胆固醇代谢检测标志物及其应用
【专利摘要】本发明公开了胆固醇代谢检测标志物及其应用。本发明通过研究发现菜油固醇和β?谷固醇可作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物，人体胆固醇吸收过量，提示早发心脏病风险高，患者的得心脑血管疾病的可能性越大，在用药方面，建议以依折麦布为主要药物进行治疗，也可以用考来维仑进行治疗，通过结合胆汁增加LDL清除。本发明发现菜油固醇和β?谷固醇可精准测定胆固醇吸收的动态情况；检测结果可以为医生提供制定病人精准治疗的依据，提导用药，提高治疗效果，有显著临床意义。
【专利说明】
胆固醇代谢检测标志物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及胆固醇代谢检测标志物及其在评估心脑血管疾病药物疗效中的应用。
【背景技术】
[0002] 大量流行病学研究和临床研究均支持低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高是动 脉粥样硬化发生发展的重要危险因素之一。国际和国内血脂异常防治指南一致推荐LDL-C 水平达标是防治冠心病的首要目标。但我国目前血脂控制状况不容乐观。第二次中国临床 血脂控制状况多中心协作研究表明，我国血脂异常控制的总体达标率仅38%，其中低危、中 危、高危和极高危患者的达标率分别为91 %、77%、49 %、38 %。达标率不理想受到他汀类药 物治疗不充分和胆固醇代谢个体差异等多种因素的影响。胆固醇代谢具有低合成高吸收的 特点的患者均对他汀类药物治疗反应不佳，这类患者采用他汀类药物联合胆固醇吸收抑制 药依折麦布(Ezetimibe)治疗可进一步降低LDL-C水平，具有显著的疗效。
[0003] 人体胆固醇代谢和血脂异常与心脑血管疾病密切相关。胆固醇代谢由从胃肠道中 吸收和体内合成两个途径组成。每个人的代谢途径以哪一个为主都可能有所不同，有的人 吸收增多为主，而有的是以体内合成为主。准确了解每个人的胆固醇代谢途径情况，可以制 定出个体化精准治疗高胆固醇血症方案。
[0004] 胆固醇平衡测定就是精准测定胆固醇的吸收和胆固醇的体内合成动态情况。检测 结果可以为医生提供制定病人精准治疗的依据，提高治疗效果。胆固醇肠道吸收明显增高， 可能增加心血管病风险，现有研究发现ABCG5和ABCG8基因突变，植物固醇明显升高，伴有早 发心脏病。
[0005] 精确诊断胆固醇体内合成过剩絮乱，最常见基因性LDL-C增高症，家族性联合高脂 血症;精确诊断胆固醇吸收过多絮乱，大约占人群的25%，伴随显著增加心脑血管疾病风 险；形成最优治疗方案包括生活习惯改变，他汀类治疗抑制胆固醇合成，依折麦布 (已261：；[111；^6)治疗抑制胆固醇吸收，以及考来维仑((：01686￥613111)治疗通过结合胆汁增加 LDL清除
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供胆固醇代谢检测标志物及其应用。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
[0008] 菜油固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。
[0009] 谷固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。
[0010] 菜油固醇和谷固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。
[0011] -种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测菜油固醇 浓度的试剂。
[0012] -种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测谷固醇 浓度的试剂。
[0013] -种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测菜油固醇 和谷固醇浓度的试剂。
[0014] 进一步的，上述试剂盒中还含有能够定量检测7-烯胆留醇、链留醇的试剂。
[0015] 进一步的，上述能够定量检测7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇和谷固醇浓度的试 剂包括7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇和谷固醇的对照品，5a_胆甾烷，正己烷，氢氧化钾 和乙醇。
[0016] 上述任一所述的试剂盒在评估心脑血管疾病药物疗效中的应用。
[0017] 上述任一所述的试剂盒在作为检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒的应用。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 本发明发现菜油固醇和谷固醇可作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物，可精 准测定胆固醇吸收的动态情况;检测结果可以为医生提供制定病人精准治疗的依据，提导 用药，提高治疗效果，有显著临床意义。
【具体实施方式】
[0020] 菜油固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。
[0021] 谷固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。
[0022] 菜油固醇和谷固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。
[0023] 一种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测菜油固醇 浓度的试剂。
[0024] 一种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测谷固醇 浓度的试剂。
[0025] -种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测菜油固醇 和谷固醇浓度的试剂。
[0026]优选的，上述试剂盒中还含有能够定量检测7-烯胆留醇、链留醇的试剂。
[0027] 优选的，上述能够定量检测7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇和谷固醇浓度的试剂 包括7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇和谷固醇的对照品，5a_胆甾烷，正己烷，氢氧化钾和 乙醇。
[0028] 上述任一所述的试剂盒在评估心脑血管疾病药物疗效中的应用。
[0029] 优选的，上述的心脑血管疾病药物为依折麦布、考来维仑、他汀类药物。
[0030] 上述任一所述的试剂盒在作为检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒的应用。
[0031] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0032] 实施例1菜油固醇、谷固醇作为检测胆固醇吸收状况的标志物
[0033] 为了研究菜油固醇、谷固醇是否能作为检测胆固醇吸收的标志物，本实施例对 61例随机的中年男性进行研究，发现菜油固醇和谷固醇与血浆胆甾烷醇的浓度变化呈正 相关(如表1所示）。而血浆中胆留烷醇浓度水平是反应高的肠内胆固醇吸收效率和低的血 浆胆固醇合成的一项重要指标。这证明胆固醇前体固醇和植物固醇可以分别作为胆固醇合 成和吸收标志物。
[0034]表1 2种非胆固醇类固醇与血浆中胆留烷醇浓度的相关性(n = 61)
[0036] *P<〇.〇l;**P<〇.〇5
[0037]另外，对61例41~74岁II型糖尿病患者的胆固醇合成和吸收状况进行观察时发 现，菜油固醇和谷固醇与吸收呈正相关(如表2所示）。
[0038]表2 2种非胆固醇类固醇与胆固醇合成和吸收的相关性(n = 61)
[0040] *P<〇 ? 05;林 P<0 ? 01;稱 P<0 ? 001
[0041] 上述结果进一步说明了菜油固醇和谷固醇与胆固醇合成水平呈负相关性，而与 胆固醇吸收水平呈正负相关性;说明了菜油固醇、谷固醇可以作为检测胆固醇吸收的标 志物。
[0042] 实施例2
[0043]为了进一步研究菜油固醇和谷固醇在检测胆固醇吸收状况中的作用，本发明通 过前期大量实验的研究、验证，最终获得一种可以很好评估人体内胆固醇吸收代谢水平的 公式：
[0045] 其中，7-稀胆甾醇（Lathosterol)比值= Ciath〇ster〇i/TC(比值单位为:_〇1 X 100/ mmol)，即7-烯胆留醇比值为7-烯胆留醇浓度(iiM)/总胆固醇浓度(mM)的比值再乘以100。
[0046] 链甾醇（Desmosterol)比值= Cdesm〇ster〇i/TC(比值单位为:ymol X 100/mmol);即链 甾醇比值为链留醇浓度(yM) /总胆固醇浓度(mM)的比值再乘以100。
[0047] 菜油固醇（Campesterol)比值= Ccampester〇i/TC(比值单位为:讓〇1 X 100/mmol);即 菜油固醇比值为菜油固醇浓度(yM) /总胆固醇浓度(mM)的比值再乘以100。
[0048] 谷固醇（Sitosterol)比值= Csit〇ster〇i/TC(比值单位为：ymol X 100/mmol);即 谷固醇比值为谷固醇浓度(yM)/总胆固醇浓度(mM)的比值再乘以100。
[0049] 当胆固醇平衡得分在0.6~0.9之间，说明人体胆固醇代谢状况正常；
[0050] 当胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3,说明人体胆固醇吸收过量，建议以依 折麦布为主要药物进行治疗。
[0051]实施例3 7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇和谷固醇的定量检测 [0052] 1)对照品溶液的制备
[0053]分别精密称取7-烯胆留醇、链留醇、菜油固醇、谷固醇对照品，以正己烷为溶剂 配成11.00、6.70、18.00、33.OOmg ? I/1溶液，作储备液用。分别取储备液加正己烷稀释配制 成混合对照溶液最高质量浓度7号，每份含4种待测物质，再依次逐级稀释。具体质量浓度见 表3〇
[0054] 表3稀释后各组对照品中的7-烯胆甾醇、链甾醇、菜油固醇、谷固醇的浓度
[0055]
[0056] 2)内标溶液的制备
[0057] 精密称取0.0125g的5a-胆甾烷于25mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，制成内 标对照溶液，置4 °C冰箱备用。
[0058] 3)氢氧化钾溶液的制备
[0059] 称取5.6g氢氧化钾，溶解于10mL超纯水中，冷至室温后用无水乙醇稀释至100mL， 配制成lmol ? I/1的氢氧化钾乙醇溶液，置4°C冰箱备用。
[0060] 4)血浆样品前处理
[00611 取100此待测血浆样品或配制好的对照品溶液置于10mL离心管中，加入10yL 5a-胆甾烷内标溶液，再加入氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，加塞密封，置水浴中皂化;皂化后溶 液冷却至室温，加入3mL正己烷，涡旋混匀离心，将上清液(正己烷层)转移至10mL离心管中； 下层再加入3mL正己烷，涡旋混匀后离心，取出上清液合并，在他下吹干;残渣中加入衍生化 试剂BSTFA-TMCS，置60~80 °C烘箱中进行衍生化反应。衍生化反应后直接取样品进样分析。 [0062] 5)气相色谱-质谱联用法(GC-MS)定性定量分析
[0063]将上步前处理后的样品（1此)用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行全扫描(Scan) 分析，通过标准对照品溶液保留时间对待测样品中各组分进行定性，得到样品的GC-MS全扫 描色谱图。同时采用选择离子监测(sn〇内标法定量，得到样品的选择离子监测(sn〇图。从 而实现同时测定待测血浆中4种非胆固醇类固醇（7-烯胆留醇、链留醇、菜油固醇、e-谷固 醇)含量。
[0064]上述选择离子监测（sn〇扫描过程中选择特征离子（即定性离子)与定量离子的信 息如下所示：
[0066] 分别取表1中1~7号标准溶液100此至lOmL离心管中，除不加血浆外其余按上述测 定方法操作，以目标化合物定量离子与内标定量离子面积比(x)对化合物浓度(y)进行线性 回归，计算各物质的标准曲线，进行定量测定。
[0067] 取血浆样品100此，按照上述测定方法，平行处理3份，记录色谱质谱图，计算出血 浆样品中7-烯胆留醇、链留醇、菜油固醇、谷固醇的浓度。
[0068] 实施例4菜油固醇和谷固醇作为胆固醇吸收代谢检测指标的应用
[0069] 按照实施例3所述的方法，对55份临床血浆样品进行检测，检测出血浆样品中菜油 固醇、谷固醇的浓度(處)（如表4所示），根据该浓度与血浆样品总胆固醇浓度值(mM)分别 计算出7-烯胆留醇比值、链留醇比值、菜油固醇比值、谷固醇比值(如表4所示），最后根据 实施例2中的公式'
，，计算出各临床血浆样 品的胆固醇平衡得分，根据平衡得分得出各临床血浆样品的胆固醇平衡状况(如表4所示）。[0070] 表4临床样品胆固醇吸收状况的检测结果
[0075] 根据表4中的对各临床样品胆固醇平衡状况的评价，指导建议胆固醇平衡不正常 患者的用药，即当胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3,说明人体胆固醇吸收过量，建议 以依折麦布为主要药物进行治疗。表4中胆固醇平衡不正常的患者按照该指导用药治疗4周 后，再检测各患者的胆固醇吸收状况，并统计数量(如表5所示）。
[0076] 表5按本发明检测结果的指导进行用药治疗后的疗效
[0078] 检测结果如表5所示，从中可以看出，胆固醇水平正常的样品数从25份增加到了 32 份，其中，胆固醇吸收过量的样品数从30份降低至23份，并且该23份样品胆固醇吸收过量程 度相比治疗前得到明显改善。上述结果说明，本发明胆固醇吸收代谢检测指标(菜油固醇和 谷固醇)具有很好的准确性和用药指导性。
[0079] 实施例5菜油固醇和谷固醇作为胆固醇吸收代谢检测指标的应用
[0080] 方法：同上，对另外17 2份血浆样品中4种非胆固醇类固醇（7-烯胆甾醇、 链甾醇、菜油固醇和谷固醇）的浓度进行测定，按实施例1所给的公式"胆
，，计算出每份样品的胆固醇平衡得分，根据胆 固醇平衡得分建议和指导相应患者用药，用药12周后分别检测患者的治疗效果。
[0081] 结果：
[0082]检测结果中，有43份血浆样品的胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3,说明该 43份样品的胆固醇吸收过量，建议以依折麦布为主要药物进行治疗;还有129份血浆样品胆 固醇平衡得分在〇. 6~0.9之间，说明胆固醇代谢状况正常。
[0083] 根据上述检测结果，对上述患者分别进行以下治疗，其中43人(胆固醇吸收过量） 进行依折麦布治疗，治疗12周后，观察记录治疗效果，并检测治疗前后菜油固醇和谷固醇 的含量变化。
[0084] 经治疗12周后，各组治疗效果如表6所不。
[0085]表6患者疗效情况
[0088] 经治疗12周后，各组治疗前后菜油固醇和谷固醇的含量如表7所示。
[0089] 表7用药后胆固醇吸收代谢标志物菜油固醇和谷固醇的水平变化
[0091 ] 注:胆固醇代谢标志物单位为mg/L。*表示组内治疗前后相比P小于0.05。
[0092] 从表7中的结果可以看出，对上述43人(胆固醇吸收过量)进行依折麦布治疗后，可 以显著降低菜油固醇和谷固醇的浓度。进一步说明，菜油固醇和谷固醇可以作为胆固 醇吸收代谢检测指标进行应用。
[0093] 综上所述，胆固醇平衡测定就是精准测定胆固醇的吸收、体内合成和代谢的动态 情况，上述各实施例结果说明，本发明发现的菜油固醇和谷固醇可以很好地评估人体内 胆固醇吸收代谢的状况;从而可以为医生提供制定病人精准治疗的依据，提高治疗效果。当 胆固醇平衡得分小于0.6且大于等于0.3,说明人体胆固醇吸收过量，提示早发心脏病风险 高，患者的得心脑血管疾病的可能性越大，有显著临床意义。在用药方面，建议以依折麦布 (Ezetimibe)为主要药物进行治疗。另外，也可以用考来维仑(Colesevelam)进行治疗，通过 结合胆汁增加LDL清除。
[0094] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 菜油固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。2. β-谷固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。3. 菜油固醇和β_谷固醇作为检测胆固醇吸收代谢状况的标志物的应用。4. 一种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有能够定量检 测菜油固醇浓度的试剂。5. -种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有能够定量检 测谷固醇浓度的试剂。6. -种检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有能够定量检 测菜油固醇和谷固醇浓度的试剂。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:该试剂盒中还含有能够定量检测7-烯胆 甾醇、链留醇的试剂。8. 根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于:所述能够定量检测7-烯胆留醇、链甾 醇、菜油固醇和谷固醇浓度的试剂包括7-烯胆留醇、链留醇、菜油固醇和β-谷固醇的对照 品，5α-胆留烷，正己烷，氢氧化钾和乙醇。9. 权利要求4~8任一所述的试剂盒在评估心脑血管疾病药物疗效中的应用。10. 权利要求4~8任一所述的试剂盒作为检测胆固醇吸收代谢状况的试剂盒的应用。
【文档编号】G01N30/02GK106053774SQ201610392778
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】邓杏飞, 潘树球
【申请人】广东佛山国盛医学科技有限公司