一种蝎毒多肽b4及其分离纯化方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蝎毒多肽B4 (scorpion venom peptide B4，SVPB4)，具体涉及一 种蝎毒多肽M及其分离纯化方法与应用。
【背景技术】
[0002] 全世界蝎目分6科，70属，约800余种，中国境内主要为东亚钳蝎，后者在历史上一 直作为我国传统、名贵中药之一的"全蝎"而享誉海内外。蝎毒为蝎尾节毒囊中排泌出来的 一种有毒分泌物，是全蝎治疗疾病的主要有效部位，其对肿瘤、疼痛、心血管疾病的疗效较 全蝎强数倍。蝎毒以毒攻毒的药理作用是建立在全蝎及蝎尾千百年来大量临床应用的基础 之上，具有鲜明的民族特色。
[0003] 蝎毒是一个巨大的生物资源宝库，其中大部分是具有药理学活性的多肽类。目前， 蝎毒中已分离出的蝎毒素大约有30种左右，主要是由35~70个氨基酸所组成的短肽，分 子量约在4000~9000D之间，pH变化对蝎毒素的毒性影响不大，在加热至100°C并持续 15~30min后，毒性依然较强。国外在蝎毒方面的研宄始于十九世纪末，自上个世纪九十年 代以来，蝎毒作为研宄离子通道的工具及制作抗毒血清的原料而成为国际上研宄的重点。 从LQS蝎毒中分离出的氯毒素及charybdotoxin，对恶性神经胶质瘤细胞膜上的离子通道 有特异的亲和作用，细胞的恶性度越高，氯毒素对它们的亲和作用越强。氯毒素与同位素结 合后，其对胶质瘤的定向杀伤作用更为显著。此外，蝎毒素能够阻滞细胞膜的K+通道，同时 导致Ca2+的内流减少，使肿瘤细胞的生长延缓。
[0004] 我国在蝎毒方面的研宄虽然起步晚，但在中医临床验证及理论体系（攻毒散结、 通经活络、平肝熄风）的指导下，在抗肿瘤、抗痛、抗癫痫、抗凝、抗肝炎、抗风湿等领域均取 得了丰硕的成果。
[0005] 环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX)是一种临床常见的具有高治疗指数的烧化剂 类抗肿瘤药物，广泛应用于各种癌症治疗，具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用。 但环磷酰胺可导致严重的副作用，如白细胞减少、骨髓抑制、免疫抑制和细胞毒作用。其中 骨髓抑制可引起骨髓微环境、造血干细胞、造血细胞生长因子等的损伤，骨髓抑制引起的外 周血细胞减少会导致严重感染、贫血以及严重出血，甚至导致死亡。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种蝎毒多肽M。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述蝎毒多肽M的分离纯化方法。
[0008] 本发明的再一目的在于提供上述蝎毒多肽M的应用。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0010] 一种竭毒多狀 M (scorpion venom peptide B4, SVPB4)，该竭毒多狀 M 是一种天 然蝎毒多肽，该天然蝎毒多肽是从东亚钳蝎（Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离的一 种新的蛋白质。所述东亚钳蝎可以为野生或是任何一种市售的人工养殖的东亚钳蝎，如乌 鲁木齐县东亚钳蝎良种繁育场、徐州新沂市浩大蝎子养殖场、金华市天道有毒生物科技开 发有限公司等市售的东亚钳蝎。
[0011] 其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示：
[0012] SEQ ID N0:1 ：CGPCFTTDANMARKFRECCGGIGKKFFPQQLLNN ；
[0013] 所述的蝎毒多肽M是从东亚钳蝎的蝎毒中所分离得到的天然多肽，该蝎毒多肽 B4的分离纯化方法，包括如下步骤：
[0014] (1)东亚钳蝎蝎毒采集：利用电刺激法提取新鲜粗毒液，经真空冷冻干燥成蝎毒 干粉；通常5kg活蝎可提取1. 5~2. Og冻干蝎毒；
[0015] (2)东亚钳蝎蝎毒粗毒溶液的配制；取步骤（1)制备的蝎毒干粉配制成浓度为 20mg/mL的蝎毒粗毒溶液，备用；
[0016] (3) SVP II 分离
[0017] 凝胶过滤：采用分子筛层析凝胶Sephadex G_50Medium对步骤（2)制备的蝎毒粗 毒溶液进行分离；层析柱规格为50cmX 5. 5cm，每次上样量为400mg原毒，体积为20mL，收集 峰II(SVPII)冻干，备用，收率约60% ;
[0018] (4)SVPB4 纯化
[0019] a.离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对SVPII进行进一步 纯化；层析柱规格为IOOcmX5. 5cm，每次上样量为500mg SVPII冻干粉，体积为20mL，洗脱 液为Ph = 6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，其中A液为0. 05M磷酸盐缓冲液（Na2HPO4/ NaH2PO4)，B液为含0· 3MNaCl的A液，收集SVPB4,用Vivaf low 50切向超滤器脱盐，冻干，备 用，收率约9% ;
[0020] b. HPLC 分析：流动相 A 液为 0· 1 % (v/v) TFA (三氟乙酸）/H20, B 液为 70 % (v/v) 乙腈+0· 1 % (v/v) TFA ;洗脱程序为0~60min，B液浓度由0~100,洗脱速度为0· 5mL/min ; 经分析，由离子交换所得的目标峰一一SVPB4的纯度可达96%以上；
[0021] (5) SVPB4分子量及其氨基酸序列测定
[0022] 用质谱分析法（Bruker公司的9. 4T混合型串联傅立叶质谱仪Q-FT-MS)测定 SVPB4的精确分子量为3746. 53Da ;用蛋白质N端测序法（岛津公司的PPSQ-31A蛋白自动 测序仪）测定SVPB4共有34个氨基酸残基，其始自N端的全序列为：
[0023] CGPCFTTDANMARKFRECCGGIGKKFFPQQLLNN ； (SEQ ID N0:1)
[0024] 经BLASTp比对的结果表明，SVPB4属于蝎毒的α毒素家族，与已知的其他成员均 有一定的差异性，说明SVPB4是一种新的天然多肽。
[0025] 为解决上述技术问题，本发明人经过锐意研宄，在前期研宄蝎毒多肽与化疗药物 联合应用可协同抗癌，并能降低化疗药带来的毒副作用；蝎毒多肽II(SVPII)有类似造血 生长因子作用，通过上调白细胞介素-3受体，促进辐射后小鼠骨髓造血功能的恢复损伤。 蝎毒多肽M (scorpion venom peptide B4，SVPB4)是本发明人从SVPII中分离纯化出的一 种新的小分子多肽。本发明采用CTX致小鼠骨髓抑制模型，观察SVPB4对CTX所致的小鼠 骨髓抑制及其毒性的恢复作用，以及该作用的量效关系，从而完成了本发明。
[0026] 所述的蝎毒多肽M在抗癌治疗辅助药物中的应用。
[0027] 所述的抗癌治疗辅助药物可具有化疗所致骨髓造血功能抑制及毒副反应中的保 护作用和功能恢复作用。
[0028] 所述的抗癌治疗辅助药物，含有SEQ ID NO: 1所示的蝎毒多肽B4。
[0029] 所述的抗癌治疗辅助药物，其中，所述的蝎毒多肽M的施用量为0.5~ 2. Omg · kg-1 〇
[0030] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0031] (1)环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX)是一种免疫抑制剂，主要用于肿瘤、自身 免疫性疾病以及器官移植的治疗。CTX引起的主要不良反应是造成免疫功能和造血系统功 能的抑制，并且目前尚无有效的防治方法。本实验中观察到，注射CTX 3d后，小鼠表现为活 动迟缓，倦卧，扎堆，毛发蓬松，一般状态较差，摄食和饮水量均减少，体重增长缓慢等，这些 表现与临床肿瘤患者CTX化疗后出现的疲惫、消瘦、食欲差以及体力进行性下降等症状类 似。本发明的结果显示，经过SVPB4的治疗后，小鼠一般状态改善，摄食增加，体重增长加 快。本发明人早期的研宄发现，蝎毒抗癌多肽能够显著抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长，亦能升 高小鼠体内的免疫细胞，提高荷瘤小鼠的免疫功能。本实验的结果也提示SVPB4可能增强 了小鼠的免疫功能，使小鼠的抵抗力增高，一般状况改善，体重增加。
[0032] (2)目前，制备化疗药物所致骨髓抑制动物模型多数采用CTX。CTX属氮芥类烷化 剂，临床上用于治疗肿瘤时常常缺乏选择性，在杀死大量肿瘤细