馏)制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 4，000以2%梯度从约6%w/v变化至约28%w/v。pH值始终为约5.2。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0235]结果:从所评估的24个孔未观测到晶体。
[0236]实施例2-以悬滴汽相扩散模式、不同蛋白质浓度进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0237]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至50mg/mL。除蛋白质浓度外,处理条件与实施例1相同。
[0238]结果:从所评估的24个孔未观测到晶体。
[0239]实施例3-以悬滴汽相扩散模式进行的PEG 400/乙酸钠栅条筛选
[0240]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0241]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 400溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 400以2%梯度从约30% w/v变化至约40% w/v。pH值始终为约5.2。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0242]结果:从所评估的12个孔未观测到晶体。
[0243]实施例4-以悬滴汽相扩散模式、不同蛋白质浓度进行的PEG 400/乙酸钠栅条筛选
[0244]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至50mg/mL。除蛋白质浓度外,处理条件与实施例3相同。
[0245]结果:从所评估的12个孔未观测到晶体。
[0246]实施例5-以悬滴汽相扩散模式进行的PEG 10，000/乙酸钠栅条筛选
[0247]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0248] 使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50% w/v PEG 400溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 10，000以2%梯度从约4% w/v变化至约14% w/v。pH值始终为约5.2。以一式两份评估各条件。将约IuL蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0249]结果:从所评估的12个孔未观测到晶体。
[0250]实施例6-以悬滴汽相扩散模式、不同蛋白质浓度进行的PEG 10，000/乙酸钠栅条筛选
[0251]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至45至55mg/mL,优选为50mg/mL。除蛋白质浓度外,处理条件与实施例5相同。
[0252]结果:从所评估的12个孔未观测到晶体。
[0253]实施例7-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 400/乙酸钠栅条筛选
[0254]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0255]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50% w/v PEG 10，000溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 400为约32% w/v和约34% w/v。pH值为约4.2、4.7、5.2、5.7、6.2或6.7。以一式两份评估各条件。将约IuL蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0256]结果:从所评估的24个孔未观测到晶体。
[0257]实施例8-以悬滴汽相扩散模式、不同蛋白质浓度和设置进行的PEG 400/乙酸钠栅条筛选
[0258]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至50mg/mL。除蛋白质浓度外,处理条件与实施例7相同。
[0259]结果:从所评估的24个孔未观测到晶体。
[0260]实施例9-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 400/乙酸钠栅条筛选
[0261]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0262]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50% w/v PEG 400溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，所用乙酸盐缓冲液摩尔浓度为约0.025Μ、0.05Μ、0.075Μ、0.15Μ、0.2Μ或0.25Μ。PEG 400从约32% w/v变化至约34% w/v。pH值为约5.7或4.2。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0263]结果:从所评估的48个孔未观测到晶体。
[0264]实施例10-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 400/乙酸钠栅条筛选
[0265]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0266]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50% w/v PEG 400溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，所用乙酸盐缓冲液摩尔浓度为约0.025Μ、0.05Μ或0.1Μ。PEG 400为约28% w/v或约30%w/v。pH值为约5.2、5.7、6.2或6.7。以一式两份评估各条件。将约IuL蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0267]结果:从所评估的48个孔未观测到晶体。
[0268]实施例11-以悬滴汽相扩散模式进行的PEG 400组合PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0269]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0270]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50% w/v PEG 4，000溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 4，000以2%梯度从约4% w/v变化至约8% w/v。同时,将浓度为约24% w/v、26% w/v、28% w/v或30% w/v的PEG 400添加至PEG 4，000/乙酸盐溶液中。pH值始终为约5.2。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0271]结果:从所评估的24个孔未观测到晶体。
[0272]实施例12-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 400组合PEG4，000/乙酸钠栅条筛选
[0273]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.2的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0274]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50% w/v PEG 4，000溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 4，000以2%梯度从约4% w/v变化至约8% w/v。同时,将浓度为约30% w/v、32% w/v、34% w/v或36% w/v的PEG 400添加至PEG 4，000/乙酸盐溶液中。pH值始终为约4.2。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0275]结果:从所评估的24个孔未观测到晶体。
[0276]实施例13-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0277]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约6.5,6.0,5.5,5.0,4.5或4.0的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至10mg/mL。
[0278]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50% w/v PEG 4，000溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 4，000以2%梯度从约4% w/v变化至约26% w/v。所用乙酸盐缓冲液的pH值与相应蛋白质缓冲液相同。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的三十天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0279]结果:从所评估的144个孔未观测到晶体。
[0280]实施例14-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0281]除恒定保持于约0.2Μ(沉淀缓冲液的摩尔浓度)的乙酸盐缓冲液摩尔浓度外，实验条件与实施例13相同。
[0282]结果:从所评估的144个孔未观测到晶体。
[0283]实施例15-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0284] 除恒定保持于0.1M(沉淀缓冲液的摩尔浓度)的乙酸盐缓冲液摩尔浓度外，实验条件与实施例13相同。
[0285]结果:从所评估的144个孔未观测到晶体。
[0286]实施例16-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0287]除恒定保持于约0.4Μ(沉淀缓冲液的摩尔浓度)的乙酸盐缓冲液摩尔浓度外，实验条件与实施例13相同。
[0288]结果:从所评估的144个孔未观测到晶体。
[0289]实施例17-PEG 4，000/乙酸钠大量实验
[0290]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.5的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0291]将各500 μ L的4份等分试样吸入4个Eppendorff反应管中。将于0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中的24% PEG 4，000溶液滴定至蛋白质溶液中直至溶液变得稍微不透明。随后，将水吸至溶液中，直至溶液恰好再次变得澄清。该方法称为大量结晶。在室温下对两个样品进行滴定且在4°C下对两个其它样品进行滴定。随后，将各对样品中的一个分别储存在室温或4°C下。在接下来的一周内多次进行样品的I μ L等分试样的显微镜观察。
[0292]结果:该4个样品未出现晶体。
[0293]实施例18-以悬滴汽相扩散模式、不同温度进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0294]实验条件与实施例13相同。然而，管设置且储存在4°C下。
[0295]结果:从所评估的144个孔未观测到晶体。
[0296]实施例19-以悬滴汽相扩散模式、不同蛋白质浓度进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0297]除蛋白质浓度经调节至5mg/mL外，实验条件与实施例13相同。
[0298]结果:从所评估的144个孔未观测到晶体。
[0299]实施例20-以悬滴汽相扩散模式进行的硫酸铵/乙酸钠栅条筛选
[0300]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.5的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0301]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、硫酸铵贮备液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且硫酸铵浓度以0.25Μ为梯度从0.5Μ变化至2.5Μ。乙酸盐缓冲液的PH值始终为约5.5。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板设置且储存在室温下。在接下来的两周内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0302]结果:从所评估的18个孔未观测到晶体。
[0303]实施例21-以悬滴汽相扩散模式进行的氯化钠/乙酸钠栅条筛选
[0304]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.5的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0305]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、氯化钠贮备液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且氯化钠浓度以0.5Μ为梯度变化，自1.5Μ变化至
2.5Μ。乙酸盐缓冲液的pH值始终为约5.5。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板设置且储存在室温下。在接下来的两周内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0306]结果:从所评估的6个孔未观测到晶体。
[0307]实施例22-以悬滴汽相扩散模式进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选，洗涤剂的影响
[0308]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.5的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL。
[0309]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50% w/v PEG 4，000溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 4，000以2%为梯度从约10% w/v变化至约20% w/v ο乙酸盐缓冲液的pH值始终为约5.5。此外，将聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛尼克(Pluronic)F 68分别以浓度O %、0.02%和0.1 %添加至如上所述的任何所得缓冲液中。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板设置且储存在室温下。在接下来的两周内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体混合物的液滴。
[0310]结果:从所评估的84个孔未观测到晶体。可观测到所评估的洗涤剂对结晶系统的性能无影响。
[0311]实施例23-以悬滴汽相扩散模式进行的乙酸锌/乙酸钠栅条筛选
[0312]将D2E7缓冲入含有约0.1M乙酸钠pH值为约5.5的缓冲液中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0313]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、乙酸锌储备液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且乙酸锌浓度以约0.2Μ为梯度从0.1M变化至0.9Μ。乙酸盐缓冲液的PH值始终为约5.5。以一式两份评估各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板设置且储存在室温下。在接下来的两周内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0314]结果:从所评估的12个孔未观测到晶体。
[0315]实施例24-以汽相扩散模式广泛筛选条件
[0316]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL、10mg/mL 或 20mg/mLo
[0317]使用Hydra II结晶机器人,使用数种市售结晶筛,将96孔Greiner板设置在室温下。以约1: 1、优选1:1的比率混合蛋白质溶液与结晶剂。
[0318]使用以下筛:
[0319]Hampton Crystal Screen 1&2(Hampton Research)；
[0320]Hampton Index Screen (Hampton Research)；
[0321]Hampton SaltRX Screen(Hampton Research)；
[0322]Nextal The Classics、The Classics Lite、The PEGs>The An1ns、The pH clear和 The Ammonium Sulfate (均来自 Nextal B1technologies)。
[0323]向结晶剂中添加蛋白质(每个条件三滴，含有如上所述的三种不同蛋白质浓度)后，以Clearseal薄膜将板密封。以四重复设置各板且随后分别储存在室温、4°C、27°C和37°C下。分别在5天和12天后进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0324]结果:从所评估的864个商业条件，在至少两周后，2个在如下所定义的蛋白质浓度和温度下产生晶体。
[0325]-0.1M无水乙酸钠pH 4.6、0.9M磷酸二氢钠、0.9M磷酸二氢钾(=Nextal TheAn1ns, E3)、10 或 20mg/mL 和 27°C，或 20mg/mL 和 37°C。
[0326]-0.1M Bis-Tris Propane pH 7.0、1.5M硫酸铵(=Hampton SaltRX,F2)、5、10 或20mg/mL 和 27 °C。
[0327] 晶体展示针状丛集状形态学。
[0328]市售筛的以下条件并未产生晶体。对于详细溶液组成请参阅www.hamptonresearch.com 和 www.nextalb1tech.com:
[0329]Hampton Crystal Screen 1-所有条件(48)
[0330]Hampton Crystal Screen 2_ 所有条件(48)
[0331]Hampton Index Screen-所有条件(96)
[0332]Hampton SaltRX Screen-除 “F2” 外的所有条件(95)
[0333]Nextal-The Classics-所有条件(96)
[0334]Nextal-The Classics Lite-所有条件(96)
[0335]Nextal-The PEGs-所有条件(96)
[0336]Nextal-The An1ns-除 “E3” 外的所有条件(95)
[0337]Nextal-The pH Clear-所有条件(96)
[0338]Nextal-The Ammonium Sulfate-所有条件(96)
[0339]实施例25-以悬滴汽相扩散模式、不同设置进行的PEG 4，000/乙酸钠栅条筛选
[0340]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL、10mg/mL 或 20mg/mLo
[0341]使用经涂脂的VDX板和圆形硅化盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4，000溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 4，000浓度以2%为梯度从4%变化至26%。pH值始终为约5.5。以如上所述的三种蛋白质浓度设置各条件。在圆形硅化盖玻片上混合约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液，且以翻转盖玻片密封孔，产生悬滴实验。将板储存在室温下。6天后进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0342]结果:从所评估的72个孔未观测到晶体。
[0343]实施例26-应用Hampton洗涤剂筛的悬滴汽相扩散实验
[0344]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL。
[0345]使用经涂脂的VDX板和圆形硅化盖玻片。通过于各孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4，000溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1Μ，且PEG 4，000浓度为约12% w/v或14% w/v。pH值始终为约5.5。在圆形娃化盖玻片上混合约4 μ L蛋白质溶液与Hampton筛的约IyL特定洗涤剂溶液。随后将液滴与5 μ L特定储液器溶液混合，且以翻转盖玻片密封孔，产生悬滴实验。将板储存在室温下。6天后进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0346]结果:从所评估的144个孔未观测到晶体。
[0347]实施例27-使用Hampton PEG/1 on筛的悬滴汽相扩散
[0348]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL 或 10mg/mLo
[0349]使用经涂脂的VDX板和圆形硅化盖玻片。将500 μ L 48种缓冲液制剂中的每一个吸入孔中且分别与250 μ L Milli Q水混合。将约I μ L蛋白质样品吸于盖玻片上且随后与约IuL特定孔的储液器溶液混合。以翻转盖玻片密封孔，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的7天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0350]结果:自所测试的96种条件未观测到晶体。
[0351]实施例28-使用Hampton PEG/1 on筛、不同设置的悬滴汽相扩散
[0352]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL。
[0353]实验条件与实施例27相同，其例外情况为将500 μ L 48种缓冲液制剂中的每一个吸入孔中且分别与500 μ L Milli Q水混合。
[0354]结果:自所测试的48种条件未观测到晶体。
[0355]实施例29-使用Hampton低离子强度筛的悬滴汽相扩散
[0356]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL。
[0357]使用经涂脂的VDX板和圆形硅化盖玻片。将ImL 24% w/v PEG3, 350脱水剂溶液分别吸入108个孔中。将约2μ L蛋白质样品吸于盖玻片上且随后与约IyL 18种特定缓冲试剂中的一个混合。此后，将约2.5 μ L六种不同浓度的一的PEG 3，350沉淀剂添加至液滴中。以翻转盖玻片密封孔，产生108种不同悬滴实验。
[0358]将板储存在室温下。在接下来的7天内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0359] 结果:自所测试的108种条件未产生晶体。
[0360]实施例30-以悬滴汽相扩散模式进行的硫酸铵/Bis-Tris Propane栅条筛选
[0361]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL、10mg/mL 或 20mg/mLo
[0362]使用经涂脂的VDX板和圆形硅化盖玻片。通过在各孔中混合硫酸铵储备溶液、Bis-Tris Propane储备溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，硫酸铵摩尔浓度为约0.5Μ、1Μ、1.5Μ或2Μ。Bis-Tris Propane摩尔浓度始终为0.1M且Bis-Tris Propane缓冲液pH值为约5.5,6.0,6.5,7.0、7.5或8.0。以如上所述的三种蛋白质浓度且分别以在室温下储存或在约27°C下储存评估所得24种条件。在圆形硅化盖玻片上将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液混合且以翻转盖玻片密封孔，产生悬滴实验。将板储存在室温下。三天后进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0363]结果:自所测试的144种条件三天后未产生晶体。
[0364]实施例31-以悬滴汽相扩散模式进行的磷酸二氢钠钾/乙酸钠栅条筛选
[0365]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL、10mg/mL 或 20mg/mLo
[0366]使用经涂脂的VDX板和方形OptiClear塑料盖玻片。通过在各孔中混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液、磷酸二氢钾储备溶液和Milli Q水制备500 μ L特定储液器溶液。在该实施例中，将乙酸盐缓冲液摩尔浓度恒定保持于约0.1M且乙酸盐缓冲液pH值为约 4.1,4.6,5.1 或 5.6。
[0367]应用磷酸二氢钠与磷酸二氢钾的以下组合:
[0368]-约0.3M磷酸二氢钠与约0.3M磷酸二氢钾；
[0369]-约0.6M磷酸二氢钠与约0.6M磷酸二氢钾；
[0370]-约0.9M磷酸二氢钠与约0.9M磷酸二氢钾；
[0371]-约1.8M磷酸二氢钠，
[0372]-约2.1M磷酸二氢钠，
[0373]-约2.4M磷酸二氢钠。
[0374]以如上所述的三种蛋白质浓度设置各条件。将约I μ L蛋白质溶液与约I μ L特定储液器溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合，且以翻转的盖玻片将孔密封，产生悬滴实验。将板储存在室温下。在接下来的一个月内多次进行液滴的显微镜观察。条件归类为澄清液滴、含有无规沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质与晶体的混合物的液滴。
[0375]结果:从所评估的72个孔，以下结晶缓冲液产生呈针丛集形状的晶体:
[0376]-约0.9Μ磷酸二氢钠与约0.9Μ磷酸二氢钾，pH值为约4.1 ；
[0377]-约1.8M磷酸二氢钠，无钾盐，pH值为约4.6。
[0378]在所有三种蛋白质浓度下以所述条件均得到晶体。
[0379]实施例32-以悬滴汽相扩散模式、在不同温度下进行的磷酸二氢钠钾/乙酸钠栅条筛选
[0380]除储存温度增至30°C外，实验条件与实施例31相同。
[0381]结果:从所评估的72个孔，以下结晶缓冲液产生呈针丛集形状的晶体:
[0382]蛋白质浓度为约5mg/mL:
[0383]-约0.9M磷酸二氢钠与约0.9M磷酸二氢钾，pH值为约4.1 ；
[0384]-约1.8M磷酸二氢钠，无钾盐，pH值为约4.1。
[0385]-约1.8M磷酸二氢钠，无钾盐，pH值为约4.6。
[0386]-约1.8M磷酸二氢钠，无钾盐，pH值为约5.1。
[0387]蛋白质浓度为约10mg/mL:
[0388]-约0.9M磷酸二氢钠与约0.9M磷酸二氢钾，pH值为约4.1 ；
[0389]-约1.8M磷酸二氢钠，无钾盐，pH值为约4.6。
[0390]-约1.8M磷酸二氢钠，无钾盐，pH值为约5.1。
[0391]蛋白质浓度为约20mg/mL:
[0392]-约0.9M磷酸二氢钠与约0.9M磷酸二氢钾，pH值为约4.1 ;和
[0393]-约1.8M磷酸二氢钠，无钾盐，pH值为约4.1。
[0394]汽相扩散结晶实验结果的讨论:
[0395]最初使用充分描述的小规模方法进行结晶实验。由于PEG 4，000/乙酸钠缓冲液条件经研究不同抗原特异性或来源的不同抗体的其它
【发明者】描述为具有前景的结晶条件，因此决定以所述试剂起始。广泛实验后发现至少在所研究的影响结晶的因素(蛋白质浓度、沉淀剂浓度、缓冲液离子强度和PH值、温度)的组合下，于乙酸盐缓冲液中的PEG 4，000并不提供晶体，且因此决定继续广泛结晶筛选，由此将多种化学物质引入筛选过程。最后，意外地发现乙酸盐缓冲液中的磷酸二氢钠对于D2E7为强有力的结晶剂，其并不引入任何自医药观点来看不可接受的毒性试剂。
[0396]D.分批结晶实验
[0397]以下实施例中所给出的浓度值为关于抗体溶液和结晶溶液的两种溶液混合前的初始值。
[0398]若未另外描述，则所有pH值是指乙酸盐缓冲储备液在其与如结晶剂的其它物质组合前的pH值。
[0399]若未另外描述，则所有缓冲液摩尔浓度是指通常使用冰醋酸进行的pH值调节前储备溶液中的乙酸钠浓度。
[0400]实施例33-在800 μ L每批体积下进行的磷酸二氢钠钾/乙酸钠分批结晶
[0401]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 5mg/mL、10mg/mL 或 20mg/mLo
[0402]通过在1.5mL Eppendorff反应管中混合约400 μ L的各蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液、磷酸二氢钾储备溶液和Milli Q水制备400 μ L特定结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液pH值为约4.1。使用磷酸二氢钠与磷酸二氢钾的以下组合:约0.9M磷酸二氢钠与约0.9M磷酸二氢钾。将反应管储存在室温下。11天后进行I μ L等分试样的显微镜观察。
[0403]结果:11天后未观测到晶体。
[0404]实施例34-在600 μ L每批体积下进行的磷酸二氢钠/乙酸钠分批结晶
[0405]将D2E7缓冲入20 mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调整至 10mg/m L0
[0406]通过在1.5mL Eppendorff反应管中混合约300 μ L蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液和Milli Q水制备300 μ L特定结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液pH值为约
4.1。磷酸二氢钠摩尔浓度分别为约1.5M、1.8M、2.1M和2.4M。将反应管储存在室温下。11天后进行I μ L等分试样的显微镜观察。
[0407]结果:11天后未观测到晶体。
[0408]实施例35-在ImL每批体积下进行的磷酸二氢钠钾/乙酸钠栅条筛选分批结晶
[0409]在不交换缓冲液情况下使用D2E7。因此，初始组合物为D2E750/mL、甘露糖醇12mg/mL、聚山梨醇酯80 lmg/mL、柠檬酸单水合物1.305mg/mL、柠檬酸钠0.305mg/mL、磷酸氢二钠二水合物1.53mg/mL、脱水磷酸二氢钠0.86mg/mL和氯化钠6.16mg/mL, pH 5.2。
[0410]通过以Milli Q水稀释使D2E7的浓度达到约10mg/mL。
[0411]通过在24孔板的孔中混合约500 μ L蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过在孔中混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液、磷酸二氢钾储备溶液和Milli Q水制备500 μ L特定结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液pH值为约4.1、4.6、5.1或5.6。使用磷酸二氢钠与磷酸二氢钾的以下组合:
[0412]-约0.7M磷酸二氢钠与约0.7M磷酸二氢钾；
[0413]-约0.9M磷酸二氢钠与约0.9M磷酸二氢钾；
[0414]-约1.8M磷酸二氢钠，无钾盐，
[0415]-约2.1M磷酸二氢钠，无钾盐，
[0416]-约2.4M磷酸二氢钠，无钾盐。
[0417]制备结晶混合物后，随后密封孔以防止水蒸发。4天后进行板的显微镜观察。
[0418]结果:4天后未观测到晶体。
[0419]实施例36-在ImL每批体积下进行的磷酸二氢钠钾/乙酸钠栅条筛选分批结晶
[0420]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0421]通过在24孔板的孔中混合约500 μ L蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过在孔中混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液、磷酸二氢钾储备溶液和Milli Q水制备500 μ L特定结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液PH值为约4.1或4.6。分别应用以下磷酸二氢钠与磷酸二氢钾的组合:
[0422]-约1.8M磷酸二氢钠与约0.8M磷酸二氢钾；
[0423]-约2.2M磷酸二氢钠与约0.6M磷酸二氢钾；
[0424]-以0.2M为梯度从约2.6M磷酸二氢钠至约4.4M磷酸二氢钠，分别无钾盐。
[0425]制备结晶混合物后，随后密封孔以防止水蒸发。在接下来的一周内多次进行板的显微镜观察。此外，通过0D280测定三个批次的晶体产量。在14，OOOrpm下离心悬浮液的等分试样且评估上清液中的蛋白质浓度。
[0426]结果:于以下8个批次中发现针丛集状晶体:
[0427]-乙酸盐缓冲液pH4.1和约3.6M至约4.4的磷酸二氢钠摩尔浓度(0.2M梯度)；
[0428]-乙酸盐缓冲液pH4.6和约4.0M至约4.4的磷酸二氢钠摩尔浓度(0.2M梯度)。
[0429]评估乙酸盐缓冲液pH 4.1和约4.0M至约4.4M的磷酸二氢钠摩尔浓度的批次的晶体产量。5天后如通过0D280自上清液中剩余蛋白浓度测定的晶体产量超过95%。
[0430]组合蛋白质溶液与结晶溶液后即刻，沉淀物质明显存在于所述批次中(乳状悬浮液，典型光学显微照片)。由于5天后未观测到沉淀物质，推断先前沉淀物质重新排列成结晶物质。蛋白质在结晶混合物中闻度过饱和且蛋白质立即沉淀。一些蛋白质仍可溶解，现仅稍微过饱和或许甚至低于饱和。晶体形成，由此进一步降低溶解蛋白质的浓度。此外，沉淀物质明显随时间再溶解且并入生长的晶体中。
[0431]实施例37-在ImL每批体积、不同蛋白浓度下进行的磷酸二氢钠/乙酸钠栅条筛选分批结晶
[0432]在不交换缓冲液情况下使用D2E7 (参见实施例35)。
[0433]通过以Milli Q水稀释液体使D2E7的浓度达到约10mg/mL。
[0434]通过在24孔板的孔中混合约500 μ L蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过在孔中混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液、磷酸二氢钾储备溶液和Milli Q水制备500 μ L特定结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液pH值为约4.1或4.6。磷酸二氢钠摩尔浓度以0.2M的梯度从约2.6M磷酸二氢钠变化至约4.4M磷酸二氢钠。制备结晶混合物后，随后密封孔以防止水蒸发。在接下来的一周内多次进行板的显微镜观察。此外，通过0D280测定一个特定批次的晶体产量。在14，OOOrpm下离心悬浮液的等分试样且评估上清液中的蛋白质浓度。
[0435]结果:于以下6个批次中发现针丛集状晶体:
[0436]-乙酸盐缓冲液pH4.1和约3.4M至约4.4的磷酸二氢钠摩尔浓度(以0.2M梯度)。
[0437] 评估乙酸盐缓冲液pH 4.1和约4.2M的磷酸二氢钠摩尔浓度的批次的晶体产量。8天后如通过0D280自上清液中剩余蛋白浓度测定的晶体产量超过95%。
[0438]组合蛋白质溶液与结晶溶液后即刻，沉淀物质明显存在于所述批次中(乳状悬浮液，典型光学显微照片)。由于6天后未观测到沉淀物质，推断相变出现，其中先前沉淀物质重新排列成结晶物质。
[0439]实施例38-在2mL每批体积下进行的磷酸二氢钠/乙酸钠分批结晶
[0440]将D2E7缓冲入20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液(pH 7.4)中。将蛋白质浓度调节至 10mg/mL。
[0441]通过在2mL Eppendorff反应管中混合约ImL蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液和Milli Q水制备ImL特定结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液pH值为约4.1。磷酸二氢钠摩尔浓度为约4.0M、4.2M或4.4M。将反应管储存在室温下。在接下来的I周内多次进行I μ L等分试样的显微镜观察。
[0442]结果:6天后在所有批次中发现针丛集状晶体。
[0443]组合蛋白质溶液与结晶溶液后即刻，沉淀物质明显存在于所述批次中(乳状悬浮液，典型光学显微照片)。如实施例36中所述，先前沉淀物质重新排列成结晶物质。
[0444]实施例39-在ImL每批体积、不同蛋白质浓度下进行的磷酸二氢钠/乙酸钠栅条筛选分批结晶
[0445]在不交换缓冲液情况下使用D2E7 (参见实施例35)。
[0446]通过在24孔板的孔中混合约500 μ L蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过在孔中混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液、磷酸二氢钾储备溶液和Milli Q水制备500 μ L特定结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液PH值为约4.1。磷酸二氢钠摩尔浓度以0.2M的梯度从约0.2M变化至约4.4M。制备结晶混合物后，随后密封孔以防止水蒸发。在接下来的一周内多次进行板的显微镜观察。此外，通过0D280测定批次的晶体产量。在14，OOOrpm下离心悬浮液的等分试样且评估上清液中的蛋白质浓度。
[0447]结果:于以下2个批次中发现针丛集状晶体:
[0448]-约3.4M和约3.6M的磷酸二氢钠摩尔浓度。
[0449]沉淀物质和油性沉淀相也存在于含有所述晶体的批次中。
[0450]实施例40-在20mL每批体积、搅动下进行的磷酸二氢钠/乙酸钠分批结晶
[0451]在不交换缓冲液情况下使用D2E7 (参见实施例35)。
[0452]通过以Milli Q水稀释使D2E7的浓度达到约10mg/mL。
[0453]通过在50mL Falcon管中混合约1mL蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过在管中混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液和Milli Q水制备1mL结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液pH值为约4.1。磷酸二氢钠摩尔浓度为4.2M。将管储存在室温下，于实验室摇动器上搅动该批次。在接下来的一个月内多次进行I μ L溶液的等分试样的显微镜观察。
[0454]结果:该批次中观测到沉淀物质。
[0455]实施例41a-在10mL每批体积、无搅动下进行的磷酸二氢钠/乙酸钠分批结晶
[0456]在不交换缓冲液情况下使用D2E7 (参见实施例35)。
[0457]通过以Milli Q水稀释使D2E7的浓度达到约10mg/mL。
[0458]通过在干净IL聚丙烯瓶中混合约50mL蛋白质溶液与等量的结晶溶液进行分批结晶。通过在管中混合乙酸盐缓冲液、磷酸二氢钠储备溶液和Mi 11 i Q水制备50mL结晶溶液。在该实施例中，乙酸盐缓冲液摩尔浓度为0.1M且乙酸盐缓冲液pH值为约4.1。磷酸二氢钠摩尔浓度为4.2M。将容器储存在室温下。在接下来的一个月内多次进行溶液的I μ L等分试样的显微镜观察。
[0459]结果:7天后观测到针丛集状晶体。7天后如通过0D280自上清液中剩余蛋白浓度测定的晶体产量超过95%。
[0460]合并蛋白质溶液与结晶溶液后即刻，沉淀物质存在于所述批次中(乳状悬浮液，典型光学显微照片)。由于7天后未观测到沉淀物质，推断相变出现，其中先前沉淀物质重新排列成结晶物质。
[0461]实施例41b-在lmL、50mL和1L每批体积、无搅动下进行的磷酸二氢钠/乙酸钠分批结晶
[0462]也通过在1L聚丙烯容器(Nalgene ? )中组合IL于阿达木单抗商业缓冲液制剂pH 5.2 (参见实施例35)中的50mg/mL D2E7与4L注射用水(WFI)进行D2E7的大规模结晶。通过轻轻摇动使溶液均质化。接着将该5L D2E7溶液(lOmg/mL)与5L沉淀剂溶液(5M磷酸二氢钠，4，400mL ；1M 乙酸钠缓冲液 pH 4.l，500mL ；WFI (Ampuwa) 10mL)混合。以 500mL份添加沉淀剂溶液。添加各部分后，通过轻轻旋转/翻转瓶使溶液均质化。添加约2，500至3，OOOmL沉淀剂溶液后，白色沉淀出现。立即全部添加剩余沉淀剂。接着再次将晶体制剂均质化(轻轻旋转/翻转)。
[0463]批次制造后(亦即混合5L D2E7溶液与5L沉淀剂后)立即分为ImL (填充入低容量Eppendorf样品小瓶中)和50mL等分试样(填充入50mL Falcon试样管中)且邻近于1L容器储存以便控制且评估批量大小对D2E7结晶的影响。如图2至4所概述，每批体积(亦即分别lmL、50mL和10L)对D2E7晶体针/针丛集尺寸无影响。
[0464]讨论分批结晶实验的结果:
[0465]由于所应用小规模技术(参见上文D部分)对于大规模生产蛋白质晶体不可行，因此将由所述小规模方法发现的结晶条件转移至可缩放批次模式中。
[0466]D2E7以最终高产率(> 95% )和再现性在10mL每批体积下成功结晶，表明该结晶系统适用于工业处理。通过SDS-PAGE分析，证明晶体的蛋白质特征。对再溶解晶体的SE-HPLC分析仅展示聚集物质稍微增加。通过使用含有磷酸二氢钠的乙酸盐缓冲液(于约0.1M乙酸钠pH值为约4.1中的约4.2M磷酸二氢钠)洗涤晶体为可能的。如通过0D280所分析，无可测量的D2E7晶体溶解性在该洗涤缓冲液中出现，晶体的回收率大于90%。
[0467]以上批次实验的实验条件概括于下表1中:
[0468]表1-批次实验

【权利要求】
1.一种用于将抗-hTNFa抗体结晶的分批结晶方法，其包含以下步骤: (a)提供所述抗体与作为结晶剂的无机磷酸盐混合的水溶液；和 (b)培育所述含水结晶混合物直至形成所述抗体的晶体。
2.如前述权利要求之一的结晶方法，其中所述含水结晶混合物的pH在约pH3-5的范围内。
3.如前述权利要求之一的结晶方法，其中所述含水结晶混合物包含缓冲剂。
4.如权利要求3的结晶方法，其中所述缓冲剂包含乙酸盐缓冲剂。
5.如权利要求4的结晶方法，其中所述缓冲剂包含乙酸钠。
6.如权利要求3-5之一的结晶方法，其中所述含水结晶混合物中的缓冲剂浓度为0M-0.5M。
7.如前述权利要求之一的结晶方法，其中所述磷酸盐为磷酸氢盐。
8.如权利要求7的结晶方法，其中所述磷酸盐为碱金属盐或至少两种不同碱金属盐的混合物。
9.如前述权利要求之一的结晶方法，其中所述结晶混合物中的磷酸盐盐浓度在约1-6M的范围内。
10.如权利要求9的结晶方法，其中所述结晶混合物中的盐浓度在约1.0-3.0M的范围内。
11.如前述权利要求之一的结晶方法，其中满足下述另外的结晶条件中的至少一个: a)进行培育约I小时至约60天； b)在约4°C到约37°C之间的温度进行培育； c)抗体浓度在约0.5-约100mg/ml的范围内。
12.如前述权利要求之一的结晶方法，其进一步包含干燥所述晶体的步骤。
13.如前述权利要求之一的结晶方法，其进一步包括用不同缓冲液交换结晶母液的步骤。
14.如前述权利要求之一的结晶方法，其中每批体积在约Iml至20，000升的范围内。
15.包含IgG人抗-hTNFa抗体的晶体的组合物，其是通过如权利要求1的结晶方法获得的，其中所述晶体具有针状形态，其长度为约2-500 μ m，且Ι/d比率为约3至30。
16.如权利要求15的组合物，其中所述抗体是非糖基化抗体。
17.如权利要求15的组合物，其中所述IgG抗体选自IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。
18.如权利要17的组合物，其中所述IgG抗体为IgGl抗体。
19.如权利要求15的组合物，其中所述IgG抗体是分离的人类抗体，其以均通过表面等离子体共振测定的I X 10_8M或更低的Kd以及I X 1θ?或更低的Ka速率常数与hTNF α解离，且在标准体外L929测定中以I X 1-7M或更低的IC5tl中和hTNF α细胞毒性。
20.如权利要求15的组合物，其中所述IgG抗体是具有下列特征的分离的人类抗体:a)通过表面等离子体共振测定以IX KT3iT1或更低的匕?速率常数与人类TNFa解离；b)具有轻链⑶R3域，其包含SEQIDN0:3或通过在位置1、4、5、7或8通过单个丙氨酸取代或通过在位置1、3、4、6、7、8和/或9通过I至5个保守氨基酸取代修饰的SEQIDN0:3的氨基酸序列；c)具有重链CDR3域，其包含SEQIDN0:4或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11通过单个丙氨酸取代或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12通过I至5个保守氨基酸取代修饰的SEQIDNO:4的氨基酸序列。
21.如权利要求15的组合物，其中所述IgG抗体是分离的人类抗体，所述分离的人类抗体具有包含SEQIDN0:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)和包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。
22.如权利要求15的组合物，其中所述抗体是阿达木单抗。
23.如权利要求15-22中任一项的组合物，其中所述组合物具有大于lmg/ml的抗体浓度。
24.如权利要求15-22中任一项的组合物，其中所述组合物是具有在10至400mg/ml范围的抗体浓度的可注射液体组合物。
25.一种药物组合物，其包含如权利要求15-22中任一项的组合物和至少一种药物赋形剂。
26.—种药物组合物，其包含如权利要求15-22中任一项的组合物和至少一种包埋或囊封所述抗体的晶体的药物赋形剂。
27.如权利要求25的药物组合物，其中所述组合物具有大于200mg/ml的抗体浓度。
28.如权利 要求25的药物组合物，其中所述药物组合物以固体、半固体或液体制剂形式提供，各制剂含有呈结晶形式的所述抗体。
29.如权利要求25的药物组合物，其中所述赋形剂包含至少一种聚合型载体或至少一种油性或脂质载体。
30.如权利要求29的药物组合物，其中所述聚合型载体为选自下列的一种或多种聚合物:聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(β-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧杂环己烷酮)、聚(乙二醇)、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有机)磷氮烯、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、顺丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、海藻酸酯、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、甘氨基聚糖、硫酸化多糖、其混合物和共聚物。
31.如权利要求29的药物组合物，其中所述聚合型载体是生物可降解的。
32.—种阿达木单抗抗体的晶体，其中所述晶体具有针状形态，其长度为2-500 μ m，且1/d比率为3至30。
33.如权利要求15-32中任一项的组合物在制备用于治疗个体中TNFa相关疾病的药物中的用途。
34.如权利要求33的用途，其中所述组合物能够通过胃肠外途径、经口途径或通过注射施用。
35.如权利要求33的用途，其中所述TNFα相关病症选自:自身免疫疾病，尤其类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化症、自身免疫糖尿病、自身免疫葡萄膜炎和肾病综合征；感染性疾病、移植物排斥或移植物对抗宿主疾病、恶性疾病、肺部病症、肠道病症、心脏病症、炎性骨骼病症、骨再吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、暴发型肝炎、凝血障碍、烧伤、再灌注损伤、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形成、发热、牙周疾病、肥胖症和辐射毒性；脊椎关节病、肺部病症、冠状动脉病症、代谢障碍、贫血、疼痛、肝病症、皮肤病症、指甲病症或脉管炎、白塞氏病、强直性脊椎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩氏病相关病症、青年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、牛皮癣、牛皮癣性关节炎和慢性斑块牛皮癣、年龄相关恶病质、阿尔茨海默病、脑水肿、炎性脑损伤、慢性疲劳综合征、皮肌炎、药物反应、脊髓中和/或其周围水肿、家族性周期性发热、费尔提氏综合征、纤维化、肾小球性肾炎、假肢松动、显微镜下多血管炎、混合型结缔组织病症、多发性骨髓瘤、癌症和恶病质、多器官病症、骨髓发育不良综合征、睾丸炎、骨质溶解，包括急性、慢性和胰脓肿的胰腺炎，牙周疾病、多发性肌炎、进行性肾衰竭、假性痛风、坏疽性脓皮病、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、类肉瘤病、硬化性胆管炎、中风、胸腹主动脉瘤修复(TAAA)、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、与黄热病疫苗接种有关的症状、与耳相关的炎性疾病、慢性耳部炎症或小儿耳部炎症、葡萄膜炎、坐骨神 经痛、前列腺炎、子宫内膜异位、脉络膜新血管生成、狼疮、舍格伦综合征和湿性黄斑变性。
【文档编号】A61P17/06GK104072612SQ201310234752
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2007年10月25日 优先权日:2006年10月27日
【发明者】D.W.包赫尼, W.佛路荷夫, H.-J.克鲁斯, A.柯尼格斯多佛, G.温特, S.高特斯乔克 申请人:艾伯维生物技术有限公司