r>[0020] 本发明还提供了上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的应用，例如在果蔬汁工业 中的应用。
[0021] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在食品工业中应用新的葡萄糖苷酶。本发明的重组高催化效率葡萄糖苷酶突变 体最适pH为4.5,最适温度为75°C，与野生型的一致，但是亲和力比野生型提高2.2倍，催化 效率提高2.3倍。
【附图说明】
[0022] 图1:高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体与野生型的最适pH。
[0023] 图2:高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体与野生型的最适温度。
【具体实施方式】
[0024] 试验材料和试剂
[0025] 1、菌株及载体:表达宿主Pichiapastoris GS115,表达质粒载体pPIC9r为本实验 室保存。
[0026] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，纤 维二糖购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0027] 3、培养基：
[0028] (1)LB培养基:0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，l%NaCl，pH 7.0
[0029] (2) Yro培养基:1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖
[0030] (3)MD 固体培养基:2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34%YNB，0.00004%Biotin
[0031] (4)MM 固体培养基：1.5%琼脂糖，1.34%丫他，0.00004%81〇^11，0.5%甲醇
[0032] (5)BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1%甘油（V/V)，1 ·34%ΥΝΒ， 0.00004%Biotin
[0033 ] (6) BMMY培养基：1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1 · 34 % YNB，0 · 00004 % Bio t in，0 · 5 % 甲醇(v/v)
[0034] 实施例1高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体编码基因 A-M36N的克隆
[0035] 本发明以来源于嗜热真菌篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性β- 葡萄糖苷酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3)为母本，采用分子生物学技术对酸性β-葡萄糖 苷酶序列进行区域替换后表达。
[0036] SEQ ID Ν0.3如下所示：
[0037] YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWMGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRFANPVTAFPAG INAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQA CAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGY IMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPP VAFSSWNGGKANVDVTCDHKSWRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLA MGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNL DPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIA KQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKEL FDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWV VPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
[0038] 以Talaromyces leycettanus JCM12802基因组DNA为模板，在β-葡萄糖苷酶的催 化活性通道loop区域处设计区域替换引物，采用over-lap PCR的方法扩增高催化效率β-葡 萄糖苷酶突变体编码基因 Α-Μ36Ν。
[0039]表1.高催化效率β_葡萄糖苷酶突变体PG63X特异性引物
[0040]
[0042]实施例2高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的制备。
[0043] 将表达载体pPIC9r进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码高催化效率β-葡萄糖 苷酶突变体的基因 Α-Μ36Ν双酶切(EcoR I+Not I)，切好的编码成熟高催化效率β-葡萄糖苷 酶突变体的基因片段与表达载体pPIC9r连接，获得含有高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基 因 Α-Μ36Ν的重组质粒pPIC9r-A-M36N并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/Α-M36N。
[0044] 取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30 °C，220rpm摇床培养48h;后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5 %甲醇 的BMMY培养基重悬，并再次置于30°C，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使 菌液中的甲醇浓度保持在ο. 5%，同时取上清用于酶活性检测。
[0045]重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体最适pH为4.5,最适温度为75°C，与野生型的 一致，但是亲和力比野生型提高2.2倍，催化效率提高2.3倍。
[0046]实施例3重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的活性分析
[0047] β-葡萄糖苷酶活性的测定:在405nm下测定酶水解底物pNPG所生成的产物对硝基 苯酚(PNP)的量。
[0048] 反应步骤：125μ1 2mM pNPG底物与125μ1缓冲液混匀，加入250μ1适当稀释的酶液， 于75°C反应lOmin，加入1.5mL 1Μ的Na2C03终止反应，使用分光光度计测定0D4Q5值。
[0049] 酶活单位的定义：1个β-葡萄糖苷酶活性单位(U)定义为在给定反应条件下，每分 钟分解底物PNPG生成Ιμπιο 1对硝基苯酚(ρΝΡ)所需的酶量。
[0050] 实施例4重组β-葡萄糖苷酶高催化效率突变体的性质测定
[0051 ] 1、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适pH测定方法如下：
[0052]将实施例2纯化的重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型在不同的pH下进 行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的O.lmol/L柠檬酸-磷酸氢二 钠缓冲液中75°C下进行β-葡萄糖苷酶活力测定。结果（图1)表明，重组高催化效率β-葡萄糖 苷酶突变体和野生型的最适反应pH-致，且在ρΗ3.0-6.0范围内有相同的作用趋势。符合不 改变最适pH值提高催化效率的目的。
[0053] 2、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适温度测定方法如下：
[0054] 重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适温度的测定为在0 . lmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适 温度测定结果（图2)表明，重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的最适温度与野生型保持 一致(75。〇。
[0055] 3、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如下：
[0056] 测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5miη。用不同浓度的纤 维二糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ΡΗ4.5)缓冲液体系中，75 °C下测定酶活性，计 算出其在75 °C下的Km值。突变体及野生酶动力学参数如表2所示：
[0057]表2.突变体及野生型对纤维二糖酶催化反应动力学参数
[0058]
[0059]结果显示，重组高催化效率β_葡萄糖苷酶突变体最适pH为4.5，与野生型的一致， 但是亲和力比野生型提高2.2倍，催化效率提高2.3倍。
【主权项】
1. 一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 高催化效率β_葡萄糖苷酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述高催化效率 β-葡萄糖苷酶突变体。3. 根据权利要求2所述的高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸 序列如SEQ ID NO.2所示。4. 包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体。5. 包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体pPIC9r-A-M36N。6. 包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组菌株。7. 包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组菌株GS115/A-Μ36Ν。8. -种制备高催化效率β_葡萄糖苷酶的方法，包括以下步骤： 1) 用权利要求4所述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组β-葡萄糖苷酶的表达； 3) 回收并纯化所表达的高催化效率β_葡萄糖苷酶。9. 权利要求1所述高催化效率β_葡萄糖苷酶突变体的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种嗜热β-葡萄糖苷酶突变体M36N及其编码基因和应用。本发明提供的突变体是通过改变酶蛋白的催化口袋loop特殊氨基酸残基的极性构建自嗜热真菌篮状菌Talaromyces？leycettanus？JCM12802的高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A。在此改造条件下，突变体的对纤维二糖的亲和力比野生型(突变前)提高2.2倍，催化效率提高2.3倍，且最适反应pH值和温度不变。
【IPC分类】C12N15/56, C12N1/19, C12N9/42, C12R1/84, C12N15/81
【公开号】CN105567662
【申请号】CN201610060528
【发明人】姚斌, 柏映国, 夏伟, 石鹏君, 罗会颖, 黄火清, 王亚茹, 苏小运, 王苑
【申请人】中国农业科学院饲料研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月28日