br>[0034]CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，结合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个CDR区。优选地，本发明的结合分子包含本文揭示的至少两个⑶R。
[0035]本发明的另一方面包括本文所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合丙型肝炎病毒或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合丙型肝炎病毒E2蛋白或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。
[0036]所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
[0037]保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。
[0038]此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合丙型肝炎病毒或其片段。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区或⑶R区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个⑶R，以及更保守的区域，即所谓的构架区(FR)。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50%至大约99%、优选至少大约60%至大约99%、更优选至少大约70%至大约99%、甚至更优选至少大约80%至大约99%、最优选至少大约90%至大约99%、特别是至少大约95%至大约99%，以及特别是至少大约97%至大约99%的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于丙型肝炎病毒具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。
[0039]作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体，优选它包括人源的恒定区(如人源恒定区IgH序列和IgKappa序列)。所述的抗丙型肝炎病毒单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区以及位于重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)均具有独特的不同于现有技术的结构，且它们是全人源的。
[0040]本发明包括:具有所述单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述单克隆抗体可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及⑶R区与本发明的单克隆抗体的⑶R具有90%以上(较佳地95%以上)的同源性的任何抗体。
[0041]抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining reg1n,CDR),所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的⑶R和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了 FR或⑶R区域。
[0042]对于本发明的单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。
[0043]经验证，本发明的抗丙型肝炎病毒单克隆抗体的⑶R区是全新的，其针对的是一个独特的丙型肝炎病毒Ε2蛋白上的抗原表位，技术构思不同于现有的抗丙型肝炎病毒抗体。
[0044]本发明的单克隆抗体是全人源的，其重链、轻链可变区以及恒定区均来源于人抗体。因此，其在具有特别优异的识别和中和丙型肝炎病毒的作用的同时，还具有免疫原性低、安全性高的特点。
[0045]在本发明的实施例中，从近年感染丙型肝炎病毒的志愿者体内获得外周血单个核细胞(PBMC)，使用⑶19+/IgG+/HCV-E2为特异性标志物，经流式细胞仪分选(FACS)获得识别丙型肝炎病毒E2蛋白的特异性B细胞。使用文献已报道的单细胞RT-PCR技术(Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112 - 124),获得了抗体基因，并在293T细胞中进行表达获得全人单克隆抗体7F2。真病毒(HCV-ElE2pp)中和试验表明，7F2抗体对于HCV真病毒具有超过60%的抑制率。由此可见，7F2抗体具有较强的亲和力和中和活性，具有临床上预防和治疗丙型肝炎病毒感染的可能。
[0046]另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质的分子。本发明还涉及本发明免疫缀合物的混合物或者至少一种本发明免疫缀合物与另一分子的混合物，所述另一分子如治疗剂或者另一结合分子或免疫缀合物。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记可以彼此相同或不同，并且可以与结合分子非共价地结合/缀合。所述标记也可以通过共价键与人结合分子直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合分子结合/缀合。标记与结合分子的缀合技术为本领域技术人员所熟知。
[0047]本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经感染丙型肝炎病毒毒株或者作为临床实验程序的一部分监测丙型肝炎病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
[0048]此外，本发明的人结合分子或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，其特别用于丙型肝炎病毒E2蛋白或其片段的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子可以与标记序列融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、myc标记或者flag标记。或者,一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。
[0049]另一方面，本发明的结合分子可以与一或多个抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由给予了结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附着抗原和结合分子的缀合方法为本领域所熟知，包括但不限于使用交联剂。本发明的结合分子结合丙型肝炎病毒并且附着于结合分子的抗原将引发对于所述缀合物的有力T细胞攻击，最终导致丙型肝炎病毒的破坏。
[0050]除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以