ramycin)等；（2)影 响核酸代谢的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX)和培美曲塞（Pemetrexed) 等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5氟尿嘧啶、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶 抑制剂如6-巯基噪呤等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（Hydroxycarbamide)等；DNA 多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Cytosine arabinoside)和吉西他滨（Gemcitabine)等； (3)作用于微管蛋白的药物：多西他赛（Docetaxel)、长春花碱（Vincristine)、长春瑞 滨（Vinorelbine)、鬼白硷类、高三尖杉酯碱等；2、激素类药物：抗雌激素如他莫昔芬 (Tamoxifen)、屈洛昔芬（Droloxifene)、依西美坦（Exemestane)等；芳香化酶抑制剂如 氨鲁米特（Aminoglutethimide)、福美司坦（Formestane)、来曲唑（Letrozle)、阿那曲唑 (Anastrozole)等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物 反应调节剂类药物：此类药物主要通过调节机体免疫功能以到抗肿瘤的效果，如干扰素类 (Interferon);白细胞介素 -2 (Interleukin-2);胸腺肽类（Thymosins)等；4、单克隆抗体 类药物：曲妥昔单抗（Trastuzumab)、利妥昔单抗（Rituximab)、西妥昔单抗（Cetuximab)、 贝伐单抗（Bevacizumab)等；5、其他类抗肿瘤药物：包括一些目前机制尚不明确、有待进一 步研究的药物等。本发明公开的抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗 肿瘤药物之一或其组合联合用药。
【附图说明】
[0041] 图1.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体与ro-Ι结合力实验；
[0042] 图2.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体与CTLA-4结合力实验；
[0043] 图3.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体的混合淋巴细胞增殖实验
[0044] 图4.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体血药浓度时间曲线
【具体实施方式】
[0045] 以下实施例、实验例是对本发明的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。实 施例不包括对常规方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基 因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对本领域 中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如：Sambr〇〇k， J.,Fritsch,E. F. and Maniais,T. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0046] 实施例1.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体表达载体的构建
[0047] 全人源抗CTLA-4单抗的全长基因（轻链和重链）序列（参见专利US8318916B2所 公开的氨基酸序列，轻链可变区SEQ ID N07,重链可变区SEQ ID N017,轻链恒定区SEQ ID N039,重链恒定区SEQ ID N040)由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成，全 人源抗I3D-I单抗的全长基因（轻链和重链）序列（参见专利US20130133091A1中公开的 氨基酸序列，轻链可变区SEQ ID N08,重链可变区SEQ ID N03,轻链和重链恒定区和上述 US8318916B2所述SEQ ID N039-40相同）也由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合 成。根据DNA序列分别设计引物用聚合酶链式反应扩增抗CTLA-4单抗的轻链和重连可变 区，以及抗ro-i单抗的轻链和重连；设计引物时引入一定长度的互补重叠区，以便用重组 PCR法将抗CTLA-4单抗的可变区基因连接到抗Η)-1单抗的轻链和重链基因片段上；互补 重叠区编码外源的链接区(氨基酸序列为：GGGGSGGGGS)，用以使相邻的两个可变区结构域 有一定的空间活动自由度。
[0048] PCR均采用高保真DNA聚合酶(购自Takara公司的PrimeSTAIT HS DNA Polymerase)。扩增抗ro-Ι单抗轻重链全长基因以及抗CTLA-4轻重链可变区片段的反应 条件按照DNA聚合酶生产商说明书合理设置：95°C 20秒；55°C 10秒，72°C 1分/kb ;30个 循环。以上PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后用于重组PCR的模板，重组PCR反应条 件为：95°C 20秒；55°C 10秒，72°C 2分；6个循环后再加入相应的引物；95°C 20秒；55°C 10 秒，72°C 1分/kb。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pCHOl. O载体(购自Life Technologies公司）中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2 分别显示了抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体重链的核苷酸和氨基酸序列；SEQ ID NO: 3和SEQ ID N0:4分别显示了抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体轻链的核苷酸和氨基酸序列。本例中的 正确克隆记作 pCHOl. 0 (DVD-CTLA-4/PD-1)。
[0049] 实施例2.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体在中国仓鼠卵巢细胞（CHO)中的表达
[0050] 于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度5X 105的CHO-S细胞，第二天细胞密度 增至I X 106且细胞活率高于95%时进行转染：将50 μ 1浓度为1 μ g/ μ 1的编码抗CTLA-4/ PD-I双特异性抗体轻重链的质粒pCHOl. 0 (DVD-CTLA-4/PD-1)稀释到I. 45ml0ptiPR0?SFM (购自Life Technologies公司，以下同）中，轻轻混匀；将50μ 1转染试剂FreeStyle?MAX (购自Life Technologies公司，以下同）稀释到I. 45ml0ptiPR0?SFM中，轻轻混匀；立即 将稀释后的FreeStyleTMMAX溶液慢慢加入到稀释后的DNA溶液中，加入时枪头浸于液面之 下并慢慢排出液体；立即上下颠倒数次使溶液混匀，室温下孵育10分钟左右以使DNA-脂 质体复合物形成；将3mlDNA-FreeStyle?MAX复合物逐滴加入到上述培养细胞的摇瓶中，边 加边轻摇培养瓶；转染后的细胞培养物置于37°C、8% C02、转速130rpm的细胞培养摇床上 培养。转染48小时后，离心收集细胞，将培养液换成含有20 μ g/ml嘌呤霉素（Puromycin) 和200nM甲氨喋呤（MTX)的选择培养基筛选稳定转染的抗性克隆；大约两周之后，待细胞 活率和密度恢复时，离心收集细胞，将培养液换成含有50 μ g/ml嘌呤霉素（Puromycin)和 1000 nM甲氨喋呤（MTX)的选择培养基；大约一周之后，待细胞活率和密度恢复时，离心收集 细胞，将培养液换成不含抗生素的培养基，置于37°C、8%C02、转速130rpm的摇床上悬浮培 养10天，期间在第3、5、7、9天以4g/L的终浓度补加葡萄糖；10天后，细胞培养物经低速离 心（300g)5分钟去除大部分细胞以及细胞残片后，再经高速离心（1000 Og)IO分钟除去仍然 悬浮的固形物，然后抽滤(滤膜孔径〇。45μηι)，最后用Protein A亲和层析柱(购自GE公 司）从获得的澄清液体中分离纯化抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体。纯化产物经测序，和SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4序列一致，将纯化融合受体用PBS进行透析，最后以人免疫球蛋白为 标准品用BCA (Bicinchoninic acid)法进行定量。
[0051] 实施例3.抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体亲和力检测实验-ELISA法
[0052] 实验步骤：重组蛋白CTLA-4 (购自R&D公司，以下同）和ro-Ι (购自R&D公司，以 下同）用〇. 〇5mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)稀释成2μ g/ml，96孔酶标板每孔添加100μ 1 上述稀释后的蛋白溶液，4°C于湿盒内过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(含有 0. 05%TWeen-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每次3分钟；将不同稀释度的抗CTLA-4抗体(根 据实施例1中所述抗CTLA-4抗体序列并按照实施例1和实施例2方法制备得到，以下同)、 抗ro-Ι抗体(根据实施例1中所述抗ro-i抗体序列并按照实施例1和实施例2方法制备得 至|J，以下同）以及抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体100μ 1加于上述已包被的反应孔中，置37°C 孵育1小时；然后用洗涤缓冲液洗涤，加辣根过氧化物酶标记的羊抗人