一种黄鳝抗菌肽的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗菌肽的提取方法，特别是一种黄鳝抗菌肽的提取方法。
【背景技术】
[0002]抗菌肤是近年来研宄发现的新一代抗菌剂，对机体免疫功能等具有重要作用。水生动物抗菌肤的相关研宄起步较晚。水产动物的抗菌肽研宄始于1988年，日本学者Nakamura等从亚洲聲(Tachypleustridentatus)用酸提取法纯化出聲素(Tachyplesin)。后来在贝类、鱼类中均有报到。但黄鳝抗菌肽至今尚鲜见报道。
[0003]黄鳝，学名:Monopterus albus，是我国主要经济水产品之一，营养成分丰富，具有“小暑黄鳝赛人参”之美誉，然而它生存于泥泞污沟却不会发病，黄鳝养殖中也很少有发病的报到，说明其自身能够产生抵御外源病物质，本发明探讨从黄鳝中分离纯化抗菌肽的工艺流程，并分离纯化黄鳝抗菌肽，进而开发利用黄鳝抗菌肽。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、具有抑菌活性的黄鳝抗菌肽的制备工艺。
[0005]本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。
[0006]本发明是一种黄鳝抗菌肽的提取方法，其特点是，其步骤如下:
1)粗制品的制备
(1)取新鲜黄鳝的肝脏及肠用灭菌生理盐水冲洗，称重，冷冻剪碎；
(2)按I:l(ff/V)比例加入5%乙酸；
(3)用组织捣碎机捣碎3次，每次2min；
(4)100°C水浴lOmin，然后迅速冷却，8000 rpm离心30min弃沉淀，收集上清液；
(5)上清液置冰上超声波破碎10次，每次3s;4°C搅拌浸提24h，8000r/min离心30min，取上清液；
(6)将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再次搅拌浸提，离心取上清液；
(7)合并两次上清液，调pH值至?.0，8000r/min离心30min取上清液；
(8)上清液冷冻干燥；
2)抗囷狀粗制品的纯化:
将上清液上样于Sephadex G-100凝胶过滤层析柱(1.0 X 30cm)，用0.2mol/L乙酸钠溶液(pH7.0)以流速10.0mL/cm2, h进行洗脱，紫外检测仪检测其在280nm处的吸光值，记录仪记录(量程200mV，纸速度为6cm/h)，自动部分收集器收集，每管约2mL。检测各收集管洗脱液对大肠杆菌的抑菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，用截留分子量为1kD的超滤离心管于5000g条件下离心30min，有抑菌活性的滤过物冷冻干燥，-20°C保存。
[0007]本发明提供的一种黄鳝抗菌肽的提取方法，其有益效果在于，本发明方法得到一种分子量约为6500Da黄鳝抗菌肽，该抗菌肽耐热耐冻融性强，抗菌活性稳定，对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的杀灭作用。
【具体实施方式】
[0008]下面结合实施例，对本发明提供的一种黄鳝抗菌肽的提取方法，进行详细的说明。实施例
[0009]本实施例的一种黄鳝抗菌肽的提取方法，其特征在于，它包括如下具体步骤:
1)粗制品的制备:
(1)取新鲜黄鳝的肝脏及肠用灭菌生理盐水冲洗，称重，冷冻剪碎；
(2)按I:l(ff/V)比例加入5%乙酸；
(3)用组织捣碎机捣碎3次，每次2min；
(4)100°C水浴lOmin，然后迅速冷却，8000 rpm离心30min弃沉淀，收集上清液；
(5)上清液置冰上超声波破碎10次，每次3s;4°C搅拌浸提24h，8000r/min离心30min，取上清液；
(6)将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再次搅拌浸提，离心取上清液；
(7)合并两次上清液，调pH值至?.0，8000r/min离心30min取上清液；
(8)上清液冷冻干燥；
2)抗囷狀粗制品的纯化:
将上清液上样于Sephadex G-100凝胶过滤层析柱(1.0 X 30cm)，用0.2mol/L乙酸钠溶液(pH7.0)以流速10.0mL/cm2, h进行洗脱，紫外检测仪检测其在280nm处的吸光值，记录仪记录(量程200mV，纸速度为6cm/h)，自动部分收集器收集，每管约2mL。检测各收集管洗脱液对大肠杆菌的抑菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，用截留分子量为1kD的超滤离心管于5000g条件下离心30min，有抑菌活性的滤过物冷冻干燥，-20°C保存。
[0010]本发明方法得到一种分子量约为6500Da黄鳝抗菌肽，该抗菌肽耐热耐冻融性强，抗菌活性稳定，对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的杀灭作用。
【主权项】
1.一种黄鳝抗菌肽的提取方法，其特征在于，它包括如下具体步骤: 1)粗制品的制备 (1)取新鲜黄鳝肝脏及肠用灭菌生理盐水冲洗，称重，冷冻剪碎； (2)按I:l(ff/V)比例加入5%乙酸； (3)用组织捣碎机捣碎3次，每次2min； (4)100°C水浴lOmin，然后迅速冷却，8000 rpm离心30min弃沉淀，收集上清液； (5)上清液置冰上超声波破碎10次，每次3s;4°C搅拌浸提24h，8000r/min离心30min，取上清液； (6)将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再次搅拌浸提，离心取上清液； (7)合并两次上清液，调pH值至?.0，8000r/min离心30min取上清液； (8)上清液冷冻干燥； 2)抗囷狀粗制品的纯化: 将上清液上样于Sephadex G-100凝胶过滤层析柱(1.0 X 30cm)，用0.2mol/L乙酸钠溶液(pH7.0)以流速10.0mL/cm2, h进行洗脱，紫外检测仪检测其在280nm处的吸光值，记录仪记录(量程200mV，纸速度为6cm/h)，自动部分收集器收集，每管约2mL ;检测各收集管洗脱液对大肠杆菌的抑菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，用截留分子量为1kD的超滤离心管于5000g条件下离心30min，有抑菌活性的滤过物冷冻干燥，-20°C保存。
【专利摘要】本发明公开了一种黄鳝抗菌肽的提取方法，以黄鳝的肝脏及肠为原料，经抗菌肽粗制品的制备和抗菌肽粗制品的纯化得到一种分子量约为6500Da黄鳝抗菌肽，该抗菌肽耐热耐冻融性强，抗菌活性稳定，对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的杀灭作用。
【IPC分类】C07K14/46, C07K1/36, C07K1/16
【公开号】CN104974240
【申请号】CN201510488422
【发明人】陈春林, 宁发子, 宁成勇
【申请人】重庆都好生物科技有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年8月11日