中的班巧酸或苹果酸生产（Jantama et al.,2008a;Jantama et al.,2008b; Lin et al.,2005；Sanchez et al.,2005a；Zhang et al.,2011)。
[0101] 增加有机酸生产碳通量和ATP供应的另一种可能方式是工程化憐酸締醇式丙酬酸 (PEP)/丙酬酸/草酷乙酸的分支节点（综述于(Sauer&Eikmanns 2005))。确保从憐酸締醇式 丙酬酸到草酷乙酸碳通量增加的代谢工程化策略的非排他性例子为：
[0102] -通过阻碍丙酬酸激酶的作用和增加 PEP簇化激酶的活性来优化酿酒酵母中苹果 酸的生产(Zelle et al.，2010)。
[0103] -通过增加天然或异种表达的PEP簇化酶，PEP簇化激酶，或丙酬酸簇化酶的活性， 来优化大肠杆菌中班巧酸的生产(Millard et al.,1996;Sanchez et al.,2005b;Zhang et al.,2009)。
[0104] 在使用PEP消耗憐酸转移酶系统(PTS)进行葡萄糖初始憐酸化步骤的大肠杆菌和 其他细菌中，增加有机酸生产碳通量和ATP供应的另一种可能方式为缺失PTS系统的基本元 件(例如ptsl或ptsGKLin et al.，2005;Zhang et日1.，2009)。在携带有PTS系统缺失突变 的突变体中，为确保进一步的葡萄糖摄入，必须保证另外的葡萄糖摄入系统（如GalP)的活 性。
[0105] 增加有机酸生产中进入所需途径的碳通量的另一种可能方式是工程化巧樣酸和 乙醒酸循环。非排他性例子为：
[0106] -通过增加异巧樣酸裂解酶活性(缺失转录阻遏子iclR)来优化大肠杆菌中班巧酸 的生产(Xin et al.,2005;Sanchez et al.,2005a)。
[0107] -通过缺失异巧樣酸脱氨酶，和/或班巧酸脱氨酶来优化班巧酸的生产化in et al.,2005)。
[0108] 增加 D皿生产中进入所需途径的碳通量的另一种可能方式是在生产生物中表达适 合的丙酬酸脱氨酶和巧樣酸合成酶。大肠杆菌的天然丙酬酸脱氨酶和巧樣酸合成酶被细胞 内高NAD田农度抑制，运使得运些酶在厌氧条件下活力较低。在大肠杆菌中，对NADH不敏感的 丙酬酸脱氨酶突变体的表达导致了厌氧条件下乙酷-CoA的过量生产和发酵终产物之间改 变的碳通量再分配（乙酸，乳酸，乙醇，甲酸和丙酬酸）(Wang et a 1.2010)。对NADH不敏感的 枯草芽抱杆菌巧樣酸合成酶的异种表达增加了工程化的大肠杆菌菌株中班巧酸的生产 (Sanchez et al.，2005a)。结合上述突变，使用适合的丙酬酸脱氨酶和巧樣酸合成酶(NADH 敏感或不敏感的），能调整厌氧和有氧条件下乙醒酸与巧樣酸循环反应和发酵途径之间的 碳通量再分配。
[0109] 增加通过D皿途径的碳通量的另一种可能方式是缺失可能降解途径中间体4-憐酸 苹果酸，4-苹果酸半醒的酶促反应。可能降解苹果酸半醒的候选酶是班巧酸半醒脱氨酶 (sacUgabD)，W及其他能W末端醒基氧化C4分子的脱氨酶。
[0110] 增加宿主生物中D皿产率的另一种可能方式是缺失降解D皿的代谢反应。D皿是苹 果酸酶的竞争性抑制物，因此，具有对该酶的活性位点的竞争性高亲和力(Rognstad&Katz， 1979)。因此，D皿可W被其他酶识别并可能被降解。运些酶可W被识别并从宿主生物中缺 失。
[0111] 当2，4-D皿生产是基于苹果酸或其他有机酸的加入时，生产2，4-D皿的微生物应该 功能性表达能促进苹果酸(或其他有机酸如丙酬酸，班巧酸等)摄入的膜输送蛋白。
[0112] 下面的实施例举例说明了本发明。运些实施例仅是为了举例说明的目的，而不应 被解释为W任何方式限制本发明的范围。
[0113] 附图简述
[0114] 凰！:（ i)描述将化)-苹果酸转化为化)-2，4-二径基下酸化皿)的反应方案，和（i i) 将化)-天冬氨酸转化为化)-高丝氨酸的类似转化。
[0115] 圏与来自不同生物的天冬氨酸激酶氨基酸序列比对巧c_AKII I-天冬氨酸激酶III (SEQ ID No.4)，LysC，Ec_AKI(SEQ ID No.87)-大肠杆菌天冬氨酸激酶I，ThrA，Ec_AKII (569 10齡.88)-大肠杆菌天冬氨酸激酶11，1611^，1^'-詹氏甲烧球菌（569 10齡.89)，1'1-嗜热栖热菌（SEQ ID No.90)，Cg-谷氨酸棒杆菌（SEQ ID No.91)，At-拟南芥（SEQ ID 齡.92)，5。-酿酒酵母（569 10齡.93))，图使用(：1113化1胖2生成化日'1^116131.，2007)。
[0116] 圏击来自不同生物的天冬氨酸半醒脱氨酶氨基酸序列比对化c-大肠杆菌(SEQ ID No.49)，Mj-詹氏甲烧球菌（SEQ ID No.94)，Tt-嗜热栖热菌（SEQ ID No.95)，Bs-枯草芽抱 杆菌（SEQ ID No.96)，Cg-谷氨酸棒杆菌（SEQ ID No.97)，At-拟南芥（SEQ ID No.98)，Sc-酿酒酵母（569 10齡.99))，图使用(：1113化1胖2生成化日'1^116131.，2007)。
[0117] 圏兰:对应DHB保留时间的区域上气相色谱放大图，显示：（A)DHB标准品（浓度= lmM);(B)包含苹果酸激酶(MK)，苹果酸半醒脱氨酶(MSA-Dh)，和苹果酸半醒还原酶(MSA-red)的反应A组合物；（C)对照反应B组合物(与A相同但缺少MSA-red); (D)对照反应C组合物 (与A相同但缺少MSA-Dh)。
[0118] 座：纯化的LysC E119G,LysC E119G E250K,LysC E119G T344M,LysC E119G S345L，LysC E119G T344M，和LysC E119G T3521突变体对反应缓冲液中赖氨酸浓度的相对 活性。 实施例
[0119] 实施例1:分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的天冬氨酸激酶LysC和化m3的天冬氨酸 和苹果酸激酶活性测试。
[0120] 含有野生型天冬氨酸激酶基因的质粒的构建:构建质粒化YSCwt是通过使用高保 真聚合酶化usion?(Finnzymes)和能分别在起始密码子上游和终止密码子下游导入Ndel和 Ba恤I限制性位点的正向及反向引物5' CACGAGGTACATATGTCTGAAATTGTTGTCTCC3'（ SEQ ID No. 1)和5'CTTCCAGGGGATCCAGT-ATTTACTCAAAC3'（沈Q ID No.2)，WPCR扩增lysC基因。使用 大肠杆菌DH5a的基因组DNA作为模板。PCR产物WNdel和BamHr消化，使用T4DNA连接酶 (8;[01日63)连接到祀了8日表达载体(齡￥日旨日]1)的对应位点，并转化入大肠杆菌0册日细胞。得到 的pAKIIIwt质粒被分离并通过DNA测序显示其包含具有正确序列（SEQIDNo.3)的全长 173(：基因。对应的蛋白由56〇10齡.4所示。
[0121] 构建质粒抑0M3wt是通过使用高保真聚合酶化usion?(Finnzymes)和能分别在起 始密码子上游和终止密码子下游导入Nhel和EcoRI限制性位点的正向及反向引物5' TATAATGCTAGCATGCCAATGGATTTCCAACC ^ ' ( SEQ ID No. 5)和 s' TATAATGAATTCTTAAATTCCAAGTCTTTTCAATTGTTC 3'（沈Q ID No. 6)，WPCR扩增H0M3基因。使用 酿酒酵母BY4741的基因组DM作为模板。PCR产物WNhe巧日EcoRr消化，使用T4DNA连接酶 (8;[01日63)连接到祀了8日表达载体(齡￥日旨日]1)的对应位点，并转化入大肠杆菌0册日细胞。得到 的pH0M3wt质粒被分离并通过DNA测序显示其包含具有全长H0M3基因的正确序列（SEQ ID No.7)。对应的蛋白由SEQ ID No.8所示。
[0122] 酶的表达：W适合的质粒转化大肠杆菌化21D3星细胞。在250mL LB培养基中表达 有N-末端六组氨酸标记的酶，在通过向培养基中加入ImM异丙基-β-D-硫代化喃半乳糖巧 (IPTG)来诱导蛋白表达之前，LB培养基在0D6日日为0.1的条件下过夜培养并生长至OD600为 0.6。表达蛋白3小时之后，W 13000g离屯、10分钟收集细胞并将其储存在-20°C下直至进一步 的分析。生长和蛋白表达在37°C下进行。培养基含有50yg/L的卡那霉素。
[0123] 酶的纯化:将冷冻的表达培养物的细胞团块重悬浮在0.5mL破碎缓冲液中（50mM 化pe，300mM化Cl，pH7.5)，通过设定至30%能量输出的四个连续声波处理循环(Bioblock 5(^6111:1門(3,￥化^〔61]^72437)破碎开。通过在4°(3下13000旨离屯、粗提物15分钟来去除细胞 碎片并保留澄清的上清。通过加入15mg/mL的链霉素(Sigma),在4°C下13000g离屯、样品10分 钟并保留上清来从提取物中去除RNA和DNA。澄清的蛋白提取物与0.75血床体积的化Ion?钻 亲和树脂（Clontech)在4°C下溫育化。在台式离屯、机上700g离屯、悬液并去除上清。在W 〇.5mL洗脱缓冲液(50mM Hepe，300mM化Cl，500mM咪挫，pH 7.5)洗脱天冬氨酸激酶之前，从 10个床体积的清洗缓冲液(50mM Hepe，300mM NaCl，15mM咪挫，pH 7.5)清洗树脂。用SDS-pAGE分析来判断洗脱的酶的纯度。
[0124] 酶测试:通过在憐酸締醇式丙酬酸，丙酬酸激酶，和乳酸脱氨酶的存在下，将激酶 反应中ADP产物与NADH氧化禪合来测试天冬氨酸或苹果酸激酶的活性。
[012引反应方案：
[0126] 天冬氨酸(或苹果酸)激酶
[0127] 天冬氨酸（或苹果酸)+ATP^4-憐酸-(L)-天冬氨酸(或者4-憐酸-(L)-苹果酸)+ ADP
[0128] 丙酬酸激酶
[0129] ADP+憐酸締醇式丙酬酸一 ATP+丙酬酸
[0130] 乳酸脱氨酶
[0131] 丙酬酸+NADH^NA护+乳酸
[013引 测试混合物含有50mM Hepes(pH 7.5)，50mM KCl，5mM MgCl2,0.24mM NADH， 0.96mM ATP，0.96mM PEP，9yg/mL乳酸脱氨酶（Sigma，L2500)，12.4yg/mL丙酬酸脱氨酶 (Sigma，P1506)，W及适量纯化的天冬氨酸（苹果酸)激酶。通过加入50mM化)-天冬氨酸或 化)-苹果酸来起始反应。酶测试在30°C下96孔平底微量滴定板中W25化L终体积进行。随后 在酶标仪(BioRad 680XR)中检测反应物340nm处NADH的特征吸收。
[0133] 径目亏酸测试:为判断通过野生型或突变天冬氨酸激酶处理的底物的憐酸化，即酷 基憐酸酢的形成，将激酶反应产物与径胺溫育W形成对应的天冬氨酸或苹果酸异径朽酸衍 生物。测试混合物含有 120mM Hepes(pH 8)，200mM KCiaOmM ATP，200mM径胺，lOmM天冬氨 酸或苹果酸，W及适量的纯化蛋白。30分钟后通过加入等体积的1.7%(w/v)FeCl3lM盐酸溶 液来终止反应。异径目亏酸-铁复合物的形成是通过在酶标仪中测量其540nm处特征吸收来判 断。使用含有除ATP外所有组分的测试混合物作为空白。
[0134] 结果：如异径目亏酸测试所判断，纯化的LysC(无组氨酸标签，SEQ ID No.4)和化m3 (无组氨酸标签，SEQ ID No.7)酶显示出天冬氨酸激酶活性但不能够憐酸化苹果酸化eng& Voila，1996)eLysC和Hom3对天冬氨酸的最大活性分别为4.5ymol/(min*mgpr〇t)和1.6皿〇1/ (min*mgpr〇t)。通过测量不同底物浓度（C)下的初始反应速率(V)并通过提取V对v/c曲线的 斜率，WEadie和化fstee的方法估算对天冬氨酸的Km值。纯化的组氨酸标签化的LysC的Km 被估算为约0.6mM，显示组氨酸标签化蛋白具有与Km被报导为0.6mM的非组氨酸标签化的纯 化酶相同的底物亲和力(Marco-Marin et曰1.，2003)。
[0135] 实施例2:大肠杆菌天冬氨酸激酶LysC的定向诱变和突变体酶苹果酸激酶活性的 测试。
[0136] 使用表1中所列寡核巧酸对并使用91^￥5〇^质粒(560 10齡.3)作为模板来进行定 向诱变。使用表1中所列寡核巧酸对通过PCR(Phusion 1U，册缓冲液20%(v/v)，dNTPs 2.5mM，正向和反向引物每种ΙμΜ，模板质粒200ng，水)导入改变氨基酸序列的点突变。除了 促进突变克隆识别的功能突变外，PCR创建的质粒包含新的Ncol限制性位点(使用沉默突变 导入）dPCR产物被W化nl在37°C消化IhW去除模板DNA，并转化入肥B 5α感受态大肠杆菌细 胞(肥Β)。通过限制性位点分析来识别突变的质粒并通过DNA测序判断其携带的目标突变。
[0137] 用于在Ε119位置突变大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC的寡核巧酸。
[013 引
[0139] 显示119位置突变的序列可W由SEQ ID No.9所示，其中119位置的残基为X，X是19 个天然产生的氨基酸中的任一个(除谷氨酷胺）。
[0140] 如实施例1所述，突变体酶被表达，纯化并测试天冬氨酸和苹果酸激酶活性。结果 总结于表2中。
[0141] 突变体酶苹果酸激酶活性的表征。值对应来自至少两个独立试验的平均值。
[0142]
[0143] 表2中所列突变体对天冬氨酸均没有活性。
[0144] 结果显示通过W半脫氨酸，甘氨酸，天冬酷胺，脯氨酸，谷氨酷胺，丝氨酸，苏氨酸 或鄉氨酸替换119位置处的保守谷氨酸，天冬氨酸激酶可W被转化为苹果酸激酶。
[014引表2中所列酶对应的核酸序列为SEQ ID No.l3，SEQ ID No.l5，SEQ ID No.l7，SEQ ID No. 19,沈Q ID No.21，沈Q ID No.23,沈Q ID No.25和沈Q ID No.27。