，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。"加工的 制品"是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的卤醇脱卤酶进行分离和/或纯化得 到的分离产品、或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化 制品。
[0026] 本发明的第六个方面是提供上述卤醇脱卤酶、重组卤醇脱卤酶或催化剂在催化 邻-卤醇化合物进行取代反应中的应用。
[0027] 在上述应用中，式II所示的邻-卤醇化合物在催化作用下与&M'反应生成式I所 示的卤素被取代的化合物。
[0028]
[0029] 其中，
[0030] X为卤素，优选Cl、Br或I ;
[0031] R为H、具有1_6个碳原子的烷基，优选甲基、乙基、异丙基或叔丁基；
[0032] Μ各自独立地选自-C ( = 0) -、-CH (0H)-或-CH2- ;n为0或1-9的整数；
[0033] 札选自叠氮基、-CN、-OH、-C00R2、或R3R4NCH 2,其中，R2选自具有1-6个碳原子的烷 基或具有6-12个碳原子的芳基，R3和R 4各自独立地选自H、具有2-7个碳原子的烷氧羰基、 具有8-14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6-12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7-19个碳 原子芳基烷基、具有2-7个碳原子的烷基酰基、或邻苯二甲酰亚氨基；
[0034] M'选自碱金属、卤素或H。
[0035] 优选地，式II化合物选自：
[0039] 其中，
[0040] X为卤素，优选Cl、Br或I ;
[0041] R为H、甲基、乙基、异丙基或叔丁基。
[0042] 更优选地，式II化合物选自：
[0043]
[0044]
[0045]
[0046] ^RcT，
[0047] X为卤素，优选Cl、Br或I ;
[0048] R为Η、甲基、乙基、异丙基或叔丁基。
[0049] 上述的式II化合物可以通过本领域常规的反应制备，也可以由式III所示的内酯 化合物制备而成：
[0050] ^
' 6
[0051] 当使用内酯化合物作为原料时，可将式III所示的内酯化合物在溶剂中开环生成 邻-卤醇化合物，然后不经后处理直接在上述卤醇脱卤酶、重组卤醇脱卤酶、或催化剂的催 化作用下与&Μ'反应，生成如下式I所示的卤素被取代的化合物；
[0052]
[0053]
[0054] 其中，
[0055] X为卤素，优选Cl、Br或I ;
[0056] R为H、具有1_6个碳原子的烷基，优选甲基、乙基、异丙基或叔丁基；
[0057] 札选自叠氮基、-CN、-OH、-C00R2、或R3R4NCH 2,其中，R2选自具有1-6个碳原子的烷 基或具有6-12个碳原子的芳基，R3和R 4各自独立地选自H、具有2-7个碳原子的烷氧羰基、 具有8-14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6-12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7-19个碳 原子芳基烷基、具有2-7个碳原子的烷基酰基、或邻苯二甲酰亚氨基；
[0058] M'选自碱金属、卤素或H。
[0059] 优选地，式III化合物选自：
[0060]
[0061] 其中，
[0062] X为卤素，优选Cl、Br或I。
[0063] 本发明上述式III所示的内酯化合物的开环反应可参照本领域此类反应的常规 条件进行。较佳地，在碱性条件下水解开环。
[0064] 本发明上述取代反应的反应条件可按照本领域此类反应的常规条件进行选择。较 佳地，所述应用包括下述步骤：在PH7. 0-9. 0的甲醇水溶液中，在上述催化作用下，邻-卤醇 化合物进行取代反应。
[0065] 优选地，邻-卤醇化合物或内酯化合物在反应液中的浓度为l-800mmol/L ;卤醇脱 卤酶用量为催化有效量，较佳地为〇. l_50g/L ;反应试剂&M'的浓度为l-1100m〇l/L。所述 溶液可以为本领域常规的缓冲液，只要其pH范围在7. 0-9. 0即可，优选磷酸盐缓冲液。磷 酸盐缓冲液的浓度较佳为〇. 05-0. lmol/L，所述浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所 述甲醇的浓度优选为5~50% (V/V)。所述取代反应优选在振荡或搅拌条件下进行。所述 取代反应的温度优选30-50°C。所述取代反应的时间较佳的以反应过程中，底物剩余浓度低 于5%的时间为准。取代反应结束后，可按照本领域常规方法从反应液中提取产物。
[0066] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 施例。本发明所用试剂和原料均可市售获得。
[0067] 本发明的积极进步效果在于：针对已报道的合成他汀类药物及其中间体的工艺中 氰化物与底物的摩尔比过高、工业三废问题严重、反应路线较长、收率不高、生产成本增加 等缺点，提供一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的卤醇脱卤酶，以及使用该卤醇脱 卤酶进行取代合成6-取代-3, 5-二羟基己酸酯衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体 的酶-化学合成方法。使用本发明方法制备所得的产物收率高，纯度高，溶剂易回收，反应 条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
【附图说明】
[0068] 图1是卤醇脱卤酶基因 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0069] 图2是卤醇脱卤酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。Μ为分子量标准，A泳道为诱 导前，B泳道为诱导后。
【具体实施方式】
[0070] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0071] E. coli DHlOb和E. coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限 责任公司。
[0072] 实施例1 :脱卤酶的酶活力测定
[0073] 卤醇脱卤酶的活性：通过在含有50mM Tris_S04 Buffer及一定浓度底物的反应体 系中测定卤离子的浓度来评估酶的催化效率。
[0074] 试剂I :0. 25 M NH4Fe (S04)2溶于9 Μ ΗΝ03 ;用8倍体积的三蒸水稀释。
[0075] 试剂11 :Hg (SCN)溶于无水乙醇的饱和溶液。
[0076] (1)底物是2-溴乙醇，用溴化钾或溴化钠做标准曲线；用紫外分光光度计测定其 在460nm吸收值，以水为空白对照。
[0077] (2)另外一个做法是用氯代物做底物，用氯化钾或氯化钠做标准曲线；
[0078] 实施例2 :筛选脱卤酶
[0079] 米集土壤样品 DNA(Chroma Spin TE-1000, Clontech Laboratories，Inc. , USA)， 用Sau3AI部分酶切，电泳收集2-8kb的片段，回收并连接到pUC19的BamHI位点，得到质粒 文库。将文库转化到E. coli DHlOb并涂布到含有100ug/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选 阳性克隆到加有500uL LB(100ug/mL氨苄青霉素）的96深孔孔板，37°C培养4小时后加 ImM IPTG诱导，30°C继续培养过夜；然后各取50uL深孔培养物到含有50mM磷酸钠缓冲液 (PH7. 5)的新的96孔板，-80°C反复冻融使细菌裂解；加入2mM 6-氯-3, 5-二羰基己酸叔 丁酯以及实施例1中的试剂I与试剂II，30°C温浴4小时，460nm测吸光度，挑取吸光度最 高的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测序。用NCBI的0RF Finder分析其开放读码框 (0RF)，得到0RF核苷酸序列Seq ID N0 :1，并进一步得到其编码的氨基酸序列SEQ ID No : 4。
[0080] 实施例3 :脱卤酶重组菌的构建和表达
[0081] 合成引物对Pl(核苷酸序列为Seq ID N0:2)和P2(核苷酸序列为Seq ID N0:3)。 使用PI和P2克隆全长卤醇脱卤酶基因。
[0082] PCR 体系如下：10 X KOD-Plus PCR buffer 2 μ L，25mM MgS041. 2 μ L，2mM dNTP 2 μ L，KOD-Plus PCR 高保真酶 0· 3 μ L，DNA 模板 0· 5 μ L (含 DNA 模板 0· 1 μ g)，ddH20 13 μ L， PI 和 P2 各(λ 5 μ L (lOmmol/L)。PCR扩增步骤为：（1) 95°C，预变性 3min ; (2) 98°C，变性 15s ; (3) 58°C退火 30s ; (4) 72°C延伸 lmin ;步骤（2)~（4)重复 30 次；（5) 72°C继续延伸 10min， 冷却至4°C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700~ 800bp区间的目标条带（见图1)，获得一条完整的基因序列，经DNA测序，全长780bp。
[0083] PCR产物用Ndel/Xhol酶切后连接到pET21a原核表达载体，并转化到E. coli BL21(DE3)感受态细菌，在含有卡那霉素（50ug/mL)的LB平板培养，挑选阳性菌落（重组大 肠杆菌）接种到l〇〇ml液体LB培养基进行培养。过夜培养物转入1L新鲜的LB培养基，培 养到〇D 6。。至0. 6-0. 8,加入IPTG至终浓度为200uM诱导重组蛋白表达，降温至30°C继续培 养24