一种乳酸乳球菌胆汁耐受能力提高的胆盐水解酶变异体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种乳酸乳球菌胆汁耐受能力提高的胆盐水解酶变异体，属于酶工程 领域。
【背景技术】
[0002] 结合胆盐是胆汁酸与甘氨酸或牛横酸结合并W钢盐或钟盐形式存在的一类重要 的胆汁组分，其在脂肪的乳化和增溶中发挥着必不可少的作用；同时，结合胆盐的双亲性使 其具有扰乱细胞膜脂质双分子层的特性，从而干扰细胞稳态而呈现出抗菌性。
[0003] 胆盐水解酶(B細)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，能 够水解肠道内的结合态胆盐形成氨基酸和游离胆汁酸。其功能体现在两个方面:一、对人类 宿主的作用。由于经B甜作用后产生的游离胆汁酸会与肠道中的钢盐/钟盐形成去结合型胆 盐，该去结合型胆盐比水解前的结合态胆盐重吸收效率降低，从而会随粪便排出，而胆固醇 的主要去路是转变成结合胆盐，因此通过BSH的水解作用可W使胆固醇不断向合成结合胆 盐的方向进行W保证肠道内结合胆盐与脂质物质的平衡，从而消耗体内更多的胆固醇，达 到降低血清胆固醇的目的。二、对微生物的作用。B細是肠道微生物为了抵抗胆盐得W生存 而产生的一种代谢产物;经B甜作用形成的氨基酸既可W作为营养物质被菌体利用，又能够 解除结合胆盐的毒害作用，提高益生菌的胆汁耐受能力及肠道定植能力。
[0004] 因此，运用基因工程手段获得能够提高乳酸菌菌株胆汁耐受性的BSH可W为研究 BSH作用于菌体自身和宿主提供技术平台，也为应用口服活菌细胞疗法控制人体血清胆固 醇水平提供了一种有效提高菌体细胞胆汁耐受和肠道定植能力的技术方法。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，本发明通过基因改组的方法对胆盐水解酶进行定向进化，并 将进化的胆盐水解酶基因在乳酸乳球菌中进行表达，通过高通量筛选的方法获得增强乳酸 乳球菌胆汁耐受能力优于野生型酶蛋白BSH1的胆盐水解酶变异体的编码序列及携有胆盐 水解酶变异体的乳酸菌。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种胆盐水解酶变异体，所述变异体的氨基酸序列是 沈Q ID NO: 1所示的序列。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述变异体的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[000引本发明的第二个目的是一种乳酸菌重组菌，所述重组菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的胆盐水解酶变异体。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌为乳酸乳球菌。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000。 [0011 ] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌，WpNZ8148为表达载体，WLactococcus lactis NZ9000为宿主表达胆盐水解酶变异体；
[0012]本发明还提供所述变异体在食品、农业或制备药物方面的应用。所述应用是用于 微生态制剂、药物表达载体或饲料添加剂。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] 本发明的胆盐水解酶变异体，底物专一性得到显著提高，仅对胆盐中的甘氨(GCA) 和牛横(TCA)结合胆盐具有水解能力。同时本发明的变异体能提高菌株对胆汁的耐受性能， 表达本发明的胆盐水解酶突变体的基因工程菌，在胆盐胁迫15h后，比携有野生型BSH的工 程菌的胆汁耐受能力提高了近1.3倍。本发明为开发具有较高胆汁耐受能力的益生菌制剂 及改善胆汁组成的微生态制剂奠定了基础，本发明获得的乳酸乳球菌菌株和胆盐水解酶变 异体可用于食品、医药、农业等领域，如用作微生态制剂、药物表达载体、饲料添加剂等，胆 盐水解酶变异体可用于开发为重组蛋白产品，亦可用作基因工程表达系统的筛选标记及菌 种的分子改造。
【附图说明】
[001引图1:BSH基因改组示意图；
[0016]图2:携有B甜变异体活性与野生型B細重组菌株胆汁耐受能力的比较。NZ-bshlv: 含有B甜变异体活性的重组菌株L.lactis NZ9000-pNZ8148-bsh;NZ-bshl:含有野生型BSH 的重组菌株L. lactis NZ9000-pNZ8148-bshl;
[0017]图3:BSH变异体与野生型酶蛋白的活力比较;NZ-bshlv:含有BSH变异体活性的重 组菌株L.lactis NZ9000-pNZ8148-bsh胞内胆酸生成量;NZ-bshl:含有野生型B甜的重组菌 株L. lactis NZ9000-pNZ8148-bshl胞内胆酸生成量；
[0018] 图4:B細变异体与野生型酶蛋白底物特异性的比较;六种底物分别为甘氨结合胆 盐(GCA)、甘氨脱氧结合胆盐(GDCA)、甘氨碟脱氧结合胆盐(GCDCA)、牛横结合胆盐(TCA)、牛 横脱氧结合胆盐(TDCA)、牛横碟脱氧结合胆盐(TCDCA)。
【具体实施方式】
[0019] 菌体细胞胆汁耐受性的测定方法:诱导4h的菌体细胞(菌体ODsoonm值约为2.0)按 4%(w/v)接种量转接至含有0. l%(w/v)猪胆盐和5ng/mL(w/v)的GM17培养基中，于30°C静 置培养，间隔一定时间测定菌体浓度(0化00Γ?值），制作生长曲线。
[0020] 胆盐水解酶活力的测定方法:收集菌体，用超纯水洗涂离屯、2次，于105°C烘干至恒 重，按Img菌体干重加入ImL 70 % (v/v)甲醇溶液的比例重悬，超声破碎7min(工作时间：间 歇时间= 2:4)，离屯、收集上清液，取10化上清液采用HPLC-MS检测胞内胆酸含量。根据单位 菌体干重中胆酸的含量评价酶蛋白的活力。
[0021 ]胆盐水解酶底物特异性测定方法:收集菌体，用0.1M憐酸盐缓冲液(pH 6.0)洗涂 离屯、2次，调整菌浓在600nm下吸光度为5。取1血上述细胞悬浊液，超声破碎7min(工作时间： 间歇时间= 2:4)，离屯、收集上清液。取10化上清液用0.1M憐酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μ L，加入10化结合胆盐(200mM)混合，于37°C解育30min，加入等体积的15 % (w/v)S氯乙酸终 止反应，离屯、后取10化上清液与19化L巧Ξ酬试剂混合，于100°C反应15min，冷却后于570皿 处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，巧Ξ酬试剂的组成为:0.5mL l%(w/ V)巧Ξ酬(溶解于0.5M、p册.5巧樣酸盐缓冲液），1.2mL甘油，0.2血0.5M、p册.5的巧樣酸缓 冲液。六种底物分别为甘氨结合胆盐(GCA)、甘氨脱氧结合胆盐(GDCA)、甘氨碟脱氧结合胆 盐(GCDCA)、牛横结合胆盐(TCA)、牛横脱氧结合胆盐(TDCA)、牛横碟脱氧结合胆盐(TCDCA)。
[0022] 实施例1:B甜的基因改组
[0023] 基因改组流程如图1所示。
[0024] 1)从唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LMG14476提取基因组DNA作模板， 进行PCR扩增，引物为：
[0025] bshl-F: 5' -ATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGGTA-3'（序列如沈Q ID NO: 3)
[0026] bshl-R:5'-TTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTTT-3'（序列如沈Q ID N0:4)
[0027] bsh2-F:5'-ATGTGTACATCGATTTTATATACTGCTGGC-3'（序列如沈Q ID N0:5)
[002引 bsh2-R:5'-TTAATTTTGCATATTAATTGATTGGTGGCTA-3'（序列如沈Q ID N0:6)
[0029] 参照KOD-Plus-Neo试剂盒说明书配制PCR反应体系;PCR扩增条件为:95°C预变性 5min; 95°C 变性 30s，45°C 退火 60s，68°C 延伸 Imin，5 个循环；95°C 变性 30s，55°C 退火 60s，68 °C延伸lmin，25个循环;68°C延伸lOmin。
[0030] 2)基因改组的流程为：取等量的bshl和bsh2的PCR产物混合，进行随机片段化模 块，加入面ase I进行随机降解，得到50-200bp的片段;随