一种卤醇脱卤酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种卤醇脱卤酶，含有编码该酶的核酸序列 的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及在催化 邻-卤醇化合物进行取代反应中的应用。 【背景技术】
[0002] 他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，其通过竞争性抑制 内源性胆固醇合成限速酶（HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆 固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面（主要为肝细胞）低密度脂蛋白受体数量和活 性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100， 从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。因此，他汀类药物在降血脂方面被称为 "神奇的药物"
[0003] 结构 所示的6-取代-3, 5-二羟基己酸酯衍生物 ? 是人工合成他汀类药物的重要中间体，如瑞舒伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、匹伐他汀、氟 伐他汀和洛伐他汀等。
[0004] 制备上述结构式所示化合物的方法主要包括利用氢氰酸或氰酸盐进行化学合成。 例如，1^634456981公开了6-氯代-3,5-二羟基己酸酯与氰化钠在1^二甲基甲酰胺中 80°C反应生成6-氰基-3, 5-二羟基己酸酯的方法。但是，利用化学法均具有收率低下、副 产物过多、分离纯化困难等缺点。
[0005] 因此，近年来，研究的热点集中在生物催化法方面。与化学法相比，生物催化法具 有反应条件温和、反应转化率高、产物化学纯度和光学纯度高等优点。目前报道的生物催化 酶主要有卤醇脱卤酶。卤醇脱卤酶是一类通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧 化物的脱卤酶，可以高效高选择性的催化环氧化物和邻卤醇之间的转化，因而可以用来合 成具有光学纯的环氧化物，具有传统化学合成法无法比拟的优越性。美国专利US7125693 和US7132267公布了 Codexis公司对于该项目的研究，以（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为原 料，采用卤醇脱卤酶催化，控制pH为7左右，40°C条件下，在水相中与氰化钠及氢氰酸反应， 其中氰化钠与底物（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的摩尔比为2. 82,合成了（R)-4-氰基-3-羟 基丁酸乙酯，化学纯为98%，光学纯为99%，收率为67. 13%。后续均是针对上述方法进行 改进研究，如江苏阿尔法药业的CN102168117。但是，现有工艺基本都是以4-卤代-3-羟基 丁酸酯为原料，氰化物与底物的摩尔比过高，由此带来了严重的工业三废问题，并且反应的 路线较长，收率不高，增加了生产成本。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的酶用量过高、反应条件不适当、以及反应转化率较低、反应 步骤较长等缺点，本发明提供一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的卤醇脱卤酶，以 及使用该卤醇脱卤酶进行取代合成6-取代-3, 5-二羟基己酸酯衍生物，进而进一步合成他 汀类药物中间体的酶-化学合成方法。还提供了编码该卤醇脱卤酶的核酸序列，含有该核 酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该卤醇脱卤酶的制备方法，以及该卤醇脱卤酶 在催化取代反应中的用途。
[0007] 本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
[0008] 本发明的第一方面提供了一种卤醇脱卤酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白质：
[0009] (a)由SEQ ID No :4所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[0010] SEQ ID No :4所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有取代卤素的 功能，是一种新的卤醇脱卤酶。
[0011] (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有卤醇脱卤酶活性的蛋白质。
[0012] 其中，所述的"几个"是指2个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个外 分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有卤醇脱卤酶活性。也就是说， 只要由（a)衍生的蛋白质具有卤醇脱卤酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明 的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID No :4所示氨基酸序列蛋白质（a)分子中进行1~ 20个氨基酸残基的突变，仍然保持卤醇脱卤酶活性。
[0013] (c)与（a)的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同一性且具有卤醇脱卤酶活性的蛋白质。
[0014] SEQ ID No :4所示的卤醇脱卤酶和其他已知的卤醇脱卤酶如HheC之间的同一性 为72%。本发明中氨基酸序列如SEQ ID No :4所示的卤醇脱卤酶与已知的卤醇脱卤酶的 氨基酸序列的同一性低于90 %，具有显著的差异性。
[0015] 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Blastp程序进行比对，默认参数。
[0016] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的卤醇脱卤酶。优选 地，所述核酸是由SEQ ID No: 1所示核苷酸序列组成的。
[0017] 由SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境基因组DNA，其可以从 土壤样本中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离得到， 也可以全基因人工合成获得。
[0018] 本发明中，SEQ ID No :1所示的基因命名为BYKY-HhdC，全长780bp。其中，其编码 序列（CDS)从第1个碱基起至第777个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。该 序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No :4所示。
[0019] 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No :4的氨基酸序列的 核酸序列不仅仅局限于SEQ ID No :1。本发明的卤醇脱卤酶基因的核酸序列也可以是编码 序列表中SEQ ID No :4所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入 替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通 过对核酸序列SEQ ID No :1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加 来制得。
[0020] SEQ ID No :1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号 序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有 负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全 替换，可提商目标蛋白的表达水平。
[0021] SEQ ID No :1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No :1所示序列的核 酸进行杂交的核酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的 方式进行；Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有 被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲 液的组成为〇· lwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2~8XSSC ; 20XSSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50~70°C ;在培养几个小 时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组 成为6XSSC+0. lwt% SDS溶液，更优选为5XSSC+0. lwt% SDS ;当用这种清洗缓冲液清洗 完膜后，就可以通过DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
[0022] 本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码卤醇脱卤酶的核酸序列的重 组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码卤醇脱卤酶基因或其突变体的 核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体， 如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选PET系列质粒。较佳的，可通过下述方法制 得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET21a分别用 限制性内切酶Ndel和Xhol双酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有 本发明的编码卤醇脱卤酶的核酸序列的重组表达质粒pET21-BYKY-HhdC或含有编码其突 变体的核酸序列的重组表达质粒。
[0023] 本发明的第四个方面是提供一种包含本发明所述的重组表达载体的重组表达转 化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本 领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明 的卤醇脱卤酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌（E.coli)，更优选E.coli BL21 (DE3)。将前述重组表达质粒pET21-BYKY-HhdC或其突变体转化至E. coli BL21 (DE3) 中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E. coli BL21 (DE3)/pET21-BYKY-HhdC或其突 变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热击法等，较佳地选择热击法进行转化， 热击条件较佳的是：42°C，热击90秒。
[0024] 本发明的第五个方面是提供一种重组卤醇脱卤酶的制备方法，包括如下步骤：培 养本发明所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组卤醇脱卤酶。
[0025] 本发明中催化卤醇进行取代反应的催化剂，可以是上述重组表达转化体的培养 物