专利名称：新发现的丙型肝炎病毒抗原表位的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物信息学和免疫学技术，预测了新发现的丙型肝炎病毒抗原表位， 初步的体内、体外实验证明这个抗原表位具有免疫原性。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝病的主要病原体之一，全世界约有HCV感染者 1.7亿-2.0亿，我国人群HCV感染率约3.2%，估计全国感染者在4000万以上。HCV感染后，约50% -85%转为慢性肝炎，其中20%-30%发展为肝硬化，部分转为肝细胞肝癌(HCC)，严重危害人类健康，已成为全球性的、严峻的公共卫生问题。迄今为止，尚缺乏理想的抗病毒治疗措施，干扰素治疗也不太令人满意。由于HCV病毒变异率高，以保护性中和抗体为主的预防性HCV疫苗的研究步履维艰，因此，寻求抗HCV的疫苗和有效抗病毒药物一直是研究的执占。HCV基因组有9. 6kb，编码3010aa的多肽，由结构蛋白(Core、El和E2)和7个非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B )组成。HCV感染后，机体细胞模式识别受体(pattern recognition rec印tors，PRR)感受外来分子的侵入，诱导细胞内信号转导， 产生I类干扰素等固有免疫反应，以抵抗病毒的侵袭；同时通过DC介导特异性细胞免疫，清除病毒感染，恢复细胞的“健康状态”。对急性HCV感染病人观察发现，如病人能早期出现针对包膜蛋白的抗体，则有利于病毒清除。早期疫苗研究中也证明了 HCV确实具有中和抗原表位，用真核载体表达的重组膜蛋白免疫黑猩猩，可以保护动物免受同株病毒的攻击。 由于HCV中和抗原表位存在于编码包膜糖蛋白的E区，而HCV E区基因高度变异，尤其是E2 区N端存在高变区(HRV1和HRV2)，从而使机体产生的中和抗体因抗原变异而缺乏保护力， 不能有效地清除病毒准种或其它型别病毒株的感染。近年来，应用更特异的ELISP0T法检测免疫活性细胞在特异性表位肽刺激下的细胞因子分泌，分别观察⑶4+ Th细胞和⑶8+ CTL细胞介导的免疫反应。动态观察发现， 早期有强烈Th免疫反应的病人，HCV病毒检查阴转，若Th免疫反应下降，病毒血症又可复发，说明Th细胞免疫反应在病毒清除中的重要作用。最近有研究发现，HCV感染的患者若能在感染的早期产生较强的针对HCV各个蛋白的多表位特异性CTL，则患者的感染多表现为自限性；而当患者特异性CTL的活性较低或仅针对个别表位时，则可导致HCV感染的持续状态，并可造成肝组织的慢性损伤，提示CTL活性对HCV感染的控制具有重要作用。黑猩猩感染实验能更仔细地观察初次感染时不同时相的免疫反应，结果说明CD4+ T细胞和CD8+ T细胞均在HCV清除和维持病毒抑制状态中发挥重要作用。由于HCV疫苗研究的必要性和迫切性，自1989年HCV基因获得克隆以来，人们一直在致力于疫苗的研究，但是进展缓慢。早些时候，人们注重发展HCV包膜糖蛋白或多肽亚单位疫苗，同HIV疫苗的研究一样，由于HCV包膜糖蛋白高度的变异特性，使以产生中和性抗体控制病毒感染和复制的研究遇到困难。HCV疫苗难以实现的主要原因归纳为以下三点①HCV基因组变异率较高，病毒准种多，缺乏保护性抗体，不能预防黑猩猩和人类再次感染，传统的预防性疫苗的研究遇到困难；②HCV复制能力差，感染力弱，使体内病毒滴度较低，在体外又不易培养，病毒复制感染过程及发病机制仍不清楚，而且HCV编码的某些蛋白，如核心蛋白和NS蛋白还可能与HCV的致癌性有关，免疫原的选择以及强度均受到一定的限制；③缺乏理想的体外感染细胞模型，动物模型除黑猩猩外，其他动物，即使灵长类动物，如狒狒、恒河猴等都不能为HCV所感染，限制了对疫苗评价的研究。近10年来，HCV疫苗研究的焦点主要集中在核酸疫苗、病毒载体疫苗、重组多表位疫苗以抗原递呈细胞为载体的DC疫苗等。重组多表位疫苗因其可以同时携带多个相关目标抗原以及辅助性表位，能够有效地应对病原微生物变异和免疫反应中HLA限制性等不利因素。已在肿瘤疫苗、HIV疫苗和 HCV疫苗的研究方面进行了探索，显示其在诱导细胞免疫反应方面具有独特的优势。为了诱导出针对多个HCV表位的特异性细胞免疫反应，选择HCV基因组中不同区的多表位，进行科学设计、合理组合是目前HCV疫苗开发研究的热点。越来越多的证据表明，要获得具有较强免疫原性的HCV多肽，必须能广泛地激发机体的CD4+和CD8+T细胞介导的免疫反应， 必须具有HCV不同区段的多个表位。同时，细胞免疫反应无论是CTL还是Th反应，免疫原在抗原递呈细胞(APC)内都要经过一个复杂的加工及由主要组织相容性抗原(MHC)递呈的过程，其I类和II类抗原分别递呈能激活⑶8+ T细胞和⑶4+T细胞的抗原表位。在多表位疫苗的设计中还要考虑所选择的表位必须要能覆盖不同人群的HLA限制型，才能使疫苗对绝大多数个体都有作用。最近(2007年)，以色列学者Vider-Shalit等，根据CTL表位由MHC-I类分子呈递抗原(胞质溶胶途径)的分子免疫学知识，基于基因组学和生物信息学分析工具，以互联网上的HCV蛋白数据库LANL (包含已报道的所有HCV基因型)为对象，依次运用模拟退火算法计算肽切割的概率、应用残基结合能线形组合方法计算与TAP结合的概率、应用BIMAS算法计算与包含所有HLA多态性的MHC结合概率，从中选取一些覆盖大多数人群的HLA限制性表位；然后，运用HLALigancUMHCBN、AntiJen等数据库去验证，在此基础上分析这些表位在所有已报道HCV基因型中的保守性以及去除与人自身肽相似性强的表位，将这些候选的表位按照遗传学算法进行串联，两个表位用潜在氨基酸序列可以被切割。这样获得的多表位组合是来自几乎所有HCV基因型及亚型，同时既能够被有效呈递，又能够覆盖大多数人群HLA多态性，并为小鼠实验研究设计了 HCV多表位基因序列，该序列由225aa组成，含有 25个CTL表位。近10年来，随着对HCV持续感染机制的认识，结合我们多年的HCV研究工作基础， 通过与国、内外学者交流，我们提出了 HCV疫苗研究的新理念需要结合HCV的生物学特性、 感染发病特征、抗病毒免疫机制，改变“单纯预防”为“预防与治疗相结合”，改变“多次接种为多次反复接种”，发展能够诱导出强大的、针对多个病毒表位的、持续较长时间的特异性 CD8+和CD4+T细胞反应的疫苗研究策略，以诱导持续免疫应答和维持病毒抑制状态为“基本目标”的HCV疫苗研究的新理念。因此，我们首先要发现能够诱导出特异性T细胞反应的 HCV抗原表位。受此启发，我们应用生物信息学方法，预测了涵盖中国人HLA I类和HLA II类基因座等位基因频率较高的抗原表位，包括HCV基因不同区的多个CTL表位和Th表位。选择HCV核心(C)区、NS3、NS4、NS5区的CTL表位和Hi表位共12个，进行优势组合串联，设计、合成了重组HCV多表位疫苗的基因序列，进行了真核表达，并用此基因疫苗在小鼠体内诱导出体液和细胞免疫应答。这预测的12个表位均做了体外实验，其中一个表位能刺激T 细胞增殖并产生IFN - Y，用这个表位合成的多肽疫苗免疫小鼠能诱导出细胞免疫应答。
发明内容
本发明的目的是提供新发现的丙型肝炎病毒抗原表位P7 (774-782) AAWYIKGRL， 经体内、体外实验表明，这个抗原表位具有免疫原性。本发明的技术方案是提供新发现的丙型肝炎病毒抗原表位，其序列是抗原表位多Jft P7 (774-782) AAffYIKGRL0所述的抗原表位多肽在制备治疗丙型肝炎药物中的应用。所述的抗原表位多肽在制备丙型肝炎疫苗中的应用。本发明的特点是经体内、体外实验表明这种构建疫苗序列为多肽P7 (774-782) AAWYIKGRL,它具有免疫原性。
下面结合实施例附图对本发明做进一步说明，但不做为对本发明的限定
图1 是重组质粒pEGFP-mcg双酶切鉴定(1 :DL2000 Marker ； 2，3，4，5 为 Hind III +BamH I 双酶切 pEGFP-mcg)；
图2是重组质粒pEGFP-mcg转染C0S-7细胞后mRNA的提取及RT-PCR (M :DL2000 Marker ；1,2 :pEGFP_mcg 转染 C0S-7 细胞后 mRNA 提取后的 RT-PCR 结果)；
图3是荧光显微镜下观察转染效果(X 400)(其中A :pEGFP-Nl转染C0S-7细胞组；B 重组载体pEGFP-mcg转染C0S-7组)；
图4是western blot检测目的蛋白的表达(1 =Hicg-EGFP融合蛋白的表达；2 =EGFP蛋白的表达)；
图 5A. LaneM :KB Ladder ( Lanel :pcDNA3. 1-mcg plasmid ； Lane 2 :pcDNA3. 1-mcg PCR鉴定结果；Lane 3 :pcDNA3. 1-mcg用EcoR I酶切鉴定结果)； 图5B. pcDNA3. 1-mcg的测序鉴定；
图6. pcDNA3. I-Em基因免疫小鼠体内诱导产生的特异性抗体； 图7. pcDNA3. I-Em基因免疫小鼠脾淋巴细胞特异性淋巴细胞增殖反应； 图8 倒置显微镜下PBMC的形态学变化(X200)(其中A 合成肽刺激72 h后；B 阴性对照72 h后)；
图9 IFN- γ的检测结果(A: 11号肽组IFN- γ的检测结果；B 6号肽组IFN- γ的检测结果；1 实验组；2 阳性对照；3 阴性对照)；
图IOA ELISP0T斑点形态(其中A: 11号肽刺激组；Β:6号肽刺激组；C 阳性对照组； D 阴性对照组)；
图IOB肽刺激HCV患者PBMC产生的斑点数(1 11号肽刺激组；2 6号肽刺激组；3 阳性对照组；4 阴性对照组)；
图11多肽免疫小鼠特异性淋巴细胞增殖反应。
具体实施例方式实施例1.重组HCV多表位疫苗的基因序列的设计 1、建立HCV蛋白质组数据库
以关键词organism: "hepatitis c virus" AND name: "genome polyprotein〃 AND fragment:no AND reviewed:yes 搜索 uniprot 蛋白质数据库(http://beta. uniprot. org/)，选择中国流行的HCV基因型lb、2a、2b、3a、;3b、6a的蛋白质序列构建数据库(表1)。 该数据库包含有17株HCV蛋白质组序列。表1.选定的HCV蛋白质组数据库
权利要求
1.新发现的丙型肝炎病毒抗原表位，其序列是抗原表位多肽P7(774-782) AAffYIKGRL0
2.根据权利要求1所述的新发现的丙型肝炎病毒抗原表位，其特征是所述的抗原表位多肽在制备治疗丙型肝炎药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的新发现的丙型肝炎病毒抗原表位，其特征是所述的抗原表位多肽在制备丙型肝炎疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物信息学和免疫学技术，它提供新发现的丙型肝炎病毒抗原表位，其序列是抗原表位多肽P7(774-782)AAWYIKGRL；所述的抗原表位多肽在制备治疗丙型肝炎药物中的应用；所述的抗原表位多肽在制备丙型肝炎疫苗中的应用。它经体内、体外实验证明这个抗原表位具有免疫原性。
文档编号A61K38/08GK102212115SQ201110143408
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年1月13日
发明者周云, 李端, 潘蕾, 贾战生 申请人:中国人民解放军第四军医大学