IGF‑1R抗体及其作为定位载体用于治疗癌症的用途的制作方法

本发明涉及能够结合IGF-1R的新的抗体，尤其是单克隆抗体，以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。一方面，本发明涉及能够结合IGF-1R并通过诱导IGF-1R的内在化而被内在化到细胞中的新的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括所述抗体作为缀合有其它抗癌化合物(如毒素、放射性元素或药物)的定位产品或载体的用途，及其用于治疗某些癌症的用途。
背景技术：
：称为IGF-1R的胰岛素样生长因子1受体(还称为IGF1R或IGF-IR)是一种具有酪氨酸激酶活性的受体，与胰岛素受体IR具有70％的同源性。IGF-1R是分子量约350,000的糖蛋白。它是每半由二硫桥连接的异四聚体受体，由细胞外的α-亚单元和跨膜的β-亚单元组成。IGF-1R以很高的亲和力结合IGF1和IGF2(Kd#1nM)，但是同样能够以低100至1000倍的亲和力结合胰岛素。相反地，IR以很高的亲和力结合胰岛素，虽然IGF仅以低100倍的亲和力结合胰岛素受体。IGF-1R和IR的酪氨酸激酶结构域具有很高的序列同源性，虽然较弱同源性的区域分别涉及位于α-亚单位和β-亚单位的C-末端部分的富含半胱氨酸的区域。在α-亚单位中观察到的序列的差异位于配体的结合区域，且因此产生IGF-1R和IR分别对IGF和胰岛素的相对亲和力。在β-亚单位的C-末端部分中的差异导致在两种受体的信号转导途径中的分歧；IGF-1R介导促有丝分裂、分化和抗凋亡作用，然而IR的激活主要涉及在代谢途径的水平的作用。细胞质酪氨酸激酶蛋白由配体与受体的细胞外结构域结合激活。反过来激酶的激活涉及不同的细胞内基底(substrate)的刺激，包括IRS-1、IRS-2、Shc和Grb10。IGF-1R的两种主要的基底是IRS和Shc，其通过激活很多下游效应物的激活，介导大部分与IGF和这种受体的附着有关的生长和分化的作用。因此，基底的有效性指示与IGF-1R的激活有关的最终生物效应作用。当IRS-1占优势时，细胞趋向增殖和转化。当Shc主导时，细胞趋向分化。似乎防止凋亡的作用主要涉及的通路是磷脂酰-肌醇3-激酶(PI3-激酶)通路。在最近10年，IGF系统在致癌作用中的作用成为深入研究的课题。这种兴趣之后发现这样的事实，即除了它的促有丝分裂和抗凋亡特性，IGF-1R似乎是转化表型的建立和维持所需要的。事实上，已经证实过表达或组成型激活IGF-1R在很多不同的细胞中导致细胞不依赖于无胎牛血清介质的支持而进行生长，并且导致在裸鼠中形成肿瘤。这本身不是一种独特的特性，因为很多不同的过表达基因的产物能够转化细胞，包括很多生长因子的受体。然而，清楚地表明IGF-1R在转化中起到的主要作用的关键发现中已经表明IGF-1R-细胞(其中编码IGF-1R的基因被灭活)是对不同试剂的转化完全耐受的，这些试剂通常能够转化细胞，比如牛乳头瘤病毒的E5蛋白、EGFR或PDGFR的过表达、SV40的T抗原、激活的ras或最后这两种因子的组合。IGF-1R在很多不同的肿瘤和肿瘤系中表达，并且IGF通过它们与IGF-1R的附着扩大肿瘤生长。支持IGF-1R在致癌作用中的作用的其它论据来自使用针对受体的鼠单克隆抗体或使用阴性显性的IGF-1R的研究。实际上，针对IGF-1R的鼠单克隆抗体抑制很多在培养中的细胞系的增殖，以及在体内肿瘤细胞的生长。同样显示了阴性显性的IGF-1R能够抑制肿瘤的增殖。在这种情况中，很长时间以来IGF-1R被认为是在肿瘤学中感兴趣的靶标。大量靶向IGF-1R的项目(人源化或人抗体或小分子)已经开始开发IGF-1R抗体用于治疗癌症，并且在多种适应症中，已经进行超过70项临床试验。然而目前这些项目没有成功，并且市场上没有IGF-1R抗体，尽管在广泛系列的适应症中，对许多患者描述了这种靶标的频繁过表达。此外，涉及为了靶向EGFR和IGF-1R的抗IGF-1R抗体与抗EGFR抗体组合的一系列临床试验失败了，因为这些抗体不能够治疗KRAS突变患者。因此，目前IGF-1R不被认为是主要的靶标，并且在潜在的治疗性抗体的研究中，IGF-1R似乎不再被认为是特别感兴趣的。然而还必须注意到生成IGF-1R抗体的努力专注于裸抗体，即通过其固有特性有用的抗体。在这层意义上，IGF-1R被认为是不适合用于生成免疫缀合物比如抗体-药物缀合物(称为“ADC”)的靶标，如描述了IGF-1R作为靶标还广泛地被正常细胞包括血管表达。在这层意义上，应注意到大多数最近的IGF-1R抗体(即AVE1642)作为裸抗体开发，没有负载药物。它与目前正在开发中的其它IGF-1R抗体并在临床试验中失败的所有那些相同。技术实现要素：在一个方面，本发明倾向解决这些问题，且描述了一种能够以特异性的方式结合IGF-1R的IGF-1R抗体，比如它是适合负载药物而使用的。更具体地，本发明涉及一种显示特定特性的IGF-1R抗体，比如它是在免疫缀合物的情况中负载所使用的最佳候选物。在第一实施方案中，本发明涉及抗体、或其抗原结合片段，其i)与人IGF-1R结合，并且ii)与所述人IGF-1R结合之后被内在化。以最广泛的意义，术语“抗体(antibody)”、“抗体(antibodies)”、“ab”、“Ab”或“免疫球蛋白”可以互换使用，并且包括单克隆抗体、分离的、工程化的、化学合成的或重组的抗体(例如，全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组抗体。更具体地，这样的分子由糖蛋白组成，所述糖蛋白包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链包含重链可变区(或结构域)(此处缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(此处缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布于更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一补体(Clq)。根据本发明的抗体的“IGF-1R结合片段”或“抗原结合片段”，意在表示保留了抗体的结合靶标(一般也称为抗原)能力的任何肽、多肽或蛋白。在一个实施方案中，这样的“抗原结合片段”选自Fv、scFv(sc表示单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或双特异抗体、或通过化学修饰，如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化”)(聚乙二醇化片段被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG)(“PEG”表示聚乙二醇)、或通过并入脂质体中来延长其半衰期的任意片段，所述片段具有至少一个根据本发明抗体的特征CDR。优选地，所述“抗原结合片段”将由如下构成或包括其所衍生自的抗体的可变重链或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与其所来自的抗体相同的结合特异性以及足够的亲和力，优选所述足够的亲和力至少等于其所来自的抗体对靶标亲和力的1/100、更优选至少1/10的方式。更优选地，所述“抗原结合片段”将由、或包括其所衍生自的抗体的重可变链的至少三个CDRCDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和轻可变链的三个CDRCDR-L1、CDR-L2和CDR-L3组成。“结合”等，意图表示抗体或其任何抗原结合片段与抗原形成生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于至少约1x10-6M或更小的平衡解离常数。确定两个分子是否结合的方法是本领域中公知的，并包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。为避免疑问，这并不意味着所述抗体不能以低水平结合或干扰另一个抗原。然而，作为一个实施方案，所述抗体仅结合所述抗原。如本说明书中所使用的，表述“IGF-1R抗体”应以类似于“抗IGF-1R抗体”来解释，且指能够结合IGF-1R的抗体。在本申请的一个实施方案中，抗体的表位定位于人IGF-1R的细胞外结构域(也称为IGF-1RECD)。在一个具体的实施方案中，抗体、或其任何抗原结合片段能够以10x10-10至1x10-10，以及更优选8x10-10至2x10-10M的EC50结合IGF-1R。在这个意义上，“EC50”是指50％的有效浓度。更精确地，术语半数最大有效浓度(EC50)对应着一段特定暴露时间之后，诱导基线和最大值之间一半反应的药物、抗体或毒物浓度。其通常用作药物效力的量度。因此，分级剂量反应曲线的EC50代表观察到其最大作用的50％时的化合物浓度。量子剂量反应曲线的EC50表示暴露特定时间段之后，50％的群体表现出反应的化合物浓度。浓度测量通常遵循S形曲线，在相对小的浓度变化中迅速增加。这可以通过最佳拟合线的推导而数学上进行确定。作为一个优选的实施方案，本发明中确定的EC50表征抗体结合暴露在人肿瘤细胞上的IGF-1RECD的效力。使用FACS分析确定EC50参数。EC50参数反映获得对人肿瘤细胞上表达的人IGF-1R的50％最大结合的抗体浓度。使用四参数回归曲线拟合程序(Prism软件)，各EC50值计算为剂量反应曲线的中点。该参数已被选定为生理/病理状况的代表。术语“表位”是指被抗原结合蛋白(包括抗体)所结合的抗原区域。表位可被定义为结构的或功能的。功能表位一般是结构表位的子集，并具有对相互作用的亲和力有直接贡献的那些残基。表位也可以是构象的，即由非线性氨基酸组成，换言之，构象表位由非连续氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括决定簇，决定簇是化学激活的分子表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，以及在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于选择内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段的方法，所述内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段与人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合，并在与IGF-1R结合之后被内在化，所述方法包括选择抗体的步骤：i)所述抗体与SEQIDN°52所示的IGF-1R结合，以及ii)所述抗体不结合在SEQIDN°52的位置494处含有除组氨酸以外的氨基酸或者在位置491处含有除天冬氨酸(ASP)以外的氨基酸的SEQIDN°52所示的IGF-1R，优选地，所述抗体不结合在SEQIDN°52的位置494处含有除组氨酸以外的氨基酸且在位置491处含有除天冬氨酸(ASP)以外的氨基酸的SEQIDN°52所示的IGF-1R。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及用于选择内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段的方法，所述内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段与人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合，在与IGF-1R结合之后被内在化，所述方法包括步骤：1)选择抗体：i)所述抗体与SEQIDN°52所示的IGF-1R结合，以及ii)所述抗体不结合在SEQIDN°52的位置494处含有除组氨酸以外的氨基酸或者在位置491处含有除天冬氨酸(ASP)以外的氨基酸的SEQIDN°52所示的IGF-1R，优选地，所述抗体不结合在SEQIDN°52的位置494处含有除组氨酸以外的氨基酸且在位置491处含有除天冬氨酸(ASP)以外的氨基酸的SEQIDN°52所示的IGF-1R，然后，从这样的抗体2)选择内在化抗体、或其IGF-1R结合片段，与IGF-1R结合之后内在化百分比为至少40％，优选至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及用于选择内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段的方法，所述内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段与人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合，与IGF-1R结合之后被内在化，所述方法包括步骤：1)选择内在化抗体、或其IGF-1R结合片段，与IGF-1R结合之后内在化百分比为至少40％，优选至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。2)然后，从这样的抗体选择抗体：i)所述抗体与SEQIDN°52所示的IGF-1R结合，以及ii)所述抗体不结合在SEQIDN°52的位置494处含有除组氨酸以外的氨基酸或者在位置491处含有除天冬氨酸(ASP)以外的氨基酸的SEQIDN°52所示的IGF-1R，优选地，所述抗体不结合在SEQIDN°52的位置494处含有除组氨酸以外的氨基酸且在位置491处含有除天冬氨酸(ASP)以外的氨基酸的SEQIDN°52所示的IGF-1R。在根据本发明的方法中，根据其内在化和结合或不结合IGF-1R的特征选择抗体的步骤可以以任何连续的顺序进行。根据一个具体的实施方案，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，所述内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段与人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合，比如通过根据本发明以上所述的方法之一获得的内在化抗体或其内在化IGF-1R结合片段。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，所述内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段与SEQIDN°52所示的人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合，且在与IGF-1R结合之后被内在化，且所述内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段不结合SEQIDN°82或92、优选SEQIDN°82和92所示的IGF-1R。对于根据本发明的抗体，SEQIDN°52对应于人IGF-1R受体的氨基酸序列，其中在位置494处是组氨酸，即野生型IGF-1R，然而SEQIDN°82对应于人IGF-1R受体的突变的氨基酸序列，其中在位置494处是精氨酸，而SEQIDN°92对应于人IGF-1R受体的突变的氨基酸序列，其中在位置491处是丙氨酸。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置494处的组氨酸氨基酸。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置494处的组氨酸氨基酸，所述表位包含至少8个氨基酸的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置491处的天冬氨酸氨基酸，所述表位包含至少8个氨基酸的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置494处的组氨酸氨基酸和位置491处的天冬氨酸氨基酸，所述表位包含至少8个氨基酸的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置494处的组氨酸氨基酸，所述表位包含9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置494处的组氨酸氨基酸，所述表位包含至少8个氨基酸的氨基酸序列，其中所述表位包含的氨基酸序列选自：-与从SEQIDN°52的位置487处的氨基酸至位置494处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置488处的氨基酸至位置495处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置489处的氨基酸至位置496处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置490处的氨基酸至位置497处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置491处的氨基酸至位置498处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置492处的氨基酸至位置499处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，以及-与从SEQIDN°52的位置493处的氨基酸至位置500处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置491处的天冬氨酸氨基酸，所述表位包含9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置491处的天冬氨酸氨基酸，所述表位包含至少8个氨基酸的氨基酸序列，其中所述表位包含的氨基酸序列选自：-与从SEQIDN°52的位置484处的氨基酸至位置491处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置485处的氨基酸至位置492处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置486处的氨基酸至位置493处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置487处的氨基酸至位置494处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置488处的氨基酸至位置495处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置489处的氨基酸至位置496处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，以及-与从SEQIDN°52的位置490处的氨基酸至位置497处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置494处的组氨酸氨基酸和位置491处的天冬氨酸，所述表位包含9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸的氨基酸序列。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置494处的组氨酸氨基酸和位置491处的天冬氨酸，所述表位包含至少8个氨基酸的氨基酸序列，其中所述表位包含的氨基酸序列选自：-与从SEQIDN°52的位置487处的氨基酸至位置494处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置488处的氨基酸至位置495处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置489处的氨基酸至位置496处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，-与从SEQIDN°52的位置490处的氨基酸至位置497处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列，和-与从SEQIDN°52的位置491处的氨基酸至位置498处的氨基酸的氨基酸序列相同、或表现出至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，所述内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段与SEQIDN°52所示的人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合，且与IGF-1R结合之后被内在化，且所述内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段不结合SEQIDN°82所示的IGF-1R，或者其中所述内在化抗体的表位包含在SEQIDN°52的位置494处的组氨酸氨基酸和/或在位置491处的天冬氨酸氨基酸，其中所述抗体与IGF-1R结合之后的内在化百分比为至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。抗体或其抗原结合片段的内在化百分比可以通过本领域技术人员已知的任何方法确定，比如，例如在本说明书中描述的方法。在一个具体的实施方案中，本发明涉及根据本发明的内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中在SEQIDN°52的位置494处除组氨酸以外的所述氨基酸是精氨酸(SEQIDN°82)。在一个具体的实施方案中，本发明涉及根据本发明的一种内在化抗体、或其内在化IGF-1R结合片段，其中在SEQIDN°52的位置491处除天冬氨酸以外的所述氨基酸是丙氨酸(SEQIDN°92)。根据一个实施方案，本发明涉及一种抗体，或其抗原结合片段，其与人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合，且在与IGF-1R结合之后被内在化，其中所述抗体选自：i)一种抗体，其包含三个重链CDR，序列SEQIDNo.2所示的CDR-H2和序列SEQIDNo.3所示的CDR-H3，以及三个轻链CDR，序列SEQIDNo.5所示的CDR-L2；ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；以及iii)与i)的抗体结合相同的IGF-1R表位的抗体。可以通过本领域技术人员已知的任何方法或技术确定竞争结合IGF-1R，比如但不限于放射活性、Biacore、ELISA、流式细胞术等，或者根据比如在本说明书中描述的方法。可以通过本领域技术人员已知的任何方法或技术确定相同表位的结合的确定，比如但不限于放射活性、Biacore、ELISA、流式细胞术等，或者根据比如在本说明书中描述的方法。如以上所述，且与公知常识不同，本发明专注于结合IGF-1R之后显示高度内在化能力的特异性IGF-1R抗体。如在此使用的，“被内在化”或“内在化的”抗体(两种表述类似)是通过结合在哺乳动物细胞上的IGF-1R被细胞摄取(意思是它“进入”)的抗体。这种抗体是作为免疫-药物-缀合物成分之一感兴趣的，因此它定位或指导相连的细胞毒性剂进入靶细胞，优选癌症细胞。一旦内在化，细胞毒性剂引发癌症细胞死亡。优选地，根据本发明的抗体全部显示相同的CDR-H2、CDR-H3和CDR-L2序列，其它三个CDR是不同的。这一观察似乎与作为关于抗体结合特异性的公知常识的一部分相一致，即描述了CDR-H3是识别表位最重要且最相关的。免疫缀合物疗法成功的重要关键之处被认为是靶标抗原的特异性和抗原结合蛋白复合物内在化至癌症细胞中。显然，相较于内在化的抗原，非内在化的抗原不能有效递送细胞毒性剂。随着抗原的不同以及取决于受抗体影响的多种参数，内在化的过程是可变的。在免疫缀合物中，细胞毒性剂带来细胞毒性活性，所用的抗体带来其对癌症细胞的特异性，以及用于进入细胞内来正确定位细胞毒性剂的载体。因此，为了改善免疫缀合物，抗体可以表现出高度内在化至靶标癌症细胞中的能力。抗体介导的内在化的效率根据所靶标的表位而显著不同。选择有效的内在化IGF-1R抗体，不仅需要研究IGF-1R下调，还研究IGF-1R抗体内在化进入细胞之后的不同实验数据。在一个实施方案中，可以通过免疫荧光(如在本申请中下文举例说明的)或通过本领域技术人员已知的内在化机制特有的任何方法或过程，评估根据本发明的抗体的内在化。复合物IGF-1R/抗体，在抗体结合所述IGF-1R的ECD之后被内在化，诱导了在细胞表面IGF-1R的量减少。可以通过本领域技术人员已知的任何方法比如作为非限制性的示例的western印迹、FACS、免疫荧光等来定量这种减少。在一个实施方案中，因此体现内在化的这种减少，优选可以通过FACS进行测量，并表示为在4℃测量的平均荧光强度(MFI)与抗体在37℃孵育4小时后测量的MFI之间的差或Δ。作为非限制性示例，基于用未处理的细胞和用抗体处理的细胞获得的MFI，使用i)乳癌细胞MCF7在与本文所述的抗体孵育4小时后，以及ii)用Alexa488标记的第二抗体测定该Δ。此参数定义为使用以下公式计算：Δ(MFI4℃-MFI37℃)。由于MFI与细胞表面上表达的IGF-1R成比例，MFI之间的这种差异反映出IGF-1R的下调。在一个有利的方面，抗体或其任何抗原结合片段由单克隆抗体组成，其引发MCF7上至少280、优选至少400的Δ(MFI4℃–MFI37℃)。更详细地，可以根据以下的过程测量上述Δ，其必须被视为说明性和非限制性的示例：a)在冷的(4℃)或热的(37℃)完全培养介质中，用本发明的抗体处理和孵育兴趣肿瘤细胞；b)用第二抗体平行处理步骤a)处理的细胞以及未处理的细胞，c)用能结合本发明抗体的第二标记抗体，测量处理和未处理的细胞的MFI(代表存在于表面的IGF-1R量)，以及d)将Δ计算为未处理的细胞所获得的MFI减去处理的细胞所获得的MFI的差。从这个ΔMFI，可以确定内在化百分比：100x(MFI4℃-MFI37℃)/MFI4℃。根据本发明，出现在MCF7上的抗体或其任何抗原结合片段，内在化百分比包括在70％至90％，优选75％至87％之内。在此描述的抗体的具体优势取决于它们的内在化比率。众所周知，对于免疫缀合物，期望所使用的抗体显示快速的内在化，优选从在内体施用抗体的24小时内，以及更优选地在12小时内，以及甚至更优选地在6小时内。在本发明中，内在化比率也称为细胞表面结合抗体减少或细胞表面抗体衰减(decay)，表示为t1/2(半衰期)且对应获得50％的ΔMFI减少所需的时间(这个方面将根据以下的实施例清楚理解)。一个具体的优势是本发明的抗体具有5至25分钟，优选10至20分钟的t1/2。本发明的一个具体的实施方案涉及一种抗体，其包含序列SEQIDNo.1、2和3所示的三个重链CDR，以及序列SEQIDNo.4、5和6所示的三个轻链CDR。一个实施方案是一种抗体或其抗原结合片段，包含三个重链CDR，所述三个重链CDR包含、由序列SEQIDNO.1、2和3或表现出与SEQIDNO.1、2和3至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成；以及三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包含、或由序列SEQIDNO.4、5和6或表现出与SEQIDNO.4、5和6至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成。在另一个实施方案中，抗体或其任何抗原结合片段包含三个重链CDR，所述三个重链CD包含、或由序列SEQIDNO.1、2和3组成；以及三个轻链CDR，所述三个轻链CDR包含、或由序列SEQIDNO.4、5和6组成。CDR区或CDR意指IMGT所定义的免疫球蛋白重链和轻链的高变区。无论抗原受体、链类型或物种如何，都将IMGT独特的编号限定用来比较可变结构域(LefrancM.-P.,ImmunologyToday18,509(1997)/LefrancM.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。在IMGT独特编号中，保守性氨基酸总是具有相同位置，例如半胱氨酸23(第1个CYS)、色氨酸41(保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104(第2个CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT独特编号提供了框架区(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互补决定区CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117的标准化定界。由于空位代表未占用的位置，CDR-IMGT长度(在括号之间显示，并用点分开，例如[8.8.13])成为关键信息。在2D图解中使用IMGT独特编号，命名为IMGTColliersdePerles(Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,CurrentBioinformatics,2,21-30(2007))，并在IMGT/3D结构DB中的3D结构中使用(Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,TcellreceptorandMHCstructuraldata.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004))。必须理解的是，在本说明书中没有矛盾的说明，互补决定区或CDR意思是根据IMGT编号系统定义的免疫球蛋白重链和轻链的高变区。然而，也可根据Kabat编号系统定义CDR(Kabat等人，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH,1991和之后的版本)。有三个重链CDR和三个轻链CDR。此处，取决于情况，术语“CDR”用于指代一个或多个、或甚至全部含有大多数氨基酸残基的区域，所述氨基酸残基负责其所识别的抗原或表位的抗体结合亲和力。为了简化本申请的阅读，未定义根据Kabat的CDR。然而，使用根据IMGT的CDR的定义、根据Kabat定义CDR将是本领域技术人员显而易见的。在本发明的含义中，两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”意指待比较的两条序列间相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，其在最佳比对后获得，此百分比是纯粹统计上的，两条序列间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列的比较传统上通过在对其最佳比对后比较序列来实施，所述比较能通过节段(segment)或通过使用“比对窗口”来执行。除了手动比较之外，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)(Ad.App.Math.2：482)、通过Neddleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)(J.Mol.Biol.48：443)、通过Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444)或通过使用这些算法的计算机软件(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算组，575ScienceDr.，Madison，WI，或通过比较软件BLASTNR或BLASTP)可以实施待比较的序列的最佳比对。通过比较两个最佳比对的序列确定两个核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，其中待比较的核酸或氨基酸序列，相较于用于两条序列间最佳比对的参考序列，可以有添加或删除。通过确定两条序列间(优选两条完整序列间)相同氨基酸核苷酸或残基的位点的数目计算百分比同一性，将相同位点数除以比对窗口的总位点数并将结果乘以100以获得两条序列间的百分比同一性。例如，可以使用在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可用的BLAST程序，“BLAST2序列”(Tatusova等人，“Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences”，FEMSMicrobiol.，1999，Lett.174：247–250)，使用用缺省参数(特别是参数“开放空位罚分”：5，和“延伸空位罚分”：2；所选矩阵(matrix)是例如程序提出的“BLOSUM62”矩阵)；直接用程序计算待比较的两条序列之间的百分比同一性。对于显示出与参考氨基酸序列有至少80％、优选85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列，优选的示例包括包含参考序列、某些修饰(特别是删除、插入或取代至少一个氨基酸、截短或延长)的那些。在一个或多个连续或不连续的氨基酸被取代的情况下，优选在取代中所取代的氨基酸被“等价”氨基酸所代替。在此，表述“等价氨基酸”意指可能取代一个结构氨基酸、而不改变相应抗体生物学活性的任意氨基酸，以及下面定义的那些具体示例的任意氨基酸。可以根据其与它们所取代的氨基酸的结构同源性、或者根据可能生成的各种抗原结合蛋白间生物活性比较测试的结果来确定等价氨基酸。作为非限制性示例，下面表1总结了可以实施而不导致相应修饰的抗原结合蛋白生物活性显著变化的可能取代；在同一条件下自然可以做相反的取代。表1原始残基取代Ala(A)Val、Gly、ProArg(R)Lys、HisAsn(N)GlnAsp(D)GluCys(C)SerGln(Q)AsnGlu(E)AspGly(G)AlaHis(H)ArgIle(I)LeuLeu(L)Ile、Val、MetLys(K)ArgMet(M)LeuPhe(F)TyrPro(P)AlaSer(S)Thr、CysThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Phe、TrpVal(V)Leu、Ala本发明的一个具体的方面是抗体或其任何抗原结合片段，不与胰岛素受体(IR)结合。这个方面是感兴趣的，因为在此描述的抗体将不会对IR(意思是胰岛素代谢)有任何负面影响。在另一个实施方案中，本发明的抗体的另一个有利的方面是不仅能够与人IGF-1R结合，还与猴IGF-1R结合，更具体地与猕猴IGF-1R结合。这个方面也是感兴趣的，因为它将促进毒性和临床试验。在另一个实施方案中，本发明的抗体由单克隆抗体组成。如在此使用的术语“单克隆抗体”或“Mab”指从大体上同质的抗体群获得的抗体，即除了可以以最小量存在的可能天然出现的突变之外，群中的单个抗体是相同的。单克隆抗体是针对单表位高度特异性的，这样的单克隆抗体可以通过单克隆的B细胞或杂交瘤生产。单克隆抗体也可以是重组的，即通过蛋白工程生产。单克隆抗体也可以是从噬菌体抗体库中分离的。此外与典型地包括针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体的制备不同，每种单克隆抗体针对抗原的单表位。本发明涉及一种分离的抗体或者从天然来源通过纯化获得的抗体，或者通过基因重组或化学合成获得的抗体。在一个实施方案中，在此的单克隆抗体包括鼠、嵌合和人源化的抗体，比如下文描述的。抗体可以衍生自提交于国家微生物保藏中心(法国，巴黎，巴斯德研究所，CNCM)的鼠源杂交瘤，所述杂交瘤通过免疫的Balb/C小鼠脾细胞/淋巴细胞和骨髓瘤Sp2/O-Ag14细胞系的细胞融合获得。在另一个实施方案中，本发明的抗体由重组抗体组成。术语“重组抗体”指在活细胞中由重组DNA的表达获得的抗体。本发明的重组抗体通过使用本领域技术人员公知的基因重组的实验室方法创建不会在生物体中发现的DNA序列获得。在另一个实施方案中，本发明的抗体由化学合成抗体组成。在一个实施方案中，本发明的IGF-1R抗体由鼠抗体组成，然后称为m[抗体的名称]。在一个实施方案中，IGF-1R抗体由嵌合抗体组成，然后称为c[抗体的名称]。在一个实施方案中，IGF-1R抗体由人源化抗体组成，然后称为hz[抗体的名称]。为避免疑问，在以下说明书中，表述“IGF-1R抗体”和“[抗体的名称]”是相似的，且包括(无相反说明)鼠、嵌合和人源化形式的所述IGF-1R抗体和所述“[抗体的名称]”。当需要的时候，使用前缀m-(鼠)、c-(嵌合)或hz-(人源化)。在另一个实施方案中，本发明的抗体选自：a)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR和序列SEQIDNo.9、5和11所示的三个轻链CDR；b)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR和序列SEQIDNo.10、5和11所示的三个轻链CDR；c)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR和序列SEQIDNo.9、5和12所示的三个轻链CDR；以及d)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.8、2和3所示的三个重链CDR和序列SEQIDNo.9、5和11所示的三个轻链CDR。为了更清楚，下表2示出优选抗体根据IMGT定义的CDR序列。表2这对于本领域技术人员将是显而易见的，即如上所述的6个CDR的任何组合应被认为是本发明的一部分。如可以从这个表2观察到的，在表中描述的所有抗体具有相同的CDR-H2、CDR-H3和CDR-L2的序列，如上所述，这个特性是尤其感兴趣的。一个具体方面涉及鼠(m)抗体、或任何抗原结合片段，特征在于所述抗体还包含衍生自与鼠异源的物种(尤其是人)的抗体的轻链和重链恒定区。另一个具体方面涉及嵌合(c)抗体、或任何抗原结合片段，特征在于所述抗体还包含衍生自与鼠异源的物种(尤其是人)的抗体的轻链和重链恒定区。在本发明的一个实施方案中，所述抗体由嵌合抗体组成。嵌合抗体是一种抗体，其包含衍生自给定物种的抗体的天然可变区(轻链和重链)与异源于所述给定物种的物种的抗体轻链和重链的恒定区的组合。可以通过使用重组基因技术制备抗体或其嵌合片段。例如，可以通过克隆含有启动子和编码本发明的非人(尤其是鼠)单克隆抗体可变区的序列、及编码人抗体恒定区的序列的重组DNA来生产嵌合抗体。根据本发明的由一个此类重组基因编码的嵌合抗体可以是例如鼠-人嵌合体，衍生自鼠DNA的可变区决定这种抗体的特异性，以及衍生自人DNA的恒定区决定其同种型。在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的抗体选自：a)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.13所示的或表现出与SEQIDNo.13至少80％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.9、5和11所示的三个轻链CDR；b)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.14所示的或表现出与SEQIDNo.14至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.10、5和11所示的三个轻链CDR组成；c)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.15所示的或表现出与SEQIDNo.15至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.9、5和12所示的三个轻链CDR组成；d)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.16所示的或表现出与SEQIDNo.16至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.9、5和11所示的三个轻链CDR组成；以及e)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.17所示的或表现出与SEQIDNo.17至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.9、5和12所示的三个轻链CDR组成。“表现出与SEQIDNO.13至17至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的任何序列”，其分别指代表现三个重链CDRSEQIDNO.1、2和3的序列，以及此外与对应于CDR的序列(即SEQIDNO.1、2和3)以外的全长序列SEQIDNO.13至17表现出至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的序列，其中“对应于CDR的序列以外”指“除了对应于CDR的序列以外”。在另一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的抗体选自：a)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.18所示的或表现出与SEQIDNo.18至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域，以及序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR；b)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.19所示的或表现出与SEQIDNo.19至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域，以及序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR；c)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.20所示的或表现出与SEQIDNo.20至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域，以及序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR；d)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.21所示的或表现出与SEQIDNo.21至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域，以及序列SEQIDNo.8、2和3所示的三个重链CDR；以及e)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.22所示的或表现出与SEQIDNo.22至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域，以及序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR。“表现出与SEQIDNO.18至22至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的任何序列”，其指代表现三个轻链CDRSEQIDNO.4、5和6的序列，以及此外与对应于CDR的序列(即SEQIDNO.4、5和6)以外的全长序列SEQIDNO.18至22表现出至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的序列。本发明的一个实施方案涉及一种抗体，其选自：a)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.13所示的或表现出与SEQIDNo.13至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.18所示的或表现出与SEQIDNo.18至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域；b)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.14所示的或表现出与SEQIDNo.14至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.19所示的或表现出与SEQIDNo.19至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域；c)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.15所示的或表现出与SEQIDNo.15至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.20所示的或表现出与SEQIDNo.20至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域；d)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.16所示的或表现出与SEQIDNo.16至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.21所示的或表现出与SEQIDNo.21至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域；以及e)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.17所示的或表现出与SEQIDNo.17至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.22所示的或表现出与SEQIDNo.22至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域。在此描述的嵌合抗体还可以由恒定结构域表征，以及更具体地，所述嵌合抗体能够被选择或设计，比如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgD或IgE。更优选地，在本发明的内容中，所述嵌合抗体是IgG1或IgG4。本发明的一个实施方案涉及一种嵌合抗体，其包含IgG1形式的上述可变结构域VH和VL。更优选地，所述嵌合抗体包含序列SEQIDNo.43所示的VH恒定结构域以及序列SEQIDNo.45所示的VL的κ结构域。本发明的一个实施方案涉及一种嵌合抗体，其包含IgG4形式的上述可变结构域VH和VL。更优选地，所述嵌合抗体包含序列SEQIDNo.44所示的VH恒定结构域以及序列SEQIDNo.45所示的VL的κ结构域。在另一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的抗体选自：a)一种抗体，其包含或者由序列SEQIDNo.23所示的或表现出与SEQIDNo.23至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及序列SEQIDNo.28所示的或表现出与SEQIDNo.28至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链组成；b)一种抗体，其包含或者由序列SEQIDNo.24所示的或表现出与SEQIDNo.24至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及序列SEQIDNo.29所示的或表现出与SEQIDNo.29至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链组成；c)一种抗体，其包含或者由序列SEQIDNo.25所示的或表现出与SEQIDNo.25至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及序列SEQIDNo.30所示的或表现出与SEQIDNo.30至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链组成；d)一种抗体，其包含或者由序列SEQIDNo.26所示的或表现出与SEQIDNo.26至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及序列SEQIDNo.31所示的或表现出与SEQIDNo.31至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链组成；以及e)一种抗体，其包含或者由序列SEQIDNo.27所示的或表现出与SEQIDNo.27至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及序列SEQIDNo.32所示的或表现出与SEQIDNo.32至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链组成。为了更清楚，下表3分别示出优选嵌合抗体的VH和VL的序列。表3本发明的另一个具体的方面涉及一种人源化抗体、或其抗原结合片段，特征在于衍生自人抗体的轻链和重链的恒定区分别是λ或κ区和γ-1、γ-2或γ-4区。在本发明的一个实施方案中，抗体由人源化抗体组成。“人源化抗体”意思是含有衍生自非人来源的抗体的CDR区的抗体，所述抗体分子的其它部分衍生自一个(或几个)人抗体。此外，一些骨架区段残基(称作FR)可被修饰以保持结合亲和力。人源化抗体或其片段能够通过本领域技术人员已知的技术制备。优选将此类人源化抗体用于涉及体外诊断或体内预防和/或治疗性治疗的方法。本领域技术人员还知道的其它人源化技术如，例如，PDL在专利EP0451216、EP0682040、EP0939127、EP0566647或US5,530,101、US6,180,370、US5,585,089和US5,693,761中所述的“CDR接枝”技术。还能引用美国专利5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293。作为本发明的具体的实施方案，以及如在以下实施例中将更详细解释的，在此描述了一种由hz208F2组成的抗体。这样的人源化还能够被应用到本发明的其它抗体部分。在一个优选的实施方案中，根据本发明的抗体包含重链可变结构域(VH)，其具有：i)分别由序列SEQIDNo.7、2和3所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，ii)衍生自人种系IGHV1-46*01的FR1、FR2和FR3(SEQIDNo.46)，和iii)衍生自人种系IGHJ4*01的FR4(SEQIDNo.48)。在一个优选的实施方案中，根据本发明的抗体包含轻链可变结构域(VL)，其具有：i)分别由序列SEQIDNo.9、5和11所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，ii)衍生自人种系IGKV1-39*01的FR1、FR2和FR3(SEQIDNo.47)，以及iii)衍生自人种系IGKJ4*01的FR4(SEQIDNo.49)。在本发明的一个优选的但非限制性的实施方案中，所述抗体包含：a)重链，其具有分别由序列SEQIDNo.7、2和3所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，和衍生自人种系IGHV1-46*01的FR1、FR2和FR3(SEQIDNo.46)，以及衍生自人种系IGHJ4*01的FR4(SEQIDNo.48)；以及b)轻链，其具有分别由序列SEQIDNo.9、5和11所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和衍生自人种系IGKV1-39*01的FR1、FR2和FR3(SEQIDNo.47)，以及衍生自人种系IGKJ4*01的FR4(SEQIDNo.49)。在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含序列SEQIDNo.33所示的重链可变结构域(VH)和序列SEQIDNo.35所示的轻链可变结构域(VL)。所述人源化抗体在后文将称为hz208F2(“变体”或“Var.”1)。在另一个实施方案中，根据本发明的抗体包含序列SEQIDNo.33所示的重链可变结构域(VH)，其中所述序列SEQIDNo.33包含至少一个选自残基20、34、35、38、48、50、59、61、62、70、72、74、76、77、79、82和95的回复突变。表述“回复突变”意思是存在于种系中的人残基被初始存在于鼠序列中对应的残基突变或取代。在另一个实施方案中，根据本发明的抗体包含序列SEQIDNo.33所示的重链可变结构域(VH)，其中所述序列SEQIDNo.33包含选自残基20、34、35、38、48、50、59、61、62、70、72、74、76、77、79、82和95的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个回复突变。为了更清楚，下表4示出了优选的回复突变。表4在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含序列SEQIDNo.35所示的轻链可变结构域(VL)，其中所述序列SEQIDNo.35包含至少一个选自残基22、53、55、65、71、72、77和87的回复突变。在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含序列SEQIDNo.35所示的轻链可变结构域(VL)，其中所述序列SEQIDNo.35包含选自残基22、53、55、65、71、72、77和87的2、3、4、5、6、7或8个回复突变。在另一个实施方案中，根据本发明的抗体包含：a)序列SEQIDNo.33所示的重链可变结构域(VH)，其中所述序列SEQIDNo.33包含至少一个选自残基20、34、35、38、48、50、59、61、62、70、72、74、76、77、79、82和95的回复突变；以及b)序列SEQIDNo.35所示的轻链可变结构域(VL)，其中所述序列SEQIDNo.35包含至少一个选自残基22、53、55、65、71、72、77和87的回复突变。为了更清楚，下表5示出优选的回复突变。表5氨基酸N°2253556571727787鼠SRHRYSNF人TSQSFTSY在这样的实施方案中，根据本发明的抗体包含所有上述的回复突变，对应于包含序列SEQIDNo.34所示的重链可变结构域(VH)和序列SEQIDNo.36所示的轻链可变结构域(VL)的抗体。所述人源化抗体在后文将称为hz208F2(“变体”或“Var.”3)。在另一个实施方案中，包含变体1至变体3的所有的人源化形式也包含在本发明中。换言之，根据本发明的抗体对应于包含“一致性”序列SEQIDNo.41所示的重链可变结构域(VH)和“一致性”序列SEQIDNo.42所示的轻链可变结构域(VL)的抗体。总体上，所述人源化抗体在后文将称为hz208F2(“变体”或“Var.”2)。在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的抗体选自：a)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.33所示的或表现出与SEQIDNo.33至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.9、5和11所示的三个轻链CDR；b)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.34所示的或表现出与SEQIDNo.34至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.9、5和11所示的三个轻链CDR；以及c)一种抗体，其包含选自序列SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80所示的或具有与SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域；以及序列SEQIDNo.9、5和11所示的三个轻链CDR。“表现出与SEQIDNo.33、34、56、62、64、66、68、70、72、74、76、78或80至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的任何序列”，其指代表现出三个重链CDRSEQIDNO.1、2和3的序列，以及此外与对应于CDR的序列(即SEQIDNO.1、2和3)以外的全长序列SEQIDNO.33、34、56、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80表现出至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的序列。在一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的抗体选自：a)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.35所示的或表现出与SEQIDNo.35至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域，以及序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR；以及b)一种抗体，其包含序列SEQIDNo.36所示的或表现出与SEQIDNo.36至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域，以及序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR；以及c)一种抗体，其包含选自SEQIDNo.57和60的序列所示的或具有与SEQIDNo.57或60至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域，以及序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR。“表现出与SEQIDNo.35、36、57或60至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的任何序列”，其指代表现出三个轻链CDRSEQIDNO.4、5和6的序列，以及此外与对应于CDR的序列(即SEQIDNO.4、5和6)以外的全长序列SEQIDNO.35、36、57或60表现出至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的序列。在此描述的人源化抗体还可以由恒定结构域表征，以及更具体地，所述人源化抗体能够被选择或设计，比如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgD或IgE。更优选地，在本发明的内容中，所述人源化抗体是IgG1或IgG4。本发明的一个实施方案涉及一种人源化抗体，其包含IgG1形式的上述可变结构域VH和VL。更优选地，所述人源化抗体包含序列SEQIDNo.43所示的VH恒定结构域以及序列SEQIDNo.45所示的VL的κ结构域。本发明的一个实施方案涉及一种人源化抗体，其包含IgG4形式的上述可变结构域VH和VL。更优选地，所述人源化抗体包含序列SEQIDNo.44所示的VH恒定结构域以及序列SEQIDNo.45所示的VL的κ结构域。在本发明的另一个实施方案涉及一种抗体选自：a)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.37所示的或表现出与SEQIDNo.37至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.39所示的或表现出与SEQIDNo.39至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；b)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.38所示或表现出与SEQIDNo.38至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.40所示的或表现出与SEQIDNo.40至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；以及c)一种抗体，其包含选自SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列所示的或具有与SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78或80至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及选自SEQIDNo.57、60的序列所示的或具有与SEQIDNo.57或60至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域。为了更清楚，下表6a示出了人源化抗体hz208F2的变体1(Var.1)和变体3(Var.3)的VH和VL的序列的非限制性示例。还包含变体2(Var.2)的一致性序列。表6a在另一个优选的但非限制性的实施方案中，本发明的抗体选自：a)一种抗体，其包含选自SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列所示的或具有与SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78或80至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域；以及序列SEQIDNo.9、5和11所示的三个轻链CDR；b)一种抗体，其包含选自SEQIDNo.57和60的序列所示的或具有与SEQIDNo.57或60至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域；以及序列SEQIDNo.7、2和3所示的三个重链CDR；以及c)一种抗体，其包含选自SEQIDNo.57和60的序列所示的或具有与SEQIDNo.57或60至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域；以及选自SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列所示的或具有与SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78或80至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域。本发明的另一个实施方案涉及一种抗体，其选自包含以下或由以下组成的抗体：a)选自SEQIDNo.58、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81的序列所示的或具有与SEQIDNo.58、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链；以及b)选自SEQIDNo.59和61的序列所示的或具有与SEQIDNo.59或61至少80％，优选85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链。本发明的另一个实施方案涉及一种抗体，其选自：a)一种抗体，其包含选自SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列所示的或表现出与SEQIDNo.56、62、64、66、68、70、72、74、76、78或80至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域；以及序列SEQIDNo.57所示的或表现出与SEQIDNo.57至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链可变结构域；以及b)一种抗体，其包含选自SEQIDNo.56、64、68和78的序列所示的或表现出与SEQIDNo.56、64、68或78至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链可变结构域，以及序列SEQIDNo.60所示的或表现出与SEQIDNo.60至少80％同一性的任何序列的轻链可变结构域。本发明的另一个实施方案涉及一种抗体，其选自：a)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.58所示的或表现出与SEQIDNo.58至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；b)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.58所示的或表现出与SEQIDNo.58至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及序列SEQIDNo.61所示的或表现出与SEQIDNo.61至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的轻链组成；c)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.63所示的或表现出与SEQIDNo.63至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；d)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.65所示的或表现出与SEQIDNo.65至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；e)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.65所示的或表现出与SEQIDNo.65至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.61所示的或表现出与SEQIDNo.61至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；f)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.67所示的或表现出与SEQIDNo.67至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；g)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.69所示的或表现出与SEQIDNo.69至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；h)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.69所示的或表现出与SEQIDNo.69至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.61所示的或表现出与SEQIDNo.61至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；i)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.71所示的或表现出与SEQIDNo.71至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；j)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.73所示的或表现出与SEQIDNo.73至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；k)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.75所示的或表现出与SEQIDNo.75至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；l)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.77所示的或表现出与SEQIDNo.77至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；m)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.79所示的或表现出与SEQIDNo.79至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；n)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.79所示的或表现出与SEQIDNo.79至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.61所示的或表现出与SEQIDNo.61至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成；以及o)一种抗体，其包含、或由序列SEQIDNo.81所示的或表现出与SEQIDNo.81至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列的重链，以及包含或由序列SEQIDNo.59所示的或表现出与SEQIDNo.59至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的任何序列组成的轻链组成。为了更清楚，下表6b示出了人源化抗体hz208F2不同变体的VH和VL的序列(可变结构域和全长)的非限制性示例。表6b本发明的另一方面是一种抗体，其选自：i)由杂交瘤I-4757、I-4773、I-4775、I-4736或I-4774生产的抗体，分别于2013年5月30日、2013年6月26日、2013年6月26日、2013年4月24日和2013年6月26日保藏在CNCM，国家微生物保藏中心，法国，巴黎，75724，DocteurRoux路25号，巴斯德研究所，ii)与i)的抗体竞争结合IGF-1R的抗体；以及iii)与i)的抗体结合相同的IGF-1R表位的抗体。根据另一方面，本发明涉及一种鼠杂交瘤，其选自分别于2013年5月30日、2013年6月26日、2013年6月26日、2013年4月24日和2013年6月26日保藏在法国巴斯德研究所CNCM的杂交瘤I-4757、I-4773、I-4775、I-4736和I-4774。本发明的一个新的方面涉及一种分离的核酸，其编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段。在本说明书中互换使用的术语“核酸”“核序列”“核酸序列”“多核苷酸”“寡核苷酸”“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”，表示无论有无修饰的确定核酸的片段或区域的精确核苷酸序列，其含有或不含非天然核苷酸，是双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。本发明的序列已经被分离和/或纯化，即例如通过复制，它们被直接地或间接地取样，它们的环境已经至少部分改变。在此还提及了例如通过宿主细胞的基因重组的方式获得分离的核酸，或者通过化学合成获得。本发明还涉及包含编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸的载体。本发明尤其针对含有此类核苷酸序列的克隆和/或表达载体。载体优选含有在给定宿主细胞中允许核苷酸序列表达和/或分泌的元件。因而载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号、还有适当的转录调控区。它必须能够在宿主细胞中以稳定的方式维持，并且任选地具有指导翻译蛋白分泌的特异信号。根据所用的宿主细胞，本领域技术人员能选择和优化这些不同元件。为此目的，核苷酸序列能被插入至所选宿主内的自主复制载体，或者是所选宿主的整合载体。此类载体以本领域技术人员通常使用的方法制备，而且产生的克隆能以如脂质转染、电穿孔、热激或化学方法的标准方法引入至适当的宿主。载体是(例如)质粒或病毒来源的载体。它们被用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的核苷酸序列。本发明还涉及转化有或包含上述载体的分离的宿主细胞。宿主细胞能选自原核或真核系统，如细菌细胞例如，还有酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞(除了人)。还能使用昆虫或植物细胞。本发明还涉及具有转化细胞的动物(除了人)。另一方面涉及用于生产根据本发明的抗体、或其抗原结合片段的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：a)在介质中及在适当培养条件下培养根据本发明所述的宿主细胞；及b)从培养介质或从所述培养的细胞中回收因此生产的抗体、或其抗原结合片段之一。转化细胞可用于制备根据本发明的重组抗体的方法。用于制备重组形式的抗体的方法也包括在本说明书中，其使用根据本发明的载体和/或转化有根据发明的载体的细胞。优选地，转化有上述的载体的细胞在允许前述抗体得以表达和所述抗体得以回收的条件下培养。如已提及的，宿主细胞能选自原核或真核系统。尤其是，可能鉴定有利于在此原核或真核系统中分泌的核苷酸序列。携带这样序列的根据本发明的载体因此能有利地用于生产待分泌的重组蛋白。事实上，蛋白在细胞培养物上清中而非在宿主细胞内存在的事实将有利于这些兴趣重组蛋白的纯化。抗体还能通过化学合成制备。一种此类制备方法也是本发明的目的。本领域技术人员知道用于化学合成的方法，如通过浓缩片段或通过溶液中传统合成的固相技术或部分固相技术。发明也包括通过化学合成获得并能够包含相应非天然氨基酸的多肽。本发明还包括通过上述方法可能获得的抗体或其任何抗原结合片段。根据一个具体的方面，本发明涉及上述的抗体或其抗原结合片段，用作将细胞毒性剂递送至宿主靶标位点的定位载体，所述宿主靶标位点由定位于IGF-1R中的表位组成，优选IGF-1R细胞外结构域，更优选人IGF-1R(SEQIDNo.50)，和仍更优选人IGF-1R细胞外结构域(SEQIDNo.51)，以及仍然更优选人IGF-1R细胞外结构域的N末端(SEQIDNo.52)，或其任何天然的变体序列。在优选的实施方案中，所述宿主靶标位点是哺乳动物细胞的靶标位点，更优选人细胞，更优选天然或通过基因重组的方式表达IGF-1R的细胞。本发明的另一方面是一种抗体-药物缀合物，其包含与细胞毒性剂缀合的上述抗体或其抗原结合片段。本发明涉及免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂缀合的本说明书中描述的抗体。表述“免疫缀合物”或“免疫-缀合物”一般指包含至少一个定位产品比如抗体的化合物，定位产品与一种或多种治疗剂物理连接，从而创建高度靶向的化合物。在一个优选实施方案中，这样的治疗剂由细胞毒性剂组成。“细胞毒性剂”或“细胞毒素”，是指这样的试剂，当施用至受试者时，其通过抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡，来治疗或预防异常细胞增殖的发展，优选受试者身体中的癌症发展。许多细胞毒性剂已被分离或合成，并使其能够抑制细胞的增殖，或(如未明确)至少显著破坏或减少肿瘤细胞。然而，这些试剂的毒性活性并不仅限于肿瘤细胞，非肿瘤细胞也受影响并且可以被破坏。更具体地，在快速更新的细胞中，如造血细胞或上皮细胞，尤其是粘膜中观察到副作用。通过举例说明的方式，通过使用这样的细胞毒性剂，胃肠道的细胞很受影响。本发明的目的之一还能够提供一种细胞毒性剂，这使得可以限制对正常细胞的副作用，而同时保留对肿瘤细胞的高细胞毒性。更具体地，细胞毒性剂可优选由如下组成，但不限于药物(即“抗体-药物缀合物”)、毒素(即“免疫毒素”或“抗体毒素缀合物”)、放射性同位素(即“放射免疫缀合物”或“抗体放射性同位素缀合物”)等。第一优选实施方案中，免疫缀合物由连接于至少一种药物或药品的抗体组成。这样的免疫缀合物被称为抗体-药物缀合物(或“ADC”)。在第一实施方案中，可以根据其作用模式描述这样的药物。作为非限制性示例，可以提及烷化剂(如氮芥、烃基磺酸盐、亚硝基脲、oxazophorin、氮丙啶或乙撑亚胺)、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、螯合剂、铁吸收刺激剂、环氧合酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、DNA抑制剂、DNA合成抑制剂、凋亡刺激剂、胸苷酸抑制剂、T细胞抑制剂、干扰素激动剂、核糖核苷三磷酸还原酶抑制剂、芳香酶抑制剂、雌激素受体拮抗剂、酪氨酸激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、紫杉烷、微管蛋白抑制剂、血管生成抑制剂、巨噬细胞刺激剂、神经激肽受体拮抗剂、大麻素受体激动剂、多巴胺受体激动剂、粒细胞刺激因子激动剂、促红细胞生成素受体激动剂、促生长素抑制素受体激动剂、LHRH激动剂、钙增敏剂、VEGF受体拮抗剂、白细胞介素受体拮抗剂、破骨细胞抑制剂、自由基形成刺激剂、内皮素受体拮抗剂、长春花生物碱、抗激素或免疫调节剂或任何其它满足细胞毒素或毒素活性标准的新药物。例如VIDAL2010在关于附着至癌症学和血液学栏“细胞毒素”的化合物的页中引用了这种药物，参考这一文件引用的这些细胞毒性化合物在此处引作优选细胞毒性剂。更具体地，但不限于，根据本发明优选以下药物或药品：二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥(chlorambucol)、美法仑、氢氯化物(chlorydrate)、哌泊溴烷(pipobromen)、泼尼莫司汀(prednimustin)、焦亚(disodic)-磷酸盐、雌氮芥、环磷酰胺、六甲蜜胺(altretamine)、曲洛磷胺、硫代异环磷酰胺(sulfofosfamide)、异环磷酰胺、塞替派、三乙胺、altetramine、卡莫司汀、链脲霉素、佛替姆丁、洛莫司汀、白消安、曲奥舒凡(treosulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、达卡巴嗪、顺铂、奥沙利铂、洛铂、庚铂(heptaplatin)、米铂(miriplatin)水合物、卡铂、甲氨蝶呤、培美曲塞、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、奈拉滨、6-巯鸟嘌呤(6-TG)、氯脱氧腺苷、5-氮胞苷、吉西他滨(gemcitabine)、克拉屈滨(cladribine)、脱氧柯福霉素、替加氟、喷司他汀、阿霉素、道诺霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌、更生霉素、光辉霉素、普卡霉素、丝裂霉素C、博来霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、多烯紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、托泊替康、伊立替康、依托泊苷、戊柔比星、盐酸氨柔比星、吡柔比星、依利醋铵、佐柔比星、表柔比星、伊达比星和替尼泊苷、雷佐生、马立马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、卤夫酮、COL-3、新伐司他、沙立度胺、CDC501、DMXAA、L-651582、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、干扰素-α、EMD121974、白介素-12、IM862、血管生成抑制因子、他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、氟他胺、尼鲁米特、安体舒通、醋酸环丙孕酮、非那雄胺、西米替丁、硼替佐米、万珂、比卡鲁胺、环丙孕酮、氟他胺、氟维司群(fulvestran)、依西美坦、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、尼洛替尼、索拉非尼、舒尼替尼、类视黄醇、rexinoid、methoxsalene、氨基酮戊酸甲酯、aldesleukine、OCT-43、地尼白介素(denileukindiflitox)、白介素-2、他索纳明(tasonermine)、香菇多糖、西佐喃、罗喹美克、匹多莫德、培加酶、刹莫潘汀(thymopentine)、聚I：C、procodazol、TicBCG、短棒状杆菌制剂(corynebacteriumparvum)、NOV-002、ukrain、左旋咪唑、1311-chTNT、H-101、西莫白介素、干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素γ1a、白介素-2、莫贝白介素、Rexin-G、替西白介素、阿克拉霉素、放线菌素、arglabin、门冬酰胺酶、carzinophilin、色霉素、道诺霉素、亚叶酸、马索罗酚、新制癌菌素、培洛霉素、肉瘤霉素、茄边碱、曲贝替定、链佐星、睾酮、库内儿茶素、sinecatechins、阿利维A酸、贝洛替康盐酸化合物、卡普睾酮、屈他雄酮、依利醋铵、乙炔雌二醇、依托泊苷、氟甲睾酮、福美坦、fosfetrol、醋酸戈舍瑞林、己基氨基乙酰丙酸、组氨瑞林、羟孕酮、伊沙匹隆、亮丙瑞林、甲羟孕酮醋酸酯、甲地孕酮醋酸酯、甲泼尼龙、甲基睾酮、米替福新、二溴甘露醇、苯丙酸诺龙、醋酸炔诺酮、泼尼松龙、泼尼松、替西罗莫司、睾内酯、氟羟氢化泼尼松、曲普瑞林、醋酸伐普肽、净司他丁斯酯、安吖啶、三氧化二砷、盐酸比生群、苯丁酸氮芥、三对甲氧苯乙烯(chlortrianisene)、顺二氨二氯铂、环磷酰胺、己烯雌酚、六甲蜜胺、羟基脲、来那度胺、氯尼达明、mechlorethanamine、米托坦、奈达铂、盐酸尼莫司汀、帕米膦酸、哌泊溴烷、卟吩姆钠、雷莫司汀、雷佐生、司莫司汀、索布佐生、甲磺酸盐、三乙撑蜜胺、唑来膦酸、甲磺酸卡莫司他、法倔唑HCl、萘福昔定、氨鲁米特、卡莫氟、氯法拉滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、地西他滨、去氧氟尿苷、依诺他滨、fludarabnephosphate、氟尿嘧啶、替加氟、尿嘧啶氮芥、阿巴瑞克、贝沙罗汀、raltiterxed、他米巴罗汀、替莫唑胺、伏立诺他、甲地孕酮、氯膦酸盐二钠、左旋咪唑、纳米氧化铁、异麦芽糖铁(ironisomaltoside)、塞来昔布、异丁司特、苯达莫司汀、六甲蜜胺、二溴卫矛醇、西罗莫司、普拉曲沙、TS-1、地西他滨、比卡鲁胺、氟他胺、来曲唑、氯膦酸二钠、地加瑞克、枸橼酸托瑞米芬、组胺二盐酸盐、DW-166HC、二胺硝吖啶、地西他滨、irinoteacn盐酸化合物、安吖啶、罗米地辛、维甲酸、卡巴他赛、凡德他尼、来那度胺、伊班膦酸、米替福新、vitespen、米伐木肽、那屈肝素、格拉司琼、昂丹司琼、托烷司琼、阿立必利、雷莫司琼、甲磺酸多拉司琼、福沙吡坦酸葡胺、大麻隆、阿瑞吡坦、屈大麻酚、TY-10721、马来酸氢麦角乙脲、epiceram、去纤苷、达比加群酯、非格司亭、培非司亭、reditux、促红细胞生成素、莫拉司亭、奥普瑞白介素、sipuleucel-T、M-Vax、乙酰左旋肉碱、盐酸多奈哌齐、5-氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、醋酸西曲瑞克、艾考糊精、亮丙瑞林、metbylphenidate、奥曲肽、氨来占诺、普乐沙福、四烯甲萘醌、anetholedithiolethione、度骨化醇、盐酸西那卡塞、阿法赛特、咯咪珀咯、甲状腺球蛋白、胸腺法新、乌苯美司、咪喹莫特、依维莫司、西罗莫司、H-101、拉索昔芬、曲洛司坦、英卡膦酸、神经节苷脂、哌加他尼钠、vertoporfin、米诺膦酸、唑来膦酸、硝酸镓、阿仑磷酸钠、依替膦酸二钠、帕米膦酸二钠、度他雄胺、葡萄糖酸锑钠、阿莫达非尼、右雷佐生、氨磷汀、WF-10、替莫卟吩、达贝泊汀α、安西司亭、沙格司亭、帕利夫明、R-744、奈匹德明、奥普瑞白介素、denileukindiftitox、克立他酶(crisantaspase)、布舍瑞林、德舍瑞林、兰瑞肽、奥曲肽、毛果芸香碱、波生坦、卡奇霉素、美登素、环烟酯和吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepines)，尤其是以号WO2011/130598公布的PCT申请中公开的那些。在另一个实施方案中，免疫缀合物由连接至至少一种放射性同位素的抗体组成。这种免疫缀合物称为抗体-放射性同位素缀合物(或“ARC”)。为了选择性破坏肿瘤，抗体可以包括高度放射活性的原子。各种放射活性同位素可用于生产ARC，比如但不限于At211、C13、N15、O17、Fl19、I123、I131、I125、In111、Y90、Re186、Re188、Sm153、tc99m、Bi212、P32、Pb212，Lu、钆、锰或铁的放射活性同位素。本领域技术人员已知的任何方法或过程可用于将这种放射性同位素并入ARC。作为非限制性示例，tc99m或I123、Re186、Re188和In111可通过半胱氨酸残基附着。Y90可通过赖氨酸残基附着。I123可使用IODOGEN方法附着。可以提到多种示例来说明ARC领域技术人员的常识，ARC例如其是一种由抗CD20单克隆抗体和通过硫脲接头螯合剂结合的In111或Y90放射性同位素组成的ARC；或其由连接至卡里奇霉素的抗CD33抗体组成(US4,970,198；5,079,233；5,585,089；5,606,040；5,693,762；5,739,116；5,767,285；5,773,001)。最近，还可以提及称为Adcetris的ADC(对应于Brentuximabvedotin)，其近期已被FDA接受用于治疗霍奇金氏淋巴瘤。在另一个实施方案中，免疫缀合物由连接至至少一种毒素的抗体组成。这种免疫缀合物称为抗体-毒素缀合物(或“ATC”)。毒素是由活的生物产生的有效和特定的毒物。它们通常由氨基酸链组成，所述氨基酸链在分子量方面可以变化，在几百(肽)和十万(蛋白)之间。它们也可以是低分子的有机化合物。毒素由许多生物产生，如细菌、真菌、藻和植物。它们中许多是非常有毒的，具有比神经剂强几个数量级的毒性。用于ATC的毒素可以包括但不限于所有种类的毒素，其可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制表现其细胞毒作用。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒蛋白(sarcin)、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯(tricothecene)。此处也可考虑小分子毒素，如多拉司他汀、auristatin，尤其是单甲基auristatinE(MMAE)、单端孢霉烯和CC1065，和具有毒素活性的这些毒素的衍生物。已显示多拉司他汀和auristatin干扰微管动力、GTP水解、以及核和细胞分裂并具有抗癌和抗真菌活性。“接头”、“接头单元”或“链接”指包含共价键或原子链的化学部分，共价键或原子链将抗体共价附着至至少一种细胞毒性剂。使用多种双功能蛋白偶联剂可以制备接头，双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨二甲酯HCl)、活性酯(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种将细胞毒性剂缀合至定位系统的示例性螯合剂。其它交联接头试剂可以是BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其可以市售获得(例如，来自美国Rockford,I11的PierceBiotechnology,Inc.)。接头可以是“不可切割的”或“可切割的”。在优选的实施方案中，它包括“可切割的接头”以利于细胞毒性剂在细胞内释放。例如，可使用酸不稳定的接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头。在优选的实施方案中，在细胞内条件下接头是可切割的，从而在细胞内环境中切割接头从抗体释放细胞毒性剂。例如，在一些实施方案中，通过存在于细胞内环境中(例如，溶酶体或胞内体或细胞膜穴样内陷(caveolea)之内)的切割剂，接头是可切割的。接头可以是例如肽基接头，其被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不局限于溶酶体或胞内体蛋白酶)切割。典型地，肽基接头是至少2个氨基酸长，或至少3个氨基酸长。切割剂可包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，所有这些都已知水解二肽药物衍生物，导致活性药物在靶细胞内释放。例如，可以使用可被癌组织中高度表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B切割的肽基接头(如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly接头)。在具体实施方案中，可被细胞内蛋白酶切割的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头。使用细胞内蛋白水解释放细胞毒性剂的一个优点是，当经过缀合时所述试剂通常是减毒，而且缀合物的血清稳定性通常较高。在其它实施方案中，可切割接头是pH敏感的，即对一定pH值下的水解敏感。通常，在酸性条件下pH敏感的接头是可水解的。例如，可使用在溶酶体中可被水解的酸不稳定接头(如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)。在中性pH条件下这样的接头相对稳定，如在血液中的那些，但在pH5.5或5.0以下(近似溶酶体的pH)不稳定。在某些实施方案中，可水解的接头是硫醚接头(如，例如通过酰腙键附着至治疗剂的硫醚)。在又一些其它实施方案中，接头在还原条件下可切割(如，二硫键接头)。各种二硫化物接头是本领域已知的，包括例如可使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些。作为不可切割的或“不可还原的”接头的非限制性示例，可以提及免疫缀合物曲妥珠单抗-DM1(TDM1)，其将曲妥珠单抗与连接的化疗剂美登素组合。在一个优选的实施方案中，本发明的免疫缀合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法来制备，例如但不限于i)抗体的亲核基团与二价接头试剂反应，然后与细胞毒性剂反应或ii)细胞毒性剂的亲核基团与二价接头试剂反应，然后与抗体的亲核基团反应。当抗原结合蛋白被糖基化时，抗体上的亲核基团包括但不限于N-末端氨基、侧链氨基例如赖氨酸、侧链硫醇基团以及糖的羟基或氨基。胺、硫醇和羟基是亲核的，并且能够与接头部分上的亲电基团反应形成共价键，接头试剂包括但不限于活性酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；烷基和苄基卤化物如卤代乙酰胺；醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。抗体可具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理，可以使抗体具有反应性，而与接头试剂缀合。因此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。通过本领域技术人员已知的任何反应，附加的亲核基团可被引入到抗体。作为非限制性的示例，可通过引入一个或多个半胱氨酸残基，将反应性硫醇基团引入抗体。也可以通过修饰抗体引入亲电部分从而产生免疫缀合物，亲电部分可以与接头试剂或细胞毒性剂的亲核取代基反应。糖基化的抗体的糖可以被氧化而形成醛或酮基团，其可以与接头试剂或细胞毒性剂的氨基反应。所得亚胺Schiff碱基团可形成稳定的键合，或者可以被还原而形成稳定的胺键合。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或高碘酸钠反应可产生抗体中的羰基(醛和酮)，其中羰基可以与药物上的适当基团反应。在另一个实施方案中，含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可与高碘酸钠反应，导致产生代替第一个氨基酸的醛。在某些优选的实施方案中，接头单元可具有以下通式：--Ta--Ww--Yy--其中：-T-是延伸(stretcher)单元；a为0或1；-W-是氨基酸单元；w独立地是从1到12的整数；-Y-是间隔单元；y为0、1或2。延伸单元(-T-)存在时，将抗体连接至氨基酸单元(-W-)。可存在于抗体的有用官能团，无论是天然的还是经化学处理，包括巯基、氨基、羟基、碳水化合物的异头羟基、和羧基。合适的官能团是巯基和氨基。如果存在的话，可通过还原抗体的分子内二硫键来生成巯基。或者，可通过抗体的赖氨酸部分的氨基与2-亚氨基硫烷或其它巯基生成试剂反应来产生巯基。在具体实施方案中，抗体是重组抗体，并且经工程化改造以携带一个或多个赖氨酸。更优选地，抗体可经工程化改造以携带一个或多个半胱氨酸(参考ThioMabs)。在某些具体实施方案中，延伸单元与抗体的硫原子形成键。硫原子可以衍生自还原的抗体的巯基(-SH)基团。在某些其它具体实施方案中，延伸单元经由抗体的硫原子与延伸单元的硫原子之间的二硫键连接至抗体。在其它具体实施方案中，延伸物的反应基团包含可以和抗体的氨基进行反应的反应性位点。氨基可以是精氨酸或赖氨酸的氨基。合适的胺反应性位点，包括但不限于活性酯，例如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯酯、酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在又一个方面中，延伸物的反应性官能团包含可以和存在于抗体上的修饰碳水化合物基团进行反应的反应位点。在一个具体实施方案中，抗体经酶促糖基化以提供碳水化合物部分。可用试剂如高碘酸钠轻度氧化碳水化合物，得到的氧化碳水化合物的羰基单元可以和含有官能团(比如肼、肟、反应性胺、肼、氨基硫脲、肼羧酸酯，或芳基酰肼)的延伸物缩合。如果间隔单元存在的话，氨基酸单元(-W-)将延伸单元(-T-)连接到间隔单元(-Y-)，如果间隔单元不存在的话，氨基酸单元(-W-)将延伸单元连接到细胞毒性剂。如前所述，-Ww-可以是二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。在一些实施方案中，氨基酸单元可包含氨基酸残基，例如但不限于被乙酰基或甲酰基保护的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、赖氨酸，精氨酸，被甲苯磺酰基或硝基保护的精氨酸，组氨酸，鸟氨酸，被乙酰基或甲酰基保护的鸟氨酸，以及瓜氨酸。示例性氨基酸接头成分优选包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：Val-Cit、Ala-Val、Ala-Ala、Val-Ala、Lys-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Phe、Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg。示例性三肽包括：Val-Ala-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Phe-Phe-Lys、Gly-Gly-Gly、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys。示例性四肽包括：Gly-Phe-Leu-Gly(SEQIDNO.53)、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQIDNO.54)。示例性五肽包括：Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQIDNO.55)。包含氨基酸接头成分的氨基酸残基包括那些天然存在的、以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可设计并优化氨基酸接头成分对特定酶的酶切割选择性，例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、或纤溶酶蛋白酶。接头的氨基酸单元可以被酶(包括但不限于肿瘤相关蛋白酶)酶促切割以释放细胞毒性剂。可以设计并优化氨基酸单元对特定肿瘤相关蛋白酶的酶切割选择性。合适的单元是其切割被蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、和纤溶酶所催化的那些。当存在间隔单元(-Y-)时，其将氨基酸单元连接至细胞毒性剂。间隔单元一般有两种类型：自身去除型(self-immolative)和非自身去除型(nonself-immolative)。非自身去除型间隔单元是这样的间隔单元，其中氨基酸单元从免疫缀合物经酶切割之后，部分或所有间隔单元保持与细胞毒性剂的结合。非自身去除型间隔单元的示例包括但不限于(甘氨酸-甘氨酸)间隔单元和甘氨酸间隔单元。为了释放细胞毒性剂，在靶细胞内应采取独立的水解反应，以切割甘氨酸-药物单元的键。在另一个实施方案中，非自身去除型间隔单元(-Y-)是-Gly-。在一个实施方案中，免疫缀合物缺少间隔单元(y＝0)。或者，含有自身去除型间隔单元的免疫缀合物可以释放细胞毒性剂，而不需要单独的水解步骤。在这些实施方案中，-Y-是通过PAB基团的氮原子连接至-Ww-的对-氨基苄醇(PAB)单元，且通过碳酸酯、氨基甲酸酯或醚基团直接连接至-D。自身去除型间隔物的其它示例包括但不限于芳香化合物，其电子上相当于PAB基团，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物和邻位或对位-氨基苄基乙缩醛。酰胺键水解时，可以使用容易发生环化的间隔物，如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统和2-氨基苯基丙酸酰胺。在一个替代实施方案中，间隔单元是分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可用于掺入附加的细胞毒性剂。药物负载也称为药物-抗体比率(DAR)，是每细胞结合试剂的平均PBD药物数量。在抗体IgG1同种型的情况中，其中在部分抗体还原之后使药物结合半胱氨酸，药物负载的范围是每份抗体1至8份药物(D)，即1、2、3、4、5、6、7和8份药物部分共价附着于抗体。在抗体IgG2同种型的情况中，其中在部分抗体还原之后使药物结合半胱氨酸，药物负载的范围是每份抗体1至12份药物(D)，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12份药物部分共价附着于抗体。ADC的成分包括与范围从1至8或从1至12份的药物缀合的细胞结合试剂(例如抗体)的集合。当药物结合赖氨酸时，药物负载的范围可能是每份抗体1至80份药物(D)，即使40、20、10或8份的上限是优选的。ADC的成分包括与范围从1至80，从1至40、从1至20、从1至10或从1至8份的药物缀合的细胞结合剂(例如抗体)的集合。来自缀合反应的ADC制剂中，每份抗体的平均药物数量可以通过常规方法表征。还可以确定药物比率方面的ADC定量分布。对于一些抗体-药物缀合物，药物比率还受抗体上的附着位点的数量限制。例如，抗体可以仅具有一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或者仅具有一个或数个接头可以附着的充分反应的硫醇基团。更高的药物负载，例如药物比率大于5，可能导致聚集、不可溶、毒性，或者某些抗体-药物缀合物的细胞渗透性的损失。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理，可以使抗体具有反应性，而与接头试剂缀合。因此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。通过赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut试剂)的反应导致胺转化为硫醇，而使额外的亲核基团引入到抗体。可通过工程化一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)，而将反应性硫醇基团引入到抗体(或其片段)中。US7521541教导了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸的工程化抗体。半胱氨酸氨基酸可以在抗体中反应位点处工程化，其不形成链内或分子间的二硫键(Junutula等人，2008bNatureBiotech.,26(8):925-932；Dornan等人(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249)。工程化半胱氨酸硫醇可以与本发明的接头试剂或药物接头试剂反应，所述接头试剂或药物接头试剂具有硫醇反应性、亲电子基团比如马来酰亚胺或α-卤代酰胺，以形成具有半胱氨酸工程化抗体和PBD药物部分的ADC。因此，药物部分的位置可被设计、控制并且是已知的。药物负载可以被控制，因为工程化半胱氨酸硫醇基团，典型地与硫醇反应性接头试剂或药物接头试剂以高产量反应。通过在重链或轻链上的单一位点的取代，使IgG抗体工程化以引入半胱氨酸氨基酸，在对称的抗体上产生两个新的半胱氨酸。可以使用缀合产品ADC的近同质性实现接近2的药物负载。此外，本发明还涉及上述免疫缀合物或抗体-药物缀合物用作药物。同样，本发明还涉及上述免疫缀合物或抗体-药物缀合物，用于治疗癌症。本发明涉及上述抗体-药物缀合物用作药物。在具体的实施方案中，本发明涉及上述抗体-药物缀合物用于治疗癌症。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及上述抗体-药物缀合物，用于治疗表达IGF-1R的癌症或IGF-1R相关的癌症。IGF-1R相关的癌症包括在它们的表面表达或过表达全部或部分IGF-1R的肿瘤细胞。更具体地，所述癌症是乳癌、结肠癌、食管癌、肝细胞癌、胃癌、神经胶质瘤、肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、横纹肌肉瘤、肾癌、甲状腺癌、子宫内膜癌和任何耐药现象。在另一方面，本发明涉及根据本发明的抗体-药物缀合物在治疗表达IGF-1R的癌症中的用途。本发明的另一主题是一种药物组合物，其包含如在说明书中描述的根据本发明的抗体或抗体-药物缀合物、或免疫缀合物。更具体地，本发明涉及一种药物组合物，其包含上述根据本发明的抗体，或抗体药物缀合物，或免疫缀合物，以及至少一种赋形剂和/或药学上可接受的载体。本发明涉及一种药物组合物，其包含上述抗体或抗体-药物缀合物，以及至少一种赋形剂和/或药学上可接受的载体。在本说明书中，表述“药学上可接受的载体”或“赋形剂”是意图表示进入药物组合物中但不引起次级反应，并且允许例如促进活性化合物的施用、提高其在体内的寿命和/或功效、增加其在溶液中的溶解度或者改善其保存的化合物或化合物的组合。这些药学上可接受的载体和赋形剂是众所周知的，并且由本领域的技术人员按照所选活性化合物的性质以及施用模式的函数进行调整。优选地，通过全身途径施用这些免疫缀合物，尤其是通过静脉内途径、通过肌内、皮内、腹膜内或皮下途径、或通过口服途径施用。在一个更优选的方式中，包含免疫缀合物的组合物将以顺序的方式被施用数次。其施用模式、剂量和最佳药物形式可以根据建立适合于患者的治疗时一般要考虑的标准(如，例如患者的年龄或体重、他/她的一般状况的严重性、治疗耐受性和所注意到的副作用)来确定。在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含上述根据本发明的抗体或的抗体-药物缀合物或免疫缀合物，以及至少一种赋形剂和/或药学上可接受的载体，用于治疗癌症。在更具体的方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含上述根据本发明的抗体，或抗体-药物缀合物或免疫缀合物，以及至少一种赋形剂和/或药学上可接受的载体，用于治疗表达IGF-1R的癌症。本发明涉及一种用于治疗受试者中癌症以及尤其是用于治疗表达IGF-1R的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的至少根据本发明抗体-药物缀合物。本发明还涉及一种用于治疗在受试者中癌症以及尤其是用于治疗表达IGF-1R的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据本发明的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及一种将药物或药品递送至受试者中表达IGF-1R的癌症细胞中的方法，其包括向所述受试者施用有效量的至少根据本发明的抗体-药物缀合物或根据本发明的药物组合物。本发明的其它特征和优点在随后说明书中用实施例和图进一步呈现，图注显示如下。附图说明图1通过抗His标签抗体捕获的hIGF-1RECD上的3种抗体获得的Biacore结合谱的示例。图2：由一组15种抗hIGF-1R单克隆抗体定义的表位绘图(mapping)方案，15种抗hIGF-1R单克隆抗体定义5个表位组。组的编号不与序列的位置和抗原的3D结构相关。图3A至3C：通过FACS分析与人天然IGF-1R结合的抗体。图3A代表在MCF-7细胞系上对于代表每个表位聚类组的一个嵌合抗IGF-1RAb的滴定曲线。MFI代表荧光强度的平均值。图3B代表鼠和嵌合抗IGF-1R抗体对MCF-7细胞系的EC50。图3C代表嵌合抗IGF-1R抗体对MCF-7细胞系的Bmax。图4A和4B：使用转染的对比未转染的细胞评估hIGF-1R识别。图4A代表在IGF-1R+细胞系上，代表每个表位聚类组的一个嵌合抗IGF-1RAb的滴定曲线。MFI代表荧光强度的平均值。图4B代表在人IGF-1R–细胞系上，代表每个表位聚类组的一个嵌合抗IGF-1RAb的结合。MFI代表荧光强度的平均值。图5A和5B：使用转染的细胞评估Ab对hIGF-1R对比hIR的特异性。图5A代表鼠抗IGF-1RAb对hIR+转染的细胞系的结合。图5B代表嵌合抗IGF-1RAb对IR+细胞系的结合。MFI代表荧光强度的平均值。在栏A和B中，已经引入了描述为GRO5(Calbiochem)的市售抗hIR抗体作为阳性对照。图6：鼠抗IGF-1RAb对IM-9细胞系的结合。MFI代表荧光强度的平均值。引入GRO5抗-hIRMab作为阳性对照。图7A、7B和7C：猴IGF-1R的识别的评估。图7A代表在COS-7细胞系上，代表每个表位聚类组的一个嵌合抗IGF-1RAb的滴定曲线。MFI代表荧光强度的平均值。图7B代表鼠和嵌合抗IGF-1R抗体对COS-7细胞系的EC50。图7C代表嵌合抗IGF-1R抗体对hIGF-1R+转染的细胞和COS-7细胞的EC50。引入GR11L(Calbiochem)作为阳性对照。图8：使用Biacore测定比较c208F2对hIGF-1RECD或食蟹猴IGF-1RECD的结合。在基于SPR技术的BiacoreX100上使用CM5传感芯片获得传感图，所述CM5传感芯片用多于11000RU的小鼠抗His标签抗体激活，所述小鼠抗His标签抗体化学接枝到羧甲基葡聚糖矩阵上。使用HBS-EP+作为运行和样本稀释缓冲液，在25℃以30μl/min的流速运行实验。该图显示了在第一次注射分析物开始时在x轴上比对的4个独立传感图的叠加，以及在刚刚在第一次注射之前定义的基线在y轴上。通过捕获基于人序列的重组可溶性IGF-1R获得的传感图用菱形标记。通过捕获基于食蟹猴的序列的重组可溶性IGF-1R获得的传感图用三角形标记。白色符号对应于空白循环(5次注射运行缓冲液)，黑色符号对应于增长范围浓度的c208F2(5、10、20、40和80nM)的注射。图9：与IGF1相比，抗hIGF-1R抗体对受体磷酸化的固有作用的评估。图10：鼠抗hIGF-1R抑制对IGF-1反应的IGF-1R磷酸化。图11：在37℃，抗IGF-1R抗体的细胞表面结合被下调。将MCF-7细胞在4℃或37℃与10μg/ml的每种Ab孵育4小时。该图代表ΔMFI。图12A和12B：抗体表面衰减。在37℃，在10、20、30、60和120min后评估细胞表面结合的抗体。图12A代表与在4℃测量的信号强度相比，剩余IGF-1R的百分比。图12B代表使用Prims软件并使用指数衰减拟合的半衰期计算。图13：通过FACS分析评估的抗体内在化动力学。将细胞与10μg/ml鼠Ab在37℃孵育0、30或60分钟。使细胞透化或不透化，并与第二抗小鼠IgG-Alexa488孵育。膜对应于无透化的信号强度。总体对应于细胞透化后的信号强度，以及细胞质对应于内在化Ab。每个评估的抗体的名称在每个图的顶部描述。图14A和14B：成像Ab内在化。图14A：在4℃，用m208F2孵育MCF-7细胞20分钟，并在37℃在孵育前洗涤[a)]、15[b)]、30[c)]和60[d)]分钟。将细胞固定并透化。使用抗鼠IgGAlexa488显示m208F2Ab，并且用兔抗Lamp-1抗体和第二抗兔IgGAlexa555显示Lamp-1。图14B(部分I至III)：在37℃，将MCF-7细胞与待测试的其它每种抗hIGF-1R鼠抗体孵育30分钟，然后如上所述染色。使用ImageJ软件的共定位高密度(highliter)插件鉴定共定位。图15：在抗体降解中涉及的溶酶体通路。图16：在不同pH下，抗hIG-1R鼠抗体的结合的评估。使用范围5至8的不同pH的缓冲液在MCF-7上评估不同抗体的结合的EC50。图17：在Fab-ZAP测定，所选抗IGF-1RAb诱导细胞毒性的能力的评估。A)将MCF-7细胞与递增浓度的嵌合抗IGF-1R抗体与人Fab-ZAP试剂盒组合孵育。使用发光细胞活力测定测量细胞活力。使用c9G4嵌合抗体作为无关抗体。B)来自A)中描述的结果的IC50。图18：i)细胞毒性效力、ii)pH对Ab/IGF-1R结合的影响、iii)Ab对IGF-1诱导的IGF-1R的磷酸化的作用和iv)抗体聚类之间的相关性。图19A至19D：第一人源化形式的c208F2Mab的结合表征。对人细胞系MCF-7(图19A)、猴细胞系COS-7(图19B)和表达人胰岛素受体的转染的鼠细胞系(图19C)上评估hz208F2VH3/VL3mAb的结合特性。平行评估鼠和嵌合208F2mAb的结合。使用抗hIR抗体克隆GRO5来验证转染的细胞系上hIR的表达(图19D)。图20A至20D：已经用于IHC测定的AF305-NA多克隆抗体的ELISA验证。图20A：与hIGF-1R的结合，图20B：与人重组IR的结合。与在这些hIR转染的细胞上的对照AbGRO5相比(图20C)，没有hIREDC和转染的细胞(图20D)表达的细胞IR的识别。图21：来自表达不同水平的hIGF-1R的异种移植物的FFPE切片上的hIGF-1R染色的验证。引入Hs746T作为阴性对照。图22A和22B：在正常FFPE组织切片上进行hIGF-1R表达的评估。胎盘切片用作正常组织的阳性对照，而在每次运行中引入阳性肿瘤异种移植组织以校正hIGF-1R表达。图23：在NSCLFFPE组织切片上评估hIGF-1R表达。代表在所分析的组织的大部分组中观察到强染色的四个病例。图24：在乳癌FFPE组织切片上评估hIGF-1R表达。代表在所分析的组织的测试组中观察到的强染色的三个病例。图25：在来自不同肿瘤的FFPE组织切片上hIGF-1R表达的评估。图26：使用在25℃的温度下基于SPR的BiacoreX100装置获得的传感图的叠加，基于SPR的BiacoreX100装置具有在两个流动池上使用约12.000RU的鼠抗His标签单克隆抗体激活的CM5传感器芯片，鼠抗His标签单克隆抗体化学接枝到羧甲基葡聚糖矩阵，使用HBS-EP+作为运行缓冲液，流速为30μl/min。每个传感图(第一个用三角形标记，第二个用菱形标记)对应于一个完整的循环：1-在一分钟的期间，将重组h-IGF-1R(10μg/ml)的溶液注射在第二流动池上。2-对于第一传感图：每次90s期间，注射运行缓冲液5次，对于第二个传感图：每次90s期间，以增长范围的浓度的抗IGF-1Rc208F2抗体溶液注射五次。3-确定解离动力学速率的300s的延迟。4-通过45s期间10mM甘氨酸，HClpH1.5缓冲液的注射，再生表面。图27：对应于用增长范围的浓度的抗IGF-1Rc208F2溶液获得的传感图减去空白传感图(5次注射HBS-EP+)的传感图谱以灰色表示。对应于1：1模型的理论传感图具有以下参数：kon＝(1.206±0.036)x106M-1.s-1、koff＝(7.81±0.18)x10-5s-1、Rmax＝307.6±0.3RU由细黑线表示。在图上报告了c208F2的计算浓度：仅最高浓度(24nM)被认为是常数)。图28：解离常数对应于对于每种抗体运行的四次实验的平均值，并且对应于以pM为单位的表达的比率：koff/konx1012。误差条对应于标准差(n＝4)。图29：半衰期对应于对于每种抗体运行的四次实验的平均值，并且对应于以h为单位的表达的比率：Ln(2)/koff/3600。误差条对应于标准差(n＝4)。图30：对应于在BiacoreX100装置上以30μl/min的流速和在25℃运行的实验的两个循环的两个传感图的叠加。该循环的第一步对应于在60s期间将浓度为10μg/ml的c208F2抗体溶液注射到通过接枝超过10,500RU的鼠抗人IgGFc单克隆抗体激活的CM5传感器芯片的第二流动池上，所述鼠抗人IgGFc单克隆抗体通过其胺官能团化学连接至羧甲基葡聚糖矩阵。第二步对应于在120s期间以120s的延迟注射粗细胞介质培养上清液的h-IGF-1R(实心菱形)或m-IGF-1R(空心菱形)的细胞外结构域溶液。双向箭头指示在本研究中使用的抗体捕获水平和IGF-1R结合水平的测量位置。图31：代表对于每个嵌合h/mIGF-1R构建体获得的IGF-1R结合水平与在相应周期期间在第二流动池的传感器芯片上捕获的c208F2水平之间的比率的直方图。图32A和B：代表hz208F2H076/L024对pH5至pH8的EC50的直方图，酸性pH减少人源化IGF-1R抗体hz208F2H076/L024(A)和hz208F2(H077/L018(B))的结合能力。图33：Hz208F2(10μg/ml)与170RU的野生型可溶形式的h-IGF1R(黑色菱形)或120RU的该受体的突变体C29(Asp491>Ala)的结合。在CM5传感器芯片上，每种受体被其C末端66His标签捕获。使用BiacoreX100装置在25℃以30μl/min的流速使用经典的HBS-EP+作为运行缓冲液运行实验。具体实施方式实施例本发明中提及的所有杂交瘤已保藏在CNCM(法国，巴斯德研究所)，并在下表7中鉴定。表7杂交瘤名称CNCM参考提交日期101H8I-47332013年4月24日201F1I-47692013年6月26日208F2I-47572013年5月30日212A11I-47732013年6月26日214F8I-47752013年6月26日219D6I-47362013年4月24日213B10I-47742013年6月26日102H8I-47672013年6月26日110G9I-47682013年6月26日415A8I-47782013年6月26日410G4I-47772013年6月26日414E1I-47382013年4月24日433H9I-47802013年6月26日105G2I-47352013年4月24日832E5I-47652013年5月30日实施例1：IGF-1R抗体的生成为了生成针对人的IGF-1受体(hIGF-1R)人细胞外结构域(ECD)的鼠单克隆抗体(MAb)，用10μg的rhIGF-1R蛋白(R&DSystems，目录号391-GR)对5只BALB/c鼠进行3次s.c.免疫。作为可选地，对一些动物用10μg的IGF-1R的鼠细胞外结构域(ECD)(R&DSystems，目录号6630-GR/Fc)进行三次额外的免疫。在完全弗氏佐剂(Sigma，圣路易斯，MD，USA)存在下进行第一次免疫。在随后的免疫中加入不完全弗氏佐剂(Sigma)。融合之前三天，用10μg的rhIGF-1R蛋白加强免疫的鼠。然后从5只免疫的鼠中的1只(所有鼠的血清滴定后选择的)中收获，通过脾灌注和切碎近端淋巴结分别制备脾细胞和淋巴细胞，并融合至SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(ATCC，洛克维尔，MD，USA)。融合规程由Kohler和Milstein(Nature,256:495-497,1975)描述。然后融合的细胞经HAT选择。一般情况下，为了制备单克隆抗体或其功能性片段，尤其是鼠源的，有可能涉及具体在手册“抗体”中描述的那些技术(Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborNY,pp.726,1988)。融合后约10天，筛选杂交细胞的克隆。对于初级筛选，通过FACS分析使用人乳MCF7肿瘤细胞(ATCC)和/或猴COS7细胞(非洲绿猴肾-SV40转化的)评估杂交瘤的上清液的针对rhIGF-1RECD蛋白产生的Mab的分泌，所述猴COS7细胞在它们的细胞表面上表达猴IGF-1R。更精确地，对于通过流式细胞术的选择，在4℃将105个细胞(MCF7或COS7)接种在96孔板的含有1％BSA和0.01％叠氮化钠(FACS缓冲液)的PBS的每个孔中。在2000rpm离心2分钟后，除去缓冲液，加入待测试的杂交瘤上清液。在4℃孵育20分钟后，将细胞洗涤两次，加入在FACS缓冲液(#A11017，MolecularProbesInc.，尤金，USA)中1/500°稀释的Alexa488-缀合的山羊抗鼠抗体，并在4℃孵育20分钟。在用FACS缓冲液最后洗涤后，在向每个管加入终浓度为40μg/ml的碘化丙啶后，通过FACS(Facscalibur，Becton-Dickinson)分析细胞。包括单独含有细胞的孔和用第二Alexa488-缀合的抗体孵育的细胞作为阴性对照。在每个实验中使用同种型对照(Sigma，refM90351MG)。评估至少5000个细胞以计算荧光强度的平均值(MFI)。此外，进行内在化测定以便仅选择内在化抗体。对于该测定，在实验前将MCF7肿瘤细胞系在不含酚红、含1％L-谷氨酰胺和10％FACS的RMPI1640中培养3天。然后使用胰蛋白酶分离细胞，并将100μl的4.105个细胞/ml的细胞悬浮液接种在96孔多孔板中的无酚红、含1％L-谷氨酰胺和5％FBS的RPMI1640中。在2000rpm离心2分钟后，将细胞重悬在50μl杂交瘤上清液或对照抗体溶液(1μg/ml的阳性和同种型对照)中。在4℃，20分钟孵育时间后，将细胞以2000rpm离心2分钟，并重悬于冷的(4℃)或热的(37℃)完全培养介质中。然后将细胞在37℃或4℃孵育2小时。然后用FACS缓冲液洗涤细胞三次。Alexa488标记的山羊抗鼠IgG抗体孵育20分钟，并对碘化丙啶阴性细胞群进行FACS分析之前将细胞洗涤三次。FACS分析后，确定两个参数：(i)在4℃孵育的细胞表面上检测到的荧光信号与在37℃与一种杂交瘤上清液孵育的细胞获得的荧光信号的差异，和(ii)在细胞表面上剩余的IGF-1R的百分比。剩余hIGF-1R的百分比计算如下：剩余IGF-1R百分比＝(MFIAb37℃/MFIAb4℃)x100此外，进行三个ELISA(在克隆之前或之后)以研究抗体对重组人(hIGF-1R)和鼠(mIGF-1R)蛋白和重组人胰岛素受体(hIR)蛋白的结合。保留了在rh-和/或rm-IGF-1R上显示结合并且在rhIR上没有结合的杂交瘤分泌抗体。简要地，用100μl/孔的在PBS中的0.6μg/ml的rhIGF-1R蛋白(R&DSystems，目录号391-GR)或1μg/ml的rmIGF-1R蛋白(R&DSystems,目录号6630-GR/Fc)或1μg/ml的rhIR蛋白(R&DSystems，目录号1544-IR/CF)在4℃包被96孔ELISA板(Costar3690，Corning，NY，USA)过夜。然后将板用含有0.5％明胶(#22151，ServaElectrophoresisGmbH，海德堡，德国)的PBS在37℃封闭2小时。一旦通过甩(flicking)板丢弃饱和缓冲液，将100μl的每种上清液稀释液加入孔中(未稀释的杂交瘤上清液或上清液系列稀释液)，并在37℃孵育1小时。在三次洗涤后，以1/5000的稀释度将100μl辣根过氧化物酶缀合的多克隆山羊抗鼠IgG(#115-035-164，JacksonImmuno-ResearchLaboratories，Inc.，西格罗夫，PA，USA)加入含有0.1％明胶和0.05％吐温20(w：w)的PBS中，在37℃维持1小时。然后，将ELISA板洗涤3次，并加入TMB(#UP664782，Uptima，Interchim，法国)底物。在室温下孵育10分钟后，使用1M硫酸终止反应，并测量在450nm处的光密度。通过有限稀释扩增和克隆感兴趣的杂交瘤分泌抗体。一旦分型(isotyped)，每个代码(code)的一个克隆被扩增和冷冻。在称为CellLine(IntegraBiosciences)的体外生产系统中生产每种感兴趣的抗体用于进一步表征。对比未转染细胞，在IM9细胞(表达人IR的B淋巴母细胞)以及hIGF-1R转染细胞上进行通过FACS分析来解决结合特异性的额外测定。所有对应于选择的抗体的数据总结在表8中。有趣的是，注意到在所选抗体中，i)基于其对hIGF-1R对比hIR的选择性和ii)对其诱导IGF-1R内在化的能力，一些能够在ELISA和FACS设置中识别它们的靶标，而其它的是当通过细胞术(cytometry)研究时非常好的结合物，和当通过ELISA评估时非常差的结合物。m280F2，m212A11，m213B10，m214F8和m219D6属于不能很好识别包被的蛋白的后一组。实施例2：通过使用基于Biacore'sSPR的技术的绘图实验表征抗IGF-1R抗体表位聚类为了研究针对IGF-1R的反应的多样性，所选择的抗体已经通过Biacore绘图，并且已经根据竞争特性进行了这些抗体的聚类。简要地，使用由抗His标签抗体(His捕获试剂盒，GEHealthcare，目录号28-9950-56)激活的CM5传感器芯片，在BiacoreX装置上运行表位绘图实验。使用胺试剂盒化学，将超过11000RU的抗体化学接枝在羧甲基葡聚糖矩阵上。使用HBS-EP缓冲液(GEHealthcare)作为运行和样本稀释缓冲液，在25℃以1μl/min的流速实施实验。表位绘图实验遵循相同的方案：1-可溶形式的hIGF-1R异四聚体(2α链和表达有额外的c-末端10-His标签的2β链的细胞外结构域(R&DSystems目录号305-GR))的溶液以5μg/ml的浓度在1分钟期间注射在两个流动池上。2-然后将待测试的抗hIGF-1R抗体(经典地为50μg/ml)的溶液在60至90秒期间仅注射在流动池1上，以达到(或至少接近)hIGF-1R结合位点的饱和。3-在相同条件下，在两个流动池上或仅在第二流动池上注射用作潜在竞争剂的第二抗体的溶液。4-最后，可以在相同条件下在两个流动池上注射第三抗体的溶液。5-然后，在30s期间注射10mM甘氨酸，HClpH1.5缓冲液再生表面。这种实验清楚地显示，如果两种抗体可以同时结合在hIGF-1R的相同分子上，证明每种抗体的结合区(表位)足够远以允许这样。相反，如果抗体与hIGF-1R的结合阻止了第二抗体的结合，这表明两种抗体识别相同的表位。最后，在部分竞争的情况下，可以怀疑由两种测试抗体识别的表位的重叠。因此定义了表位区域组。结果的复杂性通常随着在实验中使用的抗体组的大小而增加。图1描述了使用基于SPR的BiacoreX装置的表位绘图实验的典型循环的示例。传感图显示反应(RU)是流动池1(黑色菱形)和2(白色菱形)时间(秒)的函数。在阶段1中，将抗原的溶液：具有两个C端10-His标签的可溶性重组hIGF-1R注射到两个流动池上的CM5传感器芯片，其中化学连接到羧甲基葡聚糖矩阵的抗His标签鼠抗体浓度为5μg/ml、流速为10μl/min。在阶段2中，将浓度为50μg/ml的待测试的第一抗体(219D6)的溶液注射到流动池1上。然后在阶段3中，将浓度为50μg/ml的第二抗体(101H8)的溶液注射到流动池2上，随后在阶段4中，在两个流动池上注射浓度为50μg/ml的第三抗体(201F1)的溶液。该注射的反应清楚地显示，201F1对IGF-1R的结合被101H8阻止，但不被219D6阻止。抗体201F1和219D6显然属于不同的表位组。图2描述了对15个选择的候选物进行整体分析产生的聚类，并且证明用hIGF-1R免疫鼠产生了显示良好多样性的一系列抗体。实际上，生成识别不同表位的5个不同组的Mab。实施例3：通过FACS分析抗体与人天然IGF-1R的结合使用递增的抗体浓度，通过FACS分析对人MCF-7乳腺癌细胞系(ATCC#HTB-22)评估一系列抗IGF-1R抗体的结合特性。为此目的，在4℃，在FACS缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.01％NaN3)中，将细胞(1×106个细胞/ml)与抗IGF-1R抗体孵育20分钟。然后将它们洗涤3次，并在4℃在黑暗中用适当的与Alexa488偶联的第二抗体孵育额外的20分钟，之后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即对活细胞进行抗IGF-1R抗体的结合，所述活细胞使用碘化丙啶(其染色死细胞)鉴定。将用每种抗体获得的信号强度的最大值设为Bmax，并以荧光强度的平均值(MFI)表示。使用非线性回归分析(GraphPadPrims4.0)计算以摩尔浓度(M)表示的结合EC50。每个鼠或嵌合Ab的滴定曲线证明所有产生的抗体能够以典型的饱和谱识别天然IGF-1R形式(图3A)。为了对抗体进行排名并比较鼠和嵌合Ab的结合特性，使用非线性回归分析确定每种化合物的结合EC50。每个鼠Ab与其相应的嵌合形式的EC50比较显示2种形式显示相同的结合特性，证明Ab嵌合不影响IGF-1R识别(图3B)。EC50范围在1.2×10-8至4.4×10-10。属于组2的抗体和属于组3a的c102H8显示更好的EC50。关于Bmax分析(图3C)，与另一个相比，三个Ab(414E1(G3b)，105G2(G4)和832E5(G5))具有更低的Bmax。EC50和Bmax值总结在表9中。表9组AcBmaxEC50(M)G1c101H89052.8E-09G3ac102H89518.5E-10G4c105G28054.9E-09G3ac110G99921.4E-09G1c201F19361.5E-08G2c208F29816.7E-10G2c212A119916.7E-10G2c214F810695.0E-10G2c219D69934.7E-10G2c213B1011034.4E-10G3bc410G410202.6E-09G3bc414E17956.0E-09G3ac415A811421.6E-09G3bc433H910321.7E-09G5c832E56911.2E-08实施例4：通过使用天然表达显著水平IR的IGF-1R或IR转染的细胞或IM9细胞来确认抗体特异性为了确认所生成的抗体对hIGF-1R对比hIR的特异性，通过FACS分析评估表达hIGF-1R或hIR的稳定转染子。简要地，在FACS缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.01％NaN3)中，在4℃，将递增浓度的嵌合mAb与细胞孵育20分钟。然后将细胞洗涤3次，在4℃在黑暗中与合适的偶联有Alexa488的第二抗体孵育，之后额外孵育20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即对活细胞进行抗IGF-1R抗体的结合，所述活细胞使用碘化丙啶(其染色死细胞)鉴定。使用非线性回归分析(GraphPadPrims4.0)计算以摩尔浓度(M)表示的结合EC50。对比未转染的细胞(图4B)，在hIGF-1R转染的细胞系(图4A)上获得的滴定曲线确认了嵌合Ab对人IGF-1R的结合特异性。EC50和Bmax值总结在表10中。在该测定中，来自组G2和组G3a的抗体显示最佳的EC50。表10组AcBmaxEC50(M)G1c101H821071.2E-09G1c201F125001.1E-08G2c208F220083.2E-10G2c212A1125134.4E-10G2c214F820942.7E-10G2c219D625215.5E-10G2c213B1020293.3E-10G3ac102H825945.4E-10G3ac110G921895.2E-10G3ac415A827287.0E-10G3bc410G416677.1E-10G3bc414E122651.9E-09G3bc433H921656.5E-10G4c105G223961.7E-09G5c832E519987.3E-09为了验证鼠和嵌合抗体不存在对hIR的结合，使用了表达人IR的稳定细胞系。通过FACS分析进行鼠和嵌合Ab对人细胞表面hIR的识别。将递增浓度的鼠或嵌合mAb在hIR+转染的细胞系上在FACS缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.01％NaN3)中于4℃孵育20分钟。然后将细胞洗涤3次，然后在4℃在黑暗中与合适的偶联有Alexa488的第二抗体孵育，之后孵育额外的20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即对活细胞进行抗IGF-1R抗体的结合，所述活细胞使用碘化丙啶(其染色死细胞)鉴定。使用非线性回归分析(GraphPadPrims4.0)计算以摩尔浓度(M)表示的结合EC50。使用市售特异性抗IGF-1R抗体、克隆GR11L和抗hIR抗体克隆GRO5作为阳性对照。将c9G4作为无关抗体(同种型对照)引入。使用市售抗hIR抗体GRO5确认转染的细胞的细胞表面上hIR的高水平表达。即使使用高浓度的鼠(图5A)或嵌合(图5B)抗hIGF-1RAb，也观察不到hIR+转染的细胞在细胞表面上的结合。这些结果证明，鼠和嵌合抗hIGF-1RAb都不识别hIR。使用IM9细胞(表达hIR的B淋巴瘤细胞系)也证明了对比IR，hIGF-1R的这种特异性识别(图6)。对于该FACS分析，该规程与先前描述的相同，并且使用鼠抗IGF-1R抗体以防止第二抗人Ab(IM9细胞在其细胞表面上表达人Ig)的交叉反应。图6中表示的结果再次证明，使用GRO5抗-hIR抗体观察到预期信号，而所评估的鼠抗体中没有一个在该细胞系上显示任何显著的结合信号。实施例5：通过FACS和Biacore分析结合猴天然IGF-1R的抗体调节毒理学研究的第一先决条件之一是鉴定相关的动物种类以评估所选择的化合物。由于在此所述的一系列抗体不能识别鼠IGF-1R，用于毒理学评估的最可能的物种是非人灵长类动物(NHP)。为了评估抗IGF-1R抗体对猴IGF-1R的结合，使用递增的抗体浓度通过FACS分析在COS-7细胞系上评估鼠和嵌合抗hIGF-1R抗体的结合。在FACS缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.01％NaN3)中于4℃，将细胞(1×106个细胞/ml)与抗IGF-1R抗体孵育20分钟。然后，将细胞洗涤3次，然后在4℃在黑暗中，与合适的偶联Alexa488的第二抗体孵育，之后孵育额外20分钟，最后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即对使用碘化丙啶(其染色死细胞)鉴定的活细胞评估抗IGF-1R抗体的结合。使用非线性回归分析(GraphPadPrims4.0)计算以摩尔浓度(M)表示的结合EC50。在COS-7猴细胞系上获得的滴定曲线显示，除了832E5mAb之外，所有抗hIGF-1RAb特异性识别在猴细胞系表面上表达的IGF-1R(图7A)。每种鼠和嵌合Ab的EC50的确定显示，关于它们对猴IGF-1R的结合特性，有2种形式可媲美(图7B)。这些结果显示，除了mAb832E5之外的所有生成的抗hIGF-1R均识别猴IGF-1R。进行对COS-7细胞对比转染的IGF-1R细胞的结合EC50的比较，以确认嵌合抗体对人相比于对猴IGF-1R的识别的量级。图7B所示的结果证明了除了832E5mAb之外的所有抗体对人和猴IGF-1R的类似的识别。为了确认对另一种类型的猴的识别，用来自食蟹猴的IGF-1R转染细胞以生产可溶性猴IGF-1RECD，并且用嵌合抗体之一(c208F2)进行Biacore实验，以便比较hIGF-1R或食蟹猴IGF-1R的结合特性。使用由抗His标签的抗体(His捕获试剂盒，GEHealthcare，目录号28-9950-56)激活的CM5传感器芯片，在BiacoreX100装置上运行识别实验。使用胺试剂盒化学，将超过11000RU的抗体化学接枝在羧甲基葡聚糖矩阵上。使用HBS-EP缓冲液(GEHealthcare)作为运行和样本稀释缓冲液，在25℃以30μl/min的流速实施实验。单循环动力学方案用于定义，与猕猴IGF-1R相比嵌合形式的208F2抗IGF-1R抗体(c208F2)对hIGF-1R的结合的动力学参数。基于人的序列(R&D系统，目录号305-GR-50)或食蟹猴(在室内生产)之一的序列的可溶性重组形式的IGF-1R异四聚体(由2β链和表达有额外的C-末端10-His标签的2α-链的胞外结构域组成)溶液，在第二流动池上以定义用来捕获约160RU抗原的稀释度注射1分钟。第二抗体的溶液或者在相同条件下在两个流动池上注射，或者仅在第二流动池上注射。在捕获阶段之后，在两个流动池上将运行缓冲液注射5次(每次注射90秒)或者注射增长范围的5种浓度的c208F2(每次注射90秒)。在第五次注射结束时，通过运行缓冲液以定义解离速率。然后在30s期间注射10mM甘氨酸，HClpH1.5缓冲液使表面再生。计算的信号对应于流动池2(具有捕获的IGF-1R)的反应和流动池1(没有任何IGF-1R分子)的反应之间的差异(图8)。对于每个IGF-1R分子(人或食蟹猴)，通过减去5次注射缓冲液获得的信号，校正由于注射增长范围浓度的c208F2引起的信号(双参考)。使用具有1:1模型的Biaevaluation软件分析产生的传感图。独立地(c208F2对每种IGF-1R的结合的2个动力学速率)或普遍地(c208F2对人和食蟹猴IGF-1R的结合的相同动力学速率)评估动力学速率。通过低于0.05RU的Chi2/Rmax比率评估拟合的质量。分别对每种IGF-1R定义的结合的动力学速率(参见表11)是接近的，并且使用相同动力学速率的两个传感图的拟合具有良好的质量。c208F2抗体也识别重组人和食蟹猴IGF-1R，其解离常数(KD)为约0.2nM。在本研究中定义的亲和力对应于抗体对捕获的人和食蟹猴IGF-1R约160RU水平的功能亲和力(或亲合力(avidities))。表11IGF1Rkon[1/M.s]koff[1/s]Kd[nM]Chi2/Rmax人1.52E+063.40E-040.230.045食蟹猴1.85E+063.10E-040.170.032人和食蟹猴1.52E+063.33E-040.220.039实施例6：生成的抗体对IGF-1R磷酸化的固有作用众所周知，当抗体结合酪氨酸激酶受体时，它们可以诱导激动作用。由于我们不想选择这样的激动剂抗体，使用嵌合抗体研究了hIGF-1R磷酸化的评估。为此目的，将MCF-7细胞在无血清介质中孵育过夜。然后，在37℃加入待测试的IGF-1(100nM)或Ab(10μg/ml)10分钟。弃去介质并在裂解缓冲液(pH7.5)中在4℃，90分钟刮下细胞，所述裂解缓冲液(pH7.5)中含有10mMTrisHCl缓冲液(pH7.5)、15％NaCl(1M)、10％去污剂混合物(10mMTris-HCl，10％Igepal裂解缓冲液)(SigmaChemical公司)、5％脱氧胆酸钠(SigmaChemical公司)、1蛋白酶抑制剂混合物完全TM片剂(Roche)、1％磷酸酶抑制剂混合物套装II(Calbiochem)。裂解物通过在4℃离心澄清，在100℃加热5分钟并保持在-20℃或直接装载在4-12％SDS-PAGE凝胶上。在室温下第一抗体的孵育进行2小时，然后在室温下与HRP连接的第二抗体进行孵育1小时。在用ECL可视化蛋白质之前，在TBST中洗涤膜。使用ImageJ软件定量印迹。磷酸化蛋白的值用GAPDH归一化。hIGF-1R响应IGF-1时的磷酸化被认为是100％的刺激。以IGF-1诱导的磷酸化百分比确定抗hIGF-1RAb对hIGF-1R磷酸化的作用。图9中描述的结果代表与IGF-1相比，3个独立实验+/-S.D.中的对嵌合抗IGF-1RAb反应的pIGF-1R的百分比的平均值。如所示，当MCF-7细胞与10μg抗IGF-1RAb一起孵育时，检测到hIGF-1R的无显著或微小(<20％)磷酸化。实施例7：通过鼠抗hIGF-1R抗体抑制对IGF-1反应的IGF-1R磷酸化为了表征所选择的抗体，研究了它们抑制IGF1诱导的磷酸化的能力。为此目的，将MCF-7细胞在无血清介质中孵育过夜。然后，在37℃，将细胞与鼠抗hIGF-1RAb孵育5分钟，然后加入IGF-12分钟。弃去介质，并在裂解缓冲液(pH7.5)中在4℃，90分钟刮下细胞，所述裂解缓冲液(pH7.5)含有10mMTrisHCl缓冲液(pH7.5)、15％NaCl(1M)、10％去污剂混合物(10mMTris-HCl，10％Igepal裂解缓冲液)(SigmaChemical公司)、5％脱氧胆酸钠(SigmaChemical公司)、1蛋白酶抑制剂混合物完全TM片剂(Roche)、1％磷酸酶抑制剂混合物套装II(Calbiochem)。裂解物通过在4℃离心澄清，在100℃加热5分钟并保持在-20℃或直接装载在4-12％SDS-PAGE凝胶上。在室温下进行第一抗体的孵育2小时，然后在室温下与HRP连接的第二抗体进行孵育1小时。在用ECL可视化蛋白质之前，在TBST中洗涤膜。使用ImageJ软件定量印迹。磷酸化蛋白的值用GAPDH归一化。hIGF-1R对IGF-1反应而发生的磷酸化被认为是100％的刺激。以IGF-1诱导的磷酸化百分比确定抗hIGF-1RAb对hIGF-1R磷酸化的作用。加入m105G2，m101H8或m9G4(一种不相关的鼠抗体)不抑制对IGF-1反应的hIGF-1R磷酸化(图10)。加入m201F1中度降低对IGF-1反应的hIGF-1R磷酸化(约40％的降低)。所有其它抗IGF-1RAb强烈抑制对IGF-1反应的hIGF-1R磷酸化(降低大于80％)。IGF1诱导的hIGF-1R磷酸化的最佳抑制剂是m208F2、m212A11和m214F8Mab。实施例8：通过FACS分析结合所生成的抗IGF-1R抗体后研究IGF-1R内在化MCF-7细胞与10μg/ml的嵌合抗体在4℃孵育20分钟。然后，洗涤细胞并在4℃或37℃孵育4小时。在FacsCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)上使用第二抗体确定细胞表面结合的抗体的量。定义为4小时孵育时间后在4℃测量的MFI和在37℃测量的MFI之间的差异的ΔMFI对应于内在化Ab的量。在图11A和11B以及表12中表示ΔMFI。以10μg/ml的Ab的内在化百分比如下计算：100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI，并在表11中表示。对于每种嵌合抗体计算的ΔMFI的最大值(图11A和11B)显示组和内在化的最大值之间没有相关性。表12组Ab内在化百分比ΔMFIEC50G1c101H8752544.2E-09G1c201F1752228.4E-08G2c208F2832881.8E-10G2c212A11803222.7E-10G2c214F8874032.2E-10G2c219D6803534.4E-10G2c213B10853692.3E-10G3ac102H8712627.9E-10G3ac110G9793091.2E-09G3ac415A8783271.2E-09G3bc410G4823213.7E-09G3bc414E1682293.1E-09G3bc433H9793231.1E-09G4c105G2812607.2E-09G5c832E540922.0E-08为了确定还识别猴IGF-1R的抗体是否能够内在化该受体，进行相同的内在化实验。表13中总结的结果证明所有测试的抗体能够介导猴IGF-1R内在化。表13进一步评估细胞表面结合的抗体减少的动力学。为此目的，将MCF-7细胞接种在96孔板中，并在4℃与10μg/ml的鼠孵育20分钟。然后洗涤细胞以除去未结合的抗体，并在37℃在介质中10、20、30、60或120分钟。在每个时间点，将细胞离心，然后用第二抗鼠IgG-Alexa488在冰上进行表面标记，以确定细胞表面上剩余的抗体的量。在4℃，通过信号将每个鼠Ab和每个时间点的荧光强度归一化(剩余IGF-1R的百分比)，并拟合至指数衰减以确定半衰期(t1/2)。t1/2被认为是在4℃测量的信号获得50％的减少时所需的时间。如图12A和12B所示，所有鼠Ab的表面水平在最初的30分钟内快速下降，并且在孵育60分钟后该减少几乎最大(图12A)。关于鼠Ab，计算的半衰期包含在10至18分钟(图12B)。抗体表面衰减与Ab组之间没有相关性。为了验证细胞表面信号的减少是由于Ab内在化而不是由于受体脱落，在37℃将细胞与鼠Ab孵育0、30和60分钟(图13)。然后将细胞固定和透化或不透化，以确定细胞表面结合的抗体(无透化)和对应于细胞表面结合+内在化Ab的总抗体信号(具有透化)。内在化Ab(细胞质)的量如下测定：在透化后的MFI–无透化MFI。该实验显示，细胞表面结合的Ab的减少是由于细胞质Ab的增加，证明Ab被内在化(图13)。此外，如通过透化后信号的减少(总体)所示，在孵育1小时后开始Ab的降解。实施例9：通过共聚焦分析结合所生成的抗IGF-1R抗体后IGF-1R内在化的研究为了进一步确认抗体内在化，进行共聚焦显微镜以评估细胞运输后抗体的亚细胞分布。将细胞与抗hIGF-1RAb在37℃孵育、固定并透化。因此，使用第二抗体Alexa-488和兔抗lLamp-1抗体对细胞染色，所述兔抗lLamp-1抗体使用第二抗兔IgGAlexa555显示。在37℃孵育之前，鼠208F2Ab定位在MCF-7细胞的膜上(图14A)，并且没有与溶酶体标记共定位，使用ImageJ软件的共定位高密度(highliter)插件注意到lamp-1。在孵育15分钟后，细胞表面结合的抗体急剧降低。伴随细胞表面结合的抗体的减少，将检测到细胞内抗体进入囊泡。可以观察到与lamp-1的罕见共定位。孵育30分钟后，几乎检测不到细胞表面结合的抗体。然而，Ab进入溶酶体的共定位增加。孵育1小时后，细胞内Ab染色减少以及与lamp-1共定位的数目减少。这种细胞表面结合的抗体的动力学及其细胞内积累与通过FACS测量的抗体表面衰减的动力学相关。此外，如已经用FACS研究所描述的，通过共聚焦显微镜在孵育1小时后开始鼠Ab的降解。还评估了所有其它抗IGF-1R鼠抗体的内在化以及它们与Lamp-1的共定位(图14B)。实施例10：使用溶酶体抑制剂巴佛洛霉素(Bafilomycin)A1抑制Ab降解为了证实到达溶酶体的抗体它们被降解，使用或不使用巴佛洛霉素A1(一种有效的溶酶体功能抑制剂)处理细胞。然后将细胞与10μg/ml的待测试Ab在4℃孵育、洗涤并在37℃孵育2小时。在细胞透化后使用第二抗鼠IgG-Alexa488Ab检测内在化Ab。加入巴佛洛霉素A1防止细胞内Ab的降解(图15)，表明Ab被有效地内在化并进入溶酶体中被降解。实施例11：pH对抗体IGF-1R结合的作用，以及与细胞毒性效力的相关性。抗体基于它们的内在化潜力而选择，并且如上所示在进入溶酶体区室之前与早期核内体共定位，所以感兴趣的方法在于选择抗体，其中Ab-hIGF-1R结合的稳定性由pH环境调节，并且优选当pH环境变为酸性时优先从IGF-1R解离的抗体。事实上，早期核内体和溶酶体之间的主要区别是它们的腔内pH：在核内体区室中，pH约为6，而在溶酶体区室pH为约4.5。众所周知，一旦在配体结合(IGF1)后内在化，hIGF-1R通过再循环通路返回到细胞表面。不与理论相关联，在此描述的假设是更倾向于在酸性pH下早期从其靶标释放的抗体，可能有利于靶标向膜再循环，因此可以被认为是免疫缀合物方法的更好候选物。为了研究一些我们的抗体是否显示这样的特性，并将该特性与细胞毒性活性相关联，在不同pH的缓冲液中进行鼠抗hIGF-1RMab对MCF-7细胞系的结合。在4℃，在范围5至8的不同pH下，将递增浓度的鼠mAb在MCF-7细胞系上孵育20分钟。然后将细胞洗涤3次，并在FACS缓冲液中与Alexa488偶联的合适的第二抗体孵育。将细胞在4℃在黑暗中孵育额外的20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即对活细胞进行抗hIGF-1R抗体的结合，所述活细胞使用染色死亡细胞的碘化丙啶鉴定。使用非线性回归分析(GraphPadPrims4.0)计算以摩尔浓度(M)表示的结合EC50。属于表位簇组3B的抗hIGF-1R的EC50不受pH的显著影响(图16)。属于表位簇组3a的抗hIGF-1RAb的结合能力通常在酸性pH下增强。相反，属于表位簇组1、2和4的抗hIGF-1RAb的结合能力在酸性pH下降低。为了确定酸性pH是否对免疫缀合物诱导的细胞毒性具有正面的影响，使用市售的Fab-ZAP人测定(ATSBIO)。简要地，将MCF7细胞以2000个细胞/孔接种在96孔板上，并保留过夜以粘附。第二天，用0.45μg/mL的Fab-ZAP和递增浓度的嵌合抗IGF-1RAb处理细胞。使用不结合细胞表面的c9G4单克隆抗体作为阴性对照。在第6天，使用来自Promega(麦迪逊，Wi)的CellTiterGloLuminesence细胞活力测定测量细胞活力。如图17A所示，组4和5的抗IGF-1RAb不诱导对MCF-7的任何细胞毒性，而中等细胞毒性(组1、3a和3b)至高细胞毒性(组2)用其它组测量。在图17B中，IC50的确定确认了组2具有最高的细胞毒性效力，表明这些抗体将是最适合于ADC(抗体药物缀合物)或ATC方法的。在图17中总结的结果显示，在评估的15个嵌合mab之中，c208F2、c219D5、c212A11、c213B10和c214F8均达到最佳的细胞毒性作用，所有这些都属于组2。然而同样来自组1和4的其它抗体也显示对IGF-1R结合的酸性pH的敏感性，未被聚类为细胞毒性的最佳候选物，表明这种特性可能是需要的，但不足以解释来自2组的抗体的具体特性。为了更好地理解该组抗体的具体特征，对所有生成的抗体的可用数据进行相关性研究。该分析的结果表明，需要在酸性pH环境中抑制磷酸化和降低与hIGF-1R结合的能力，以获得最佳的细胞毒活性(图18)。实际上，在酸性pH环境下101H8(G1)、201F1(G1)和105G2(G4)的结合减少，但是是差的磷酸化抑制剂，显示低的细胞毒性活性。另一方面，102H8(G3a)、110G9(G3a)、415A8(G3a)、410G4(G3b)、414E1(G3b)和433H9(G3b)是IGF1诱导的磷酸化的有效抑制剂，但对pH变化不敏感或其结合在酸性pH下增强，在Fab-ZAP人测定中仅证明中等的细胞毒性活性。人源化抗IGF-1RMab对MCF-7细胞系的结合在不同pH的缓冲液中进行。在4℃，在范围5至8的不同pH下，将递增浓度的人源化mAb在MCF-7细胞系上孵育20分钟。然后将细胞洗涤3次，并在FACS缓冲液中与合适的Alexa488偶联的第二抗体孵育。将细胞在4℃在黑暗中孵育额外的20分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即对活细胞进行抗IGF-1R抗体的结合，所述活细胞使用染色死亡细胞的碘化丙啶鉴定。使用非线性回归分析(GraphPadPrims4.0)计算以摩尔浓度(M)表示的结合EC50。人源化抗IGF-1R抗体在酸性pH下显示更低的结合能力，如图32A和32B所示。实施例12：208F2Mab的人源化形式的评估12.1第一人源化形式hz208F2VH3/VL3(也称为hz208F2H026/L024)的结合和内在化的评估在MCF-7、COS-7和NIH3T3IR+细胞系上评估第一人源化形式的c208F2mAb的结合。在4℃，在每个细胞系上加入递增浓度的m208F2、c208F2或hz208F2VH3VL3维持20分钟。然后洗涤细胞，并使用相应的第二抗体显示测试的mAb的结合。为了验证人IR在转染的细胞系上的表达，使用市售的抗hIR抗体克隆GRO5，并且其识别图谱在(图19D)上面示例。在MCF-7(图19A)或猴COS-7(图19B)细胞上比较人源化形式与鼠或嵌合体，显示3种测试形式的接近的谱。人源化过程不改变抗体识别的特异性，其与对人胰岛素受体不存在交叉反应性的鼠和嵌合形式完全具有可比性(图19C)。第一人源化形式的c208F2对人细胞系MCF-7和猴细胞系COS-7的计算EC50与用208F2的鼠或嵌合形式确定的EC50相似。通过流式细胞术评估mAbhz208F2VH3/VL3内在化的能力。MCF-7细胞与10μg/ml的抗体在4℃孵育20分钟。然后，洗涤细胞并在4℃或37℃孵育4小时。使用第二抗体确定细胞表面结合的抗体的量。定义为在4小时孵育时间后在4℃测量的MFI和在37℃测量的MFI之间的差异的ΔMFI对应于内在化Ab的量。ΔMFI在表14a中表示。按照以下100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI，计算10μg/ml的Ab的内在化百分比，并示于表14a中。因此，与用相应的鼠和嵌合208F2抗体测量的相比，人源化hz208F2VH3/VL3具有相似的结合和内在化特性。表14a12.2评估随后的hz208F2人源化形式的结合mAb208F2是人源化的，并评估16种人源化变体(包括12.1中描述的第一形式)的结合特性。通过使用递增的抗体浓度对人MCF-7乳腺癌细胞系和猴细胞系Cos-7的FACS分析来评估人源化变体的结合特性。为此目的，在4℃在FACS缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.01％NaN3)中，将细胞(1×106个细胞/ml)与抗IGF-1R人源化抗体孵育20分钟。然后将它们洗涤3次，并在4℃在黑暗中用适当的与Alexa488偶联的第二抗体孵育额外的20分钟，之后在FACS缓冲液中洗涤3次。立即对活细胞进行抗IGF-1R抗体的结合，所述活细胞使用碘化丙啶(其染色死细胞)鉴定。使用非线性回归分析(GraphPadPrims4.0)计算以摩尔浓度(M)表示的结合EC50。人源化变体的EC50显示所有人源化变体在人和猴细胞系上都显示出等同的结合特性。人源化抗体的EC50总结在表14b中。表14b12.3另一种hz208F2人源化形式的内在化的评估MCF-7细胞与10μg/ml人源化抗体在4℃孵育20分钟。然后，洗涤细胞并在4℃或37℃孵育4小时。在FacsCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)上，使用第二抗体确定细胞表面结合的抗体的量。定义为在4小时孵育时间后在4℃测量的MFI和在37℃测量的MFI之间的差异的ΔMFI对应于内在化Ab的量。ΔMFI在表14c中表示。按照以下100*(4℃的MFI–37℃的MFI)/4℃的MFI，计算10μg/mlAb内在化百分比。人源化抗体hz208F2H077/L018能够诱导IGF-1R的显著内在化。表14c实施例13：IGF-1R作为免疫缀合物方法的靶标。建立IHC研究以验证hIGF-1R作为免疫缀合物方法的靶标。实际上，与正常细胞相比，这种方法的有用靶标需要在肿瘤细胞上的显著过表达。用于免疫缀合物方法的合适靶标的另一个特性是其在许多适应症中在相当大百分比的患者群体中过表达的普遍性。为了评估hIGF-IR是否可以被认为是免疫缀合物方法的合适靶标，选择被描述为特异于hIGF-1R细胞外结构域(EDC)的市售多克隆抗体(来自R&DSystems的AF305-NA)与hIR对比。我们的过程的第一步是验证AF305-NA对hIGF-1RECD的特异性和其缺乏hIR的识别。为此目的，使用上文已经详述的规程对人IGF-1R和hIRECD蛋白进行一系列的ELISA测试。图20A中描述的结果证明多克隆抗hIGF-1R抗体有效地识别hIGF-1RECD。用作阳性对照的GR11L抗体(Calbiochem)得到预期的谱。如供应商所描述的，图20B显示与在ELISA中用作阳性对照的抗hIRGRO5Mab(Calbiochem)不同，AF305-NA不识别hIR。同样，通过FACS分析多克隆AF305-NA对hIR+转染的细胞的结合评估，证实它不识别细胞形式的hIR(图20D)，而抗hIRGRO5抗体在转染的细胞上呈现期望的谱(图20C)，证明了它们表达高水平的hIR。如所预期的，识别hIGF-1R并在实验中作为阴性对照引入的GR11L在hIR+转染的细胞上不显示任何信号(图20C)。对于hIGF-1R分布研究，AF305-NA抗体被充分验证，在DiscoveryUltraautostainerVentana上建立了IHC规程。简要地，在脱蜡后，使用对应于EDTApH8缓冲液的CC1在96℃进行抗原恢复(retrivial)32分钟。将第一抗体(AF305-NA)在37℃孵育1小时。洗涤后，将聚合物HRP-OMap抗山羊IgG(Ventana)在37℃孵育16分钟，然后使用DAB色原体显示。最后，使用苏木色素对组织进行复染色。然后将玻片置于Eukitt介质中。为了验证IHC染色，根据其hIGF-1R的体外表达，选择来自异种移植物的一组肿瘤组织。如图21所示，在3个阳性组织(MCF-7，NCI-H23和NCI-H82)上观察到强的膜染色。在选择为阴性肿瘤的Hs746t上没有观察到膜染色。对于染色分析，使用来自RocheVentana的HT扫描仪扫描玻片，使用Virtuoso软件(RocheVentana)定量IGF-1R染色。对于组织分析，如果可能，针对具有多于50个细胞的每个肿瘤的4个视野(FOV)进行评分，以便提高算法的统计准确性。根据HER2膜算法，组织评分为+++(也描述为3+)、++至+++(也描述为2+至3+或++/+++)、++(也描述为2+)、+(也描述为1+)。根据CAP/ASCO测试指南定义评分为(+)用于弱或不完全膜染色，或者在样本中少于10％的细胞弱的、完全膜染色。描述为完全膜染色的评分(++)是不均匀或弱的，但在至少10％的细胞中具有明显的圆周分布，或者在30％或更少的肿瘤细胞中强的完全膜染色。(+++)的评分对应于大于30％的侵袭性肿瘤细胞的均匀强膜染色。当肿瘤评分为(++)至(+++)时，其在肿瘤分析组织中的违反(traduces)异质性(-)意味着没有检测到hIGF-1R的表达，并且(c)意味着染色仅仅是细胞质的。细胞质染色的特征在于没有膜染色，使得细胞分离。然后使用以上的规程对正常和肿瘤组织进行扩展研究(图22A和B)。对于这些研究，来自Superbiochips的人正常和肿瘤TMA用于进行分布和流行研究。在每个自动染色循环中引入两种不同的对照。一种对照由胎盘切片组成，已知为IGF-1R表达的阳性对照，以及提供有正常TMA组织。第二系列对照在3份显示评分2+或3+(分别为MCF-7和NCI-H23，NCI-H82)的肿瘤异种移植组织的玻片上。在每个染色运行顺序中加入后一种对照以校正表达。如预期的，来自异种移植物的胎盘和组织对hIGF-1R呈阳性。在这4个对照中观察到强烈的膜染色。在人正常组织的第一组中(图22A)，在胃道(食道、小肠、结肠和直肠)中观察到IGF-1R从未超过1+的轻微膜检测。对于所有其它分析的组织，没有观察到IGF-1R的膜表达。在正常人组织的第二组中(图22B)，在肾结构中观察到IGF-1R从未超过1+的轻微膜检测。在前列腺的上皮和尿道上皮上观察到强膜染色(++)。除了这两种组织外，没有观察到强的膜染色。这种表达模式强烈表明hIGF-1R可能是ADC或ATC方法的良好靶标。为了确定靶标IGF-1R的免疫缀合物的潜在的适应症，使用上述规程分析来自患者的肺、乳、头和颈部、膀胱和肾肿瘤样本的IGF-1R的表达。在69例研究的肺样本中，67例可解释。如上所述定量IGF-1R表达。如图23所示，与正常邻近组织相比，在许多癌上检测到强的膜表达，所述正常邻近组织是阴性的，与我们以上已经在正常组织上描述的相一致。所有分析的病例总结在表15中。观察了55％的++或+++病例，包括肺癌的所有亚型。鳞状细胞肺癌是最常表达(expressive)hIGF-1R的肿瘤，具有70％的++、++/+++或+++病例，仅43％保留+++和++/+++肿瘤。这些结果与公开的数据一致，所述数据描述了鳞状细胞肺癌患者中常见的高多体性或hIGF-1R扩增。表15IGF-1R表达正常组织肺腺癌，良好分化的18/30T2bN2M0IIIA1036(-)(-)肺腺癌，良好分化的0/15T2aN0M0IB1046(-)(-)肺腺癌，良好分化的0/39T2aN0M0IB1086(+)(-)肺腺癌，良好分化的22/22T3N2M0IIIA1576(-)(-)肺腺癌，中度分化的0/6T2aN0M0IB1566(+)(-)肺腺癌，中度分化的0/30T2aN0M0IB1026(+)(-)肺腺癌，中度分化的0/12T2aN0M0IB1586(+)(-)肺腺癌，中度分化的2/15T3N2M0IIIA1596(-)(-)IGF-1R表达正常组织肺鳞状细胞癌，良好分化的5/43T2aN1M0IIA1016(+)至(++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的0/15T2aN0M0IB1096(+)至(++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的2/20T3N2M0IIIA1136(+++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的4/61T2aN1M0IIA1156(++)至(+++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的0/17T2aN0M0IB1206(++)至(+++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的1/46T2bN1M0IIB1216(++)至(+++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的1/43T2aN1M0IIA1236(++)至(+++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的8/28T2aN2M0IIIA1366(++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的0/17T2aN0M0IB1376(++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的0/19T2aN0M0IB1396(++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的4/32T2aN2M0IIIA1446(++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的0/24T2bN0M0IIA1486(+++)(-)肺鳞状细胞癌，良好分化的5/40T2bN1M0IIB1506(+++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的0/20T2aN0M0IB1556(+++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的1/15T2bN1M0IIB1056(+)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的0/8T2aN0M0IB1066(+)至(++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的0/16T3N0M0IIB1106(+++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的0/16T2aN0M0IB1186(-)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的0/34T2bN0M0IIA1196(++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的5/18T2aN2M0IIIA1266(+++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的1/25T2aN1M0IIA1296(+++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的0/22T2bN0M0IIA1306(++)至(+++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的3/21T2aN1M0IIA1316(-)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的2/18T1bN1M0IIA1346(+)至(++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的1/33T2aN1M0IIA1386(++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的1/25T2aN1M0IIA1456(+++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的0/21T2aN0M0IB1466(++)至(+++)(-)肺鳞状细胞癌，中等分化的0/28T3N0M0IIB1516(++)(-)肺鳞状细胞癌，不良分化的0/50T4N0M0IIIA1326(+++)(-)肺鳞状细胞癌，不良分化的1/3T2aN2M0IIIA1356(-)(-)肺鳞状细胞癌，不良分化的0/22T3N0M0IIB1406(+)至(++)(-)肺鳞状细胞癌，不良分化的0/22T2aN0M0IB1416(+++)(-)肺鳞状细胞癌，不良分化的0/18T2bN0M0IIA1286(++)(-)肺鳞状细胞癌，不良分化的0/11T2aN0M0IB1476(+)至(++)(-)肺鳞状细胞癌，不良分化的0/12T2aN0M0IB1526(++)(-)肺鳞状细胞癌，不良分化的0/14T3N0M0IIB1536(-)(-)肺鳞状细胞癌，纺锤细胞0/10T1bN0M0IA1226(++)(-)IGF-1R表达正常组织肺鳞状细胞癌0/6T3N0M0IIB1116(-)(-)肺鳞状细胞癌0/14T2aN0M0IB1546(+++)(-)IGF-1R表达正常组织肺大细胞神经内分泌癌0/7T2aN0M0IB1126(+++)(-)肺大细胞神经内分泌癌0/38T3N0M0IIB1336(+)(-)IGF-1R表达正常组织肺大细胞癌0/9T2aN0M0IB1146(++)至(+++)(-)肺大细胞癌0/14T1bN0M0IA1256(+)(-)肺大细胞癌0/33T2aN0M0IB1426(++)(-)IGF-1R表达正常组织肺细支气管肺泡癌，非黏液性7/17T3N2M0IIIA1076(-)(-)肺细支气管肺泡癌，非黏液性0/8T2bN0M0IIA1166(-)(-)肺细支气管肺泡癌，非黏液性2/24T1aN1M0IIA1496(+)(-)肺细支气管肺泡癌，黏液性0/8T2aN0M0IB1176(-)(-)肺细支气管肺泡癌，黏液性0/24T2aN0M0IB1246(++)(-)肺细支气管肺泡癌，黏液性0/9T3N0M0IIB1276n/a(-)肺细支气管肺泡癌，黏液性1/11T1bN1M0IIA1436(+)(-)对一系列10个乳癌样本进行了IGF-1R表达的另一研究。图24所示的结果证明与邻近的正常组织相比，IGF-1R在癌组织上高度表达。表16中总结的染色数据证明66％的分析病例是++、++/+++或+++，22％的分析病例是+++或++/+++。表16最后，在包括头和颈部、泌尿膀胱和肾的一系列肿瘤中显示IGF-1R的过表达(图25)。再次，对比正常邻近组织，注意到在肿瘤样本上IGF-1R的高度过表达。总之，这些结果与免疫缀合物方法相一致，以治疗许多IGF-1R阳性的肿瘤，包括肺、乳、头和颈部、泌尿膀胱和肾。实施例14：定义五种嵌合抗IGF-1R抗体(c208F2、c213B10、c212A11、c214F8和c219D6)和人源化形式(VH3/VL3)的208F2抗体结合可溶性重组人IGF-1R的解离常数(KD)通过解离速率(koff)和结合速率(kon)之间的比率来定义抗体对重组可溶性人IGF-1R的结合的解离常数(KD)。使用由鼠抗His标签单克隆抗体激活的CM5传感器芯片在BiacoreX100装置上运行动力学实验。使用胺试剂盒化学将大约12000RU的抗体化学接枝在羧甲基葡聚糖矩阵上。使用HBS-EP+缓冲液(GEHealthcare)作为运行和样本稀释缓冲液，在25℃以30μl/min的流速实施实验。单循环动力学方案用于定义抗IGF-1R抗体与由它的两个C末端10组氨酸标签捕获的可溶性重组人IGF-1R结合的动力学参数。1-可溶性重组形式的人IGF-1R异四聚体的溶液：2α链和表达有额外的C末端10-His标签的2β链的细胞外结构域(R&DSystems，目录号305-GR-50)以10μg/ml的浓度，在1分钟的期间注射在第二流动池上。在本研究实现的24个循环的每个循环，捕获平均值587RU(具有标准偏差24RU)的可溶性受体。2-捕获阶段后，注射运行缓冲液5次(每次注射90秒)或者在两个流动池上注射增长范围的5种浓度的六种抗体之一(每次注射90μl)。在第五次注射结束时，运行缓冲液在5分钟期间通过，以定义解离速率。3-然后在45s期间注射10mM甘氨酸，HClpH1.5缓冲液生成表面。计算的信号对应于流动池2(具有捕获的IGF-1R)的反应和流动池1(没有任何IGF-1R分子)的反应间的差异。对于每种IGF-1R，通过减去5次注射缓冲液获得的信号(双参考)来校正由于注射增长浓度范围的一种抗体而产生的信号，参见图26。通过Biaevaluation软件以1:1模型分析所得传感图。对于每种抗体使用两种不同浓度范围运行四次经验：对于每个抗体的前两次实验为40、20、10、5和2.5nM，后两次实验运行为24、12、6、3和1.5nM。对于在该实验中测试的6种抗体，当更高浓度定义为常数并计算其它四种浓度时，实验数据与具有显著koff值的1：1模型拟合良好(参见图27)。以比率koff/kon计算的解离常数(KD)和以比率Ln(2)/koff计算的复合物的半衰期在图28和29中代表。它们对应于对每种抗体运行的四次独立实验的平均值。误差条对应于值的标准差(n＝4)。解离常数在10至100pM的范围内。c208F2抗体表示h-IGF-1R的更弱的亲和力(更高的解离常数值)(具有约75pM的KD)，并且其人源化形式至少与嵌合形式(具有约60pM的KD)同样好。其它四种抗IGF-1R嵌合抗体对hIGF1-R表现出非常相似的亲和力(KD约为30pM)。亲和力的差异主要与复合物的解离速率或所得半衰期相关。以嵌合和人源化(VH3/VL3)形式，复合物与208F2的半衰期在2至3小时。对于四种其它的嵌合抗体，平均半衰期在7.0至9.4小时。这些非常慢的解离动力学与抗体的二价结构明显相关，所述抗体的二价结构能够通过其两个Fab臂同时结合两个邻近的h-IGF-1R分子。在这种情况下，捕获的IGF-1R分子的水平可能对解离速率具有影响。本研究中定义的亲和力对应于约600RU的抗体捕获h-IGF-1R的水平的功能亲和力(或亲合力)。在以上显示的数据(表10)和实施例13中所表示的值之间观察到KD的3倍差异，这与hIGF-1R的捕获水平的变化相关(600RU对比实施例5中的160RU)。实施例15：定义鼠IGF-1R特异性残基，其使用可溶形式的嵌合h/mIGF-1R重组蛋白阻止c208F2结合使用由鼠抗人IgGFc单克隆抗体激活的CM5传感器芯片，在BiacoreX100装置上运行可溶形式的嵌合h/mIGF-1R重组蛋白对c208F2抗体的结合实验。使用胺试剂盒化学将超过10,500RU的抗Fc抗体化学接枝在两个流动池的羧甲基葡聚糖矩阵上。使用HBS-EP+缓冲液作为运行和样本稀释溶液，在25℃以30μl/min的流速实施实验。实验设置如下：1-在60秒期间在第二流动池上注射浓度为10μg/ml的c208F2溶液。2-测试的IGF-1R构建体对应于在运行缓冲液中稀释10倍的培养介质的浓缩上清液。在每个循环中在120秒期间以120秒的延迟注射一种构建体。3-通过在30s期间注射10mM甘氨酸，HClpH1.7缓冲液再生两个流动池。图30显示了两个循环的叠加。在第一和第二循环期间分别注射h-IGF-1R和m-IGF-1R上清液。该实验清楚地显示m-IGF-1R不能结合c208F2抗体，用于确定c208F2捕获水平和IGF-1R结合水平的位置由双向箭头指示。IGFR的细胞外结构域(不含信号肽)分别由人和鼠序列的805和806个氨基酸组成。在两种结构中869个残基(96％)是一致的。鼠序列的37个残基不同于相应的人序列。一个差异对应于缺口。如图31所示，在所测试的7个嵌合构建体中，4个(C1(SEQIDNo.83)、C4(SEQIDNo.86)、C7(SEQIDNo.88)和C8(SEQIDNo.89)如h-IGF-1R一样结合c208F2良好，3个构建体(C2(SEQIDNO.84)、C3(SEQIDNO.85)和C6(SEQIDNO.87))如同mIGF-1R(SEQIDNo.91)，不结合c208F2。C1的结合和C2的结合缺乏表明阻断c208F2结合的鼠特异性残基位于蛋白质的N末端一半。因此，位于C-末端一半的最后11个特异性鼠氨基酸对c208F2的结合没有影响。C3的结合缺乏证明了在位置494处的一个鼠特异性残基Arg的主要贡献，而不是His。这个结果通过含有两个鼠特异性残基His494>Arg和Ser501>Trp的C6缺乏结合得以确认。C4的结合表明在该嵌合IGF-1R的位置501处唯一的鼠特异性残基Trp不负责C2和C6的结合的缺乏。C7的结合表明存在于该构建体中的17个鼠特异性残基中没有一个在阻断c208F2的结合中具有任何作用(weight)。同样，C8的结合排除4个其它鼠特异性残基。人IGF1R的C12突变体在L1结构域中表示三个小鼠残基，即在位置28处的Phe而不是Tyr，在位置125处的Ile而不是Val，以及在位置156处的Leu而不是Met，以亚纳摩尔的解离常数结合c208F2。该实验证实L1结构域不涉及抗体的结合，或至少区分小鼠和人序列的3个位置不负责抗体对鼠形式的IGF1R的缺乏结合。如图33所示，hz208F2不能结合120RU的通过其6HisC-末端标签捕获在CM5传感器芯片上可溶形式的h-IGF1R的C29突变体(Asp491>Ala)(白色菱形)，而相同的抗体溶液明显结合(黑色菱形)170RU的可溶性受体的野生型形式。因为His494、Asp491对于hz208F2对IGF1R的亲和力是至关重要的。晶体学数据显示两个残基暴露于FnR3结构域中的受体表面。总之，这些结果证明hz208F2结合IGF-1R的FnR3结构域，并且该抗体识别的表位含有对抗体结合至关重要的His494和Asp491。序列表<110>皮埃尔法布雷医药公司<120>新的IGF-1R抗体及其作为定位载体用于治疗癌症的用途<130>367603D33596<150>US61984160<151>2014-04-25<160>92<170>PatentInversion3.5<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>一致性CDR-H1<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Thr可以被Ser取代<220><221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>Tyr可以被Phe取代<400>1GlyTyrThrPheThrSerTyrTyr15<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>一致性CDR-H2<400>2IleTrpProGlyAspGlySerThr15<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>一致性CDR-H3<400>3AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyr1510<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>一致性CDR-L1<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Ser可以被Asn取代<400>4GlnAspIleSerLysTyr15<210>5<211>3<212>PRT<213>人工序列<220><223>一致性CDR-L2<400>5TyrThrSer1<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>一致性CDR-L3<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Thr可以被Ala取代<400>6GlnGlnGlySerThrLeuProTyrThr15<210>7<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-H1<400>7GlyTyrThrPheThrSerTyrTyr15<210>8<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-H1<400>8GlyTyrSerPheThrSerTyrPhe15<210>9<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-L1<400>9GlnAspIleSerLysTyr15<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-L1<400>10GlnAspIleAsnLysTyr15<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-L3<400>11GlnGlnGlySerThrLeuProTyrThr15<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>CDR-L3<400>12GlnGlnGlySerAlaLeuProTyrThr15<210>13<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c208F2,重链,VH<400>13GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleTyrTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpLeu354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysAspLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerAsnThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>14<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c212A11,重链,VH<400>14GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>15<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c214F8,重链,VH<400>15GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlySerGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluArgPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>16<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c219D6,重链,VH<400>16GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAsp151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPheThrSerTyr202530PheIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrThrAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuAsnSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>17<211>120<212>PRT<213>人工序列<220><223>c213B10,重链,VH<400>17GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlySerGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluArgPhe505560LysGlyLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSer115120<210>18<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c208F2,轻链,VL<400>18AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrIleLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnValGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerThrLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>19<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c212A11,轻链,VL<400>19AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleAsnLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrValLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerThrLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>20<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c214F8,轻链,VL<400>20AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrPheSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrIleLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleThrAsnLeuGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerAlaLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>21<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c219D6,轻链,VL<400>21AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrValLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerThrLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>22<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>c213B10,轻链,VL<400>22AspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerLysTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnGlnProAspGlyThrIleLysLeuLeuIle354045TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ArgGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleThrAsnLeuGluGln65707580GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlySerAlaLeuProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>23<211>449<212>PRT<213>人工序列<220><223>c208F2,重链,全长<400>23GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleTyrTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpLeu354045GlyTrpIleTrpProGlyAspGlySerThrLysTyrAsnGluLysPhe505560LysAspLysThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerAsnThrAlaTyr65707580MetPheLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaSerProMetIleThrProAsnTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGln100105110GlyAlaSerValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerVal115120125PheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAla130135140LeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSer145150155160TrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaVal165170175LeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro180185190SerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLys195200205ProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluProLysSerCysAsp210215220LysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGly225230235240ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle245250255SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu260265270AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis275280285AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArg290295300ValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys305310315320GluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleG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