2,4-二羟基丁酸的生产方法
【专利说明】2,4-二超基Τ酸的生产方法
[0001] 本发明设及通过使用合成途径从苹果酸生产2,4-二径基下酸的新方法，合成途径 包含分别具有苹果酸激酶，苹果酸半醒脱氨酶，和2，4-二径基下酸脱氨酶活性的酶。
[0002] 本申请中引用的簇酸在其盐(如2,4-二径基下酸盐)或酸（如2,4-二径基下酸)形 式下是等同命名的。
[000引2,4-二径基下酸(等同2,4-D皿或D皿)是有相当经济效益的化合物。通过调整适合 的抑，可W在水介质中容易地将D皿转化为α-径基-丫-下内醋。α-径基-丫-下内醋是生产在 动物营养中有很大市场的甲硫氨酸物2-径基-4-(甲硫基）-下酸化ΜΤΒ)的重要前体(Deck et al. ,2008)。目前，α-径基-丫-下内醋通过包含丫-下内醋在α位置的面化，并随后在碱性 介质中W径基替代面素原子的多阶段反应衍生自丫 -下内醋(Deck et al. ,2008)。
[0004] 由于油价的增长，从可再生资源生产D皿的需要升高。微生物能够将源自生物质的 原料，如糖或有机酸，转化为大量各种不同的化学化合物(Werpy&Petersen，2004)。随着生 物化学和基因组学信息量的增长，可W修饰微生物W使其能W高产量和产率过量生产天然 发生的代谢中间体(Bailey, 1991)。生产微生物的优化经常需要合理的代谢网络工程，运确 保其中目标代谢物的生物合成所需的酶过量表达，并减轻产物的反馈抑制。另外的可能性 是使用能催化目标代谢物生产的新酶系统。
[0005] 代谢工程方法和酶催化需要生化和产生目标代谢物的代谢途径调节方面的详细 知识。在生产D皿的情况下，运些信息是无法获得的。仅有少量研究报道了班巧酸半醒脱氨 酶缺乏症患者中的D皿发生(Shinka et al.2002)，然而没有确定D皿生产中设及的酶反应。 因此，D皿的发酵或酶生产需要（i)确定能将易得到的前体转化为D皿的热力学可行途径， (ii)确定或构建途径中能够催化各反应步骤的酶和（iii)在适合的生物生产中，途径酶的 功能表达。
[0006] 本发明目的是为满足运些需求。
[0007] 因此，本发明的一个目的是生产2,4-D皿的方法，包括使用苹果酸激酶将苹果酸转 化为4-憐酸-苹果酸的第一步骤，使用苹果酸半醒脱氨酶将4-憐酸-苹果酸转化为苹果酸-4-半醒的第二步骤，使用D皿脱氨酶将苹果酸-4-半醒转化为2，4-D皿的第Ξ步骤。
[0008] 在第一个反应中（见图l(i))，通过具有苹果酸激酶活性的酶的作用，苹果酸（1)被 转化为4-憐酸-苹果酸(2) (A)。在第二个反应(B)中，通过具有苹果半醒脱氨酶活性的酶的 作用，4-憐酸-苹果酸被转化为苹果酸-4-半醒(3)。更准确地，反应(B)是由在生物合成途径 意义中具有脱憐酸4-憐酸-苹果酸还原酶活性的酶来催化。在第Ξ反应(C)中，通过具有D皿 脱氨酶活性的酶的作用，苹果酸-4-半醒被转化为DHB。更准确地，反应(C)是由在生物合成 途径意义中具有苹果酸-4-半醒还原酶活性的酶来催化。
[0009] 目前为止在活细胞中既没有描述过也没有确认过上面引用的酶和中间产物。运样 苹果酸激酶，苹果酸半醒脱氨酶，D皿脱氨酶和4-憐酸-苹果酸是本发明进一步的目的。
[0010] 在本发明另外一个方面中，生产2,4-D皿方法的第一步骤包括苹果酸激酶，其特征 在于其能将苹果酸转化为4-憐酸-苹果酸。所述酶可W通过酶的至少一个突变获得，所述突 变改进了突变酶对苹果酸的活性和/或底物亲和力。
[0011] 在本发明中，表述"改进活性和/或底物亲和力"意思是突变前的酶，要么是
[0012] -不能使用底物(苹果酸，4-憐酸-苹果酸或苹果酸-4-半醒），和/或
[001引 低于最大特定速率的至少3倍的速率（at a maximum specific rate at least three times lower)来合成反应产物(4-憐酸-苹果酸或苹果酸-4-半醒或D皿），和/ 或
[0014] -对苹果酸，4-憐酸-苹果酸，或苹果酸-4-半醒具有低于至少3倍(at least three times lower)的亲和力，和/或
[0015] -对天然底物(天冬氨酸，4-憐酸-天冬氨酸，天冬氨酸-4-半醒)具有高于至少3倍 (at least Stimes higher)的亲和力。
[0016] 在其另外一个方面，本发明设及苹果酸激酶将苹果酸转化为4-憐酸-苹果酸的用 途。
[0017] 苹果酸激酶的活性可W通过实施例1中描述的酶现聯来现慢(见"酶测定'）。
[0018] 根据本发明另外一个方面，苹果酸激酶可W通过突变天冬氨酸激酶获得。
[0019] 图2显示了不同生物来源天冬氨酸激酶的氨基酸序列比对。所有氨基酸位置的参 照是基于大肠杆菌LysC基因编码的天冬氨酸激酶氨基酸序列（SEQ ID No.4所示)来制作。 通过与下列酶如图2中所示的简单序列比对，本领域技术人员可W容易地发现来自不同生 物的其他天冬氨酸激酶中对应保守区域的相对位置：
[0020] -AKIII-大肠杆菌天冬氨酸激酶111(沈Q ID No.4)，
[0021 ] -AKI(沈Q ID No.87)大肠杆菌天冬氨酸激酶I，
[0022] -41(11(569 10齡.88)-大肠杆菌天冬氨酸激酶11，
[0023] -MJ-詹氏甲烧球菌（Methanococ州S jannaschii)(沈Q ID No.89)，
[0024] -ΤΤ-嗜热栖热菌（Thermus thermophilusKSEQ ID No.90)，
[00巧]-CG-谷氨酸棒杆菌（Corynebacteri皿 glutami州m)(沈Q ID No.91)，
[0026] -AT-拟南芥（Arabidopsis thaliana)(沈Q ID No.92)，
[0027] -SC-酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)(沈Q ID No.93)。
[002引所述比对可WWClustalW2软件完成。例如，SEQIDNo.4所示天冬氨酸激酶的 El 19残基对应拟南芥天冬氨酸激酶的E207残基（SEQ ID No. 50)或对应于酿酒酵母天冬氨 酸激酶的E147残基(SEQ ID No.51)。
[0029] 与野生型酶相比，根据本发明的突变天冬氨酸激酶包括至少一个在至少一个下列 位置的突变:539，了45，￥115店119，。184和/或5201，其中所述位置天然发生的氨基酸被其他 19个天然存在的蛋白氨基酸的任一个取代，即被丙氨酸，精氨酸，天冬酷胺，天冬氨酸，半脫 氨酸，谷氨酸，谷氨酷胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸， 脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，或鄉氨酸任一所取代。
[0030] 在非排他的例子中，使用大肠杆菌天冬氨酸激酶Lys C作为模板验证了通过定点 突变构建苹果酸激酶。根据本发明的一个方面，通过W天冬酷胺，谷氨酷胺，半脫氨酸，脯氨 酸，丝氨酸，苏氨酸，鄉氨酸或甘氨酸任一来替代119位上的谷氨酸，LysC的底物特异性向苹 果酸改变。
[0031 ] 在本发明进一步的方面中，苹果酸激酶由SEQ ID No.9,更具体的由SEQ ID No.12,沈Q ID No.14,沈Q ID No.16,沈Q ID No.18,沈Q ID No.20,沈Q ID No.22,沈Q ID No.24或沈Q ID No.26表示。
[0032] 天冬氨酸激酶通常受甲硫氨酸，苏氨酸或赖氨酸的抑制。因此，通过天冬氨酸激酶 随机或定点突变来构建的苹果酸激酶也会受所述氨基酸的抑制。在本发明进一步的方面 中，苹果酸激酶受甲硫氨酸，苏氨酸或赖氨酸的抑制被苹果酸激酶的突变减轻。
[0033] 在本发明具体的方面中，至少一个下列氨基酸E250，M318，S321，V339，S338，F324， L325，V339，S345，E346，D340，Τ344和/或T352的突变使得上面描述的突变的LysC(苹果酸激 酶)对赖氨酸抑制不敏感(见实施例3)。
[0034] 本发明也包括运样修饰过的酶，和更具体的由沈Q ID No.39,沈Q ID No.41，SEQ ID No.43或沈Q ID No.45所示的那些酶。
[0035] 在再进一步的方面中，根据本发明的生产2,4-D皿方法的第二步骤包括苹果酸半 醒脱氨酶，其特征在于其能将4-憐酸-苹果酸转化为苹果酸-4-半醒，所述酶具有在生物合 成途径意义中的脱憐酸4-憐酸-苹果酸还原酶活性。
[0036] 苹果酸半醒脱氨酶活性可W通过实施例4中描述的酶测试来测量(见"酶测定"）。
[0037] 该酶可W通过酶的至少一个突变得到，所述突变改进了突变酶对4-憐酸-苹果酸 的活性和/或底物亲和力。
[0038] 根据另外一个方面，可W通过突变具有报导的半醒脱氨酶活性，更具体的具有反 应还原意义中的脱憐酸活性，更具体的作用于由3,4,或5个碳原子组成的有机分子的酶来 获得本发明的苹果酸半醒脱氨酶。在本发明具体的方面中，所述苹果酸半醒脱氨酶是通过 突变天冬氨酸半醒脱氨酶来获得。
[0039] 天冬氨酸半醒脱氨酶，大肠杆菌的Asd和酿酒酵母的化m2天然地显现对4-憐酸-苹 果酸2的脱氨酶活性。
[0040] 根据本发明另外一个方面，可W通过突变天冬氨酸半醒脱氨酶来改进苹果酸半醒 脱氨酶。
[0041] 图3显示了不同生物来源天冬氨酸半醒脱氨酶的氨基酸序列比对。所有氨基酸位 置的参照是基于大肠杆菌Asd基因编码的天冬氨酸脱氨酶(如SEQ ID No.20所示)来制作。 通过与下列酶如图4中所示的简单序列比对，本领域技术人员可W容易地发现来自不同生 物的其他天冬氨酸半醒酶中对应保守区域的相对位置：
[0042] -EC-大肠杆菌（SEQ ID No.49)，
[0043] -MJ-詹氏甲烧球菌(SEQ ID No.94)，
[0044] -ΤΤ-嗜热栖热菌（SEQ ID No.95)，
[004引 -BS-枯草芽抱杆菌(SEQ ID No.96)
[0046] -CG-谷氨酸棒杆菌(SEQ ID No.97)，
[0047] -AT-拟南芥（SEQ ID No.98)，
[004引-SC-酿酒酵母（SEQ ID No.99)。
[0049] 所述比对可WWClus化1W2软件容易地完成。
[0050] 具有改进的苹果酸半醒脱氨酶活性的酶的构建可W如下完成。
[0051] 根据本发明的苹果酸半醒脱氨酶在具体方面对应天冬氨酸半醒脱氨酶，与野生型 酶相比，其包括至少一个在至少一个了136,9162，1230,6241和/或肥74位置的突变，其中所 述位置天然发生的氨基酸被其他19个天然存在的蛋白氨基酸的任一个取代，即被丙氨酸， 精氨酸，天冬酷胺，天冬氨酸，半脫氨酸，谷氨酸，谷氨酷胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨 酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，或鄉氨酸任一所 取代。
[0052] 如实施例5所验证，大肠杆菌asd的定向诱变可W改进突变的酶对4-憐酸-苹果酸 的活性和底物亲和力，同时减少酶对其天然底物4-憐酸-天冬氨酸的偏好。
[0053] 为了改进Asd对4-憐酸-苹果酸的活性，并根据本发明的一个方面，通过定向诱变， E241被谷氨酷胺，丙氨酸，半脫氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸或甲硫氨酸残基所替代(实 施例5)。
[0054] 在本发明进一步的方面中，苹果酸半醒脱氨酶由SEQ ID No.68,和更具体的由SEQ ID No.54,沈Q ID No.56,沈Q ID No.58,沈Q ID No.60,沈Q ID No.62,沈Q ID No.64或 沈Q ID No.66表示。
[0055] 在其另外一个方面中，本发明设及苹果酸半醒脱氨酶将4-憐酸-苹果酸转化为苹 果酸-4-半醒的用途。
[0056] 在另外一个方面中，根据本发明的生产2,4-D皿方法的第Ξ步骤包括D皿脱氨酶， 其特征在于其将苹果酸-4-半醒转化为2,4-D皿，所述酶具有在生物合成途径意义中的苹果 酸-4-半醒还原酶活性。
[0057] 已经潜在具有D皿脱氨酶活性的候选D皿脱氨酶可W从作用于C3，C4,或巧化合物 的β-径酸脱氨酶类中选择。
[0058] 根据本发明再进一步的方面，所述D皿脱氨酶可W是与β-径酸脱氨酶，如径基丙二 酸半醒还原酶，班巧酸半醒还原酶，丙二酸半醒还原酶，甲基下醒还原酶，锋型醇脱氨酶，L-苏氨酸-3-脱氨酶，或高丝氨酸还原酶，在结构和机制上相关的酶。
[0059] 本发明也设及甲基下醒还原酶或班巧酸半醒还原酶将苹果酸-4-半醒转化为2,4-D皿的用途。在【具体实施方式】中，所述甲基下醒还原酶由SEQ ID No.74所示，而所述班巧酸 半醒还原酶由SEQ ID No.76所示。D皿还原酶的活性可W通过实施例6中描述的酶测试来测 量(见"酶测定'）。
[0060] 可W通过酶的至少一个突变来增加 D皿脱氨酶对苹果酸-4-半醒的亲和力，所述突 变增加突变的酶对苹果酸-4-半醒的活性和/或底物亲和力，和/或通过至少因子2(factor 2)降低对其天然底物的活性或亲和力。
[0061] 依照本发明的D册脱氨酶在具体方面对应嗜热金属球菌班巧酸半醒还原酶（SEQ ID No . 76)，与野生型酶相比，其包括至少一个在至少一个S40，N43，H39，T49，F85，Q108， L281和N305位置的突变，其中所述位置天然发生的氨基酸被其他19个天然存在的蛋白氨基 酸的任一个取代，即被丙氨酸，精氨酸，天冬酷胺，天冬氨酸，半脫氨酸，谷氨酸，谷氨酷胺， 甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸， 色氨酸，酪氨酸，或鄉氨酸任一所取代。
[0062] 如非排他性实施例中所验证，如SEQ ID No.81所示，通过W定向诱变导入的双突 变册9R，M3出曽加了嗜热金属球菌班巧酸半醒还原酶对化)-苹果酸-4-半醒的亲和力。简单 的突变体册9R(SEQIDNo.225)和M3H