in，紫外蛋白检测仪监测洗脱液的280nm的吸光度值， 灵敏度为〇. 1A，自动收样器6min/管部分收集，根据台式记录仪记录的洗脱蛋白峰型图，将 各组分洗脱液合并，收集SVPB4,4°C保存备用。
[0054] 5、样品制备：用Vivaflow 50切向流滤器，将离子层析分离纯化的样品溶液进行 浓缩脱盐，溶液置换体积达5~10倍除盐率可达90 %，最后用电导率仪测试样品电导率，确 定脱盐效果。将脱盐后的样品_80°C冷冻，用真空冷冻干燥机将液体变为冻干粉，置于4°C 密闭保存备用，收率约9%。
[0055] (二）蝎毒多肽SVPB4及其他组分纯度分析
[0056] RP-HPLC分析各组分样品的纯度，采用C18色谱柱（Hypersil 0DS25 μm， 4. 6mmX 250mm)(日本岛津公司），色谱条件为：流动相A :0.1 % (v/v)三氟乙酸TFA水溶液， 流动相B:70% (v/v)的乙腈（含0.1% (v/v)TFA)溶液，流速0.5mL/min，上样后经60min 流动相B复合梯度从0到100%浓度变化洗脱。检测波长：280nm，分别检测B3, B4, B5, B6， 组分的纯度，每次进样量20 μ L，每个样品重复3次。
[0057](三）氨基酸序列测定
[0058] 1.利用质谱分析法（Bruker公司的9. 4T混合型串联傅立叶质谱仪Q-FT-MS)，检 测纯度最高的M组分的相对分子量；
[0059] 2.利用埃德曼降解法（Edman degradation)(岛津公司的PPSQ-31A蛋白自动测序 仪）测定B4组分N端前34个氨基酸序列。
[0060] (四）结果分析
[0061] (1)经凝胶过滤层析（Sphadex G-50)分离，得到3个蛋白峰群，主峰分别为I峰、 II峰、III峰（见图1);进一步通过离子交换层析分离，得到8个峰，见图2。
[0062] (2) RP-HPLC对蝎毒各组分纯度鉴定
[0063] 用RT-HPLC对83、84、85、86四个组分进行鉴定，结果如图3。结果显示，84、85组 分较纯，B3、B6有多种组分组成。
[0064] (3) SVPB4的相对分子量测定和氨基酸序列测定
[0065] 如图4所示，B4组分的分子量大小为3746. 53Da，且纯度较高（>96% )。
[0066] 埃德曼降解法测得M组分N端前34氨基酸序列为：CGPCFTTDANMARKFRECCGGIGK KFFPQQLLNN(SEQ ID N0:1) ;B4 为一种新的多肽。
[0067] 实施例2
[0068] 1、材料
[0069] I. 1动物SPF级Balb/C种小鼠，6~8周，18~22g，雄性，购自广东省实验动物中 心（许可证号：SYXK(粵）2010-0104)。实验环境：广州医科大学动物中心SPF级，分笼饲 养，环境温度（20±2)°C，湿度55%~65%，12h光照，啮齿类动物饲料喂养，自由饮水。
[0070] 1. 2试剂与仪器注射用CTX(通化茂祥制药有限公司）；注射用rhG_CSF(购自厦 门特宝生物工程股份有限公司）；全自动生化分析仪（美国Beckman公司）；显微镜（德国 Leica);组织包埋机、自动组织脱水机和生物组织染色机（浙江金华科迪仪器设备有限公 司）；组织切片机（Thermo公司）。
[0071] 2 方法
[0072] 2. 1骨髓抑制模型制备小鼠腹腔注射CTXlOOmg · kg_S每天1次，连续3d。
[0073] 2. 2分组和给药50只Balb/c小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组 (rhG-CSF 125 μ g · kg-1)、SVPB4 低浓度组（0· 5mg · kgl且）、SVPB4 高浓度组（2. Omg · kg η 组）。骨髓抑制模型制备成功后，SVPB4处理组按照不同的剂量每日腹腔注射SVPB4,连续 注射13d ;阳性对照组腹腔注射rhG-CSF 125 μ g · kg4,连续6d。空白对照组和模型对照组 腹腔注射等体积生理盐水。
[0074] 2. 3观察指标
[0075] 2. 3. 1动物一般情况：每天称量小鼠体重，观察各组小鼠体重变化影响以及精神 状态、饮食、活动、毛发、大便等。
[0076] 2. 3. 2外周血检测：分别于给药后第7d、14d从每组中随机抽取小鼠4只，采用眼 眶后静脉丛取血，置于含用EDTA-K2抗凝剂（市售）的管中，用全自动血细胞分析仪进行白 细胞（WBC)、淋巴细胞（LY)、血小板（PLT)和红细胞（RBC)测定。
[0077] 2. 3. 3 骨髓有核细胞（bone marrow nucleated cells，BMNC)计数：于给药后 第7d、14d，每组随机选取5只小鼠，颈椎脱臼处死，取股骨并剔净软组织后，用2mL无 血清培养基DMEM(Gibeco)将全部骨髓冲出，通过4号针头分散，制成单骨髓细胞悬液， 1000印11^51^11离心后用21^01^]\1培养基（8让6(3〇)重悬红细胞，混匀后取50以1^单骨髓细 胞悬液加150 μ L红细胞裂解液（购自汉康为环保科技有限公司）（按体积比1:3的比例） 混匀后，冰上孵育15min，期间轻轻涡旋混匀两次。4°C，450Xg离心10min，小心吸弃上清液 后加入500 μ L DMEM培养基重悬细胞，制成BMNCs悬液，调整细胞浓度，按白细胞计数法进 行BMNC计数，计数3次，求平均值。
[0078] 2. 3. 4骨髓切片组织病理观察：于给药后第14d，每组随机选取5只小鼠，颈椎脱臼 处死，取一侧完整股骨浸泡10%中性福尔马林溶液中，4°C固定24h。流水冲洗2小时，浸于 已配制好的脱钙液（甲酸：水=1:1，体积比）24小时，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜 下观察骨髓组织病理结构。
[0079] 2. 3. 5脾脏指数及脾结节数观察：于给药后第7d、14d，每组随机选取5只小鼠，颈 椎脱白处死，取脾脏，用滤纸吸干血迹、称重，计算脾脏指数。脾脏指数=脾脏重量（mg)/体 重（g)。将称重后的脾脏放入新鲜配制的Bouin氏液。Bouin氏液容积与脾脏的体积总和 的比例大于5:1，放置24小时后，肉眼计数脾结节。
[0080] 2. 3. 6统计学处理：所有数据均采用SPSS 17. O统计软件处理，计量资料用均数土 标准差（I士s )表示，采用One - Way ANOVA进行检验。Ρ〈0· 05有统计学意义。
[0081] 2. 4SVPB4对正常小鼠骨髓细胞长期体外液体培养：将C57BL/6小鼠（购自广东省 实验动物中心）颈椎脱臼处死后于无菌条件下取出小鼠股骨放入装有约2mL DMEM培养基 (gibeco)的6X6cm培养皿中备用，待股骨均取出后用眼科剪和镊子将骨垢端慢慢暴露， 并将其转入装有新DMEM培养基的培养皿中，用ImL注射器吸取DMEM培养基冲洗骨髓腔， 冲出骨髓细胞，重复3~5次，将冲出的细胞悬液收集离心，去上清，用DMEM重悬细胞，按 3:1的体积比例加入红细胞裂解液，冰上孵育15min，期间轻轻涡旋混匀两次。4°C，450X g 离心10min，小心吸弃上清液；向以上沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋充 分重悬。4°C，450Xg离心10min，小心吸弃上清液。加2mL DMEM培养基悬浮单个核细胞 (Mononuclear cells，MNC)，1500rpm/min，4°C 离心 lOmin。去上清后再用 2mL 含 20%的 FBS (胎牛血清）的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数3次，求平均值后，调整细胞密度（10倍 以内稀释）至5 X 105/mL，24孔板每孔需加入lmL，分为Control组（加生理盐水），IL-3组 (10ng/mL)，GM-CSF (粒-巨噬细胞集落刺激因子）组（50ng/mL)，SVPB4组（2 μ g/mL)，每周 半量换液，连续观察4周。
[0082] 3 结果
[0083] 3. I SVPB4对小鼠一般状况的影响
[0084] 空白对照组小鼠体重随生长加重，摄食和活动均无异常；模型对照组小鼠活动迟 缓、倦卧、毛色无光泽、精神萎靡、摄食量明显减少