细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，设及细菌中二十碳五締酸生物合成途径中必需的酶 蛋白憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶抗体的制备及检测方法。
【背景技术】
[0002] 细菌化ewanella sp.AclO是分离于海水的一株低溫菌，其能够在低溫下很好的生 长，并生产二十碳五締酸。二十碳五締酸具有抗氧化、抗衰老、预防屯、脑血管疾病的作用。也 可大大降低患肿瘤的风险。对人类的运些益处让科学家对二十碳五締酸极为关注，表明其 有广阔的应用价值，仅存于植物和海洋生物中，是人体生活所必须的，但人与动物不能合 成。因此利用生物合成法是生产二十碳五締酸的一个替代途径。
[0003] 细菌合成二十碳五締酸过程中必须要有憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶的参与。憐酸 泛酷琉基乙胺基转移酶能够将辅酶A上的憐酸泛酷琉基乙胺基转移到酷基载体蛋白的丝氨 酸残基上，近年来植物中该酶参与合成多不饱和脂肪酸的路径已经阐释清楚，而细菌中合 成多不饱和脂肪酸的机制仍然未知，研究细菌中憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶在二十碳五締 酸合成中的作用显得尤为迫切。为了研究该酶在细菌生产二十碳五締酸的分子机制作用， 制备与检测其抗体是一个必须的前提基础。目前尚未有与细菌憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶 抗体制备及检测方法的相关报道。
【发明内容】
[0004] 为了解决W上问题，本发明的第一目的是提供了一种细菌来源的憐酸泛酷琉基乙 胺基转移酶的基因序列。
[0005] 本发明的第二目的是提供该憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶兔来源的多克隆抗体的 制备方法。
[0006] 本发明的第Ξ目的是提供该憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶兔来源的多克隆抗体的 检测方法。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[000引一、细菌化ewanella sp.AclO的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶具有沈Q ID No.l的 基因序列，或者具有序列表SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
[0009] 二、细菌憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶制备抗体的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)原核表达纯化憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶；
[0011] (2)制备更高纯度的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶；
[0012] (3) W更高纯度的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶为抗原蛋白，采用常规多克隆抗体 制备方法制备抗血清；
[0013] (4)将抗血清进行抗体纯化处理。
[0014] 步骤（1)中，原核表达纯化憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶又包括克隆如SEQ ID No. 1 的核酸序列，构建重组质粒，转化入大肠杆菌原核表达，收集菌体裂解菌体后纯化蛋白。
[0015] 步骤(2)中，更高纯度的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶的制备方法为，取纯化后的憐 酸泛酷琉基乙胺基转移酶进行聚丙締酷胺凝胶电泳，然后进行凝胶染色，染色后将憐酸泛 酷琉基乙胺基转移酶蛋白于聚丙締酷胺凝胶中切下，将切下的胶块置于透析袋中、并于电 泳槽中进一步电泳，将蛋白完全析出，并去除胶块，浓缩获得更高纯度的抗原蛋白。
[0016] 步骤(3)中，常规多克隆抗体制备方法为，将更高纯度的抗原蛋白采用兔耳皮下注 射法免疫2~3kg的白兔，500yg每次，2~3周免疫一次，共免疫3~5次，收集血清。
[0017] 步骤(4)中，抗体纯化处理是将抗原蛋白与M-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将 所得抗血清与PBS等量混合后，缓慢经过层析柱，待抗体与抗原结合后用甘氨酸洗脱缓冲液 洗脱，获得纯化的抗体。
[0018] Ξ、细菌憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶的多克隆抗体的检测方法，通过化ISA方法确 定抗体针对抗原的效价，效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，纯化制备得多克隆 抗体，并利用Western blotting检测。
[0019] 本发明的有益效果是:本发明得到了细菌憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶并且制备得 到了该蛋白的多克隆抗体，W及该蛋白的化ISA检测方法和Western Blotting检测方法，为 进一步开展憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶功能分析奠定基础，为多聚不饱和脂肪酸在细菌中 的合成路径的阐释提供证据。
【附图说明】
[0020] 图1为双酶切核酸电泳示意图；
[0021] 图2为表达质粒祀T21a-Ppt示意图；
[0022] 图3为蛋白纯化SDS-PAGE分析图；
[0023] 图4为目的蛋白SDS-PAGE电泳图谱；
[0024] 图5为细菌憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶多克隆抗体的Western Blotting分析图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发 明的限制：
[00%] 实施例1
[0027]细菌憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶转移酶蛋白的表达纯化按W下步骤进行：
[00%] (1)克隆酶蛋白基因序列
[00巧]通过比对6]16]113日证提供的化〇*日]1611日89.5〔24,5116*日]1611日39.4。10等菌株的憐 酸泛酷琉基乙胺基转移酶同源基因序列，设计引物F1与R1 (见表1 )。扩增W Shewanellasp.AclO基因组为模板，扩增反应体系如下：10 XPCR反应缓冲液化1，25mmol/L MgS〇4 化l，10mmol dNTP 扣l，10nmol/L引物各化1，基因组DNA模板80ng，KoD-Plus DNA聚 合酶化1，双蒸去离子水定容至50μ1。反应条件为:95°C预变性5min; 95°C30s，55°C30s，68°C 延伸1.30min，共计30个循环;68°C延伸lOmin; 15°C保持lOmin。将PCR扩增产物经1 %琼脂糖 凝胶电泳后，切胶回收，克隆测序，测序由ABI3100测序仪完成。
[0030]表1实验中的引物序列表
[0031]
[0032] (2)构建重组质粒
[0033] 上述PCR产物回收后经限制性内切酶Ndel和EcoRI双酶切，与经相同限制内切酶消 化的商业化载体pET2la( + )进行琼脂糖凝胶电泳、切胶回收，如图1所示：ladder为marker， pET21a( + )为载体祀T21a( + )经Nde巧此coRI双酶切的产物，PCR product为上述PCR产物经 Nde巧此coRI双酶切。双酶切后的祀T21a( + )与PCR产物再经高效DNA连接酶Hi曲Ligation (T0Y0B0)催化连接，构建出基因表达质粒祀T2 la-Ppt，如图2所示为表达质粒祀T2 la-Ppt示 意图。
[0034] (3)将重组质粒祀T21a-Ppt转化大肠杆菌化2UDE3)
[00巧]经测序无突变的重组质粒pET21a-Ppt转化大肠杆菌化2UDE3)表达宿主，筛选阳 性克隆。将阳性克隆置于1000ml含有终浓度为50μg/ml的Amp LB培养基中，37°C培养4小时， 待0〇6日日达到0.6时，转入28°C培养并添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养至0〇6日日为2.0，4°C 离屯、收集菌体。
[0036] (4)纯化重组蛋白
[0037] WTriS-HC1 (20mM，pH 8.0) 100ml重新悬浮上述收集的菌体。超声破碎15分钟，4°C 离屯、1小时，收集上清液并利用Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化蛋白，蛋白纯化系统采用 Biologic(BIORAD)蛋白纯化系统。通过10%SDS-PAGE检测各收集管中蛋白W收集目的蛋 白，结果如图3所示，Μ为marker,序号1~10对应为1~10号收集管中的重组蛋白。
[003引实施例2
[0039] 细菌憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶制备抗体方法包括W下步骤：
[0040] (1)制备更高纯度的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶；
[0041] (2) W更高纯度的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶为抗原蛋白，采用常规多克隆抗体 制备方法制备抗血清；
[0042] (3)将抗血清进行抗体纯化处理。
[0043] 步骤(1)中，更高纯度的憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶的制备方法为，取纯化的后的 憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶进行聚丙締酷胺凝胶电泳，然后进行凝胶染色，染色后将憐酸 泛酷琉基乙胺基转移酶蛋白于聚丙締酷胺凝胶中切下，将切下的胶块置于透析袋中、并于 电泳槽中进一步电泳，将蛋白完全析出，并去除胶块，浓缩获得更高纯度的抗原蛋白。如图4 所示，Μ为marker，1号为更高纯度的抗原蛋白。
[0044] 步骤(2)中，常规多克隆抗体制备方法为，将更高纯度的抗原蛋白采用兔耳皮下注 射法免疫化g的白兔，500yg每次，3周免疫一次，共免疫5次，收集抗血清。
[0045] 步骤(3)中，抗体纯化处理是将抗原蛋白与M-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将 所得抗血清与PBS等量混合后，缓慢经过层析柱，待抗体与抗原