一种水中肠道病毒分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水中病毒分离纯化领域;具体设及一种水中病毒分离纯化的方法。
【背景技术】
[0002] 病毒引发的腹泻疾病在发展中国家有显著的致死率，在发达国家也有很高的发病 率，其中儿童患者数量最高。引起急性腹泻的常见病毒包括轮状病毒(Rotaviruses)、诺如 病毒（NoroViruses)、星状病毒(AstroViruses)、科萨奇病毒（CoxViruses)和肠道腺病毒 (Adenoviruses)等。由于我国肠道病毒检测研究开展较晚，受限水中病毒分离纯化方法，对 环境及生活水中肠道病毒的检测至今没有国家标准方法。在水中病毒分离纯化技术方面， 现有技术普遍应用超速离屯、、电势吸附洗脱结合有机絮凝等方对水样本进行快速分离浓 缩，但是由于不同水质中病毒稀薄程度的差异，需要过滤大量水样本，水中病毒分离纯化效 率制约了后期的分子和细胞水平检测方法，另一方面由于超速离屯、机等设备的过于昂贵， 使得普通检测实验室不具备实验能力，制约了方法的应用。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决现有病毒浓缩方法中浓缩样病毒回收率低和单位体积病毒含量低 的问题;而提供了 一种水中肠道病毒分离纯化方法。
[0004] 本发明方法能够高效提取水中肠道病毒，并应用巧光定量PCR及细胞水平检测。 [000引本发明包括两种方案:第一种方案是吸附洗脱超滤法，化noceram滤膜吸附多聚憐 酸盐溶液洗脱结合Centrk:on 6Plus-70设备进行二次分离纯化方法，该方法应用于大量水 样;第二种方案是Centric0n?Plus-70设备一步分离纯化方法，该方法应用于少量水样。
[0006] 本发明的第一方案--水中肠道病毒分离纯化方法是采用专利号 201410234128.4公开的装置进行的，具体步骤如下：
[0007] 步骤一、将水样装入存储罐中，闭合顶盖；
[0008] 步骤二、然后通入氮气调节存储罐内的压力，打开控制阀，使水样通过过滤器流向 滤膜支架；
[0009] 步骤Ξ、待水样全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐， 使罐体泄压；
[0010] 步骤四、更换新的存储罐，向新的存储罐中加入1L质量浓度为1%的多聚憐酸钢溶 液，通入氮气使存储罐内的压力上升至0.7个标准大气压；
[0011] 步骤五、打开控制阀，使多聚憐酸钢溶液流向滤膜支架进行洗脱，通过放水管收集 洗脱液，待全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止洗脱；
[001引步骤六、将滤液杯安装于带有样品杯的CentficonKpius-70滤忍上，组装成两套离 屯、杯，然后用去离子水预润洗；
[0013]步骤屯、取步骤五获得的洗脱液120ml分成两等份，然后分别装入两套离屯、杯的样 品杯中后盖盖，再将两套离屯、杯对称放置在离屯、机内，离屯、10分钟，取出两套离屯、杯后将两 个样品杯分别由滤液杯上取下，弃去两个滤液杯中过滤液；
[0014] 步骤八、重复步骤屯直至步骤五收集的洗脱液全部过滤完毕；
[0015] 步骤九、将经步骤八处理后的两个带有样品的CentriconK Plus-70滤忍分别与收集 杯组装成两套收集装置，然后对称置于离屯、机中，离屯、2分钟，然后合并两个收集杯中样本， 再用MEM培养基(minimum essential medium)稀释至ImL，移至离屯、管内-70°C保藏备用。
[0016] 方案一进一步限定:步骤屯中在离屯、力为1900 Xg条件下离屯、。步骤九中在离屯、力 为800 X g条件下离屯、。步骤四所述多聚憐酸钢溶液是由3.8111111〇1几化2册〇4、6.5mmol/L K出P〇4、0.05mol/L氨基乙酸(glycine)和去离子水配制的。
[0017] 专利号201410234128.4公开的装置包括氮气压力罐、存储罐、过滤器和滤膜支架， 所述的存储罐包括罐体和顶盖，罐体设有寫顶，寫顶设有弧形缩口，顶盖底端设有外翻沿， 密封圈置于外翻沿内，顶盖由弧形缩口伸入并可通过密封圈卡在弧形缩口内，顶盖顶端对 称设有耳座，耳座内装有杠杆，杠杆包括一个V'字形的提杆、两个弧形的连接杆及两个横 折形的支撑杆，所述提杆两端与连接杆通过过渡圆弧连接，连接杆的另一端与支撑杆圆弧 过渡连接，杠杆的支撑杆套在耳座内，支撑杆的底端可抵在寫顶上，过渡圆弧可抵在寫顶 上，寫顶上分别设有压力表、进气管和出水管，存储罐的进气管与氮气压力罐连接，出水管 底端穿过寫顶伸入到罐体底部，出水管顶端设有控制阀，控制阀与过滤器通过两端连接快 速接头的导管连接，过滤器与滤膜支架通过两端连接快速接头的导管连接，滤膜支架设有 放水管;所述滤膜支架内设有正电荷滤膜。
[0018] 本发明的第二方案一一水中肠道病毒分离纯化方法是由下述步骤完成的：
[0019] 步骤1、将滤液杯安装于带有样品杯的说恤ic〇n?Plus-70滤忍上，组装成两套离屯、 杯，然后用去离子水预润洗；
[0020] 步骤2、向1L纯水中投入肠道病毒样本得到水样，取水样120mL分成两等分，然后分 别装入两套离屯、杯的样品杯中后盖盖，再将两套离屯、杯对称放置在离屯、机内，离屯、10分钟， 取出两套离屯、杯后将两个样品杯分别由滤液杯上取下，弃去两个滤液杯中过滤液；
[0021 ]步骤3、重复步骤2直至样本全部过滤完毕，收集样本；
[0022] 步骤4、将经步骤3处理后的两个带有样品的Ce恤-icon叩lus-70滤忍与收集杯组成 两套收集装置，然后对称置于离屯、机中，离屯、2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM 培养基(minimum essential medi皿)稀释至ImL，移至离屯、管内-70°C保藏备用。
[0023] 方案二进一步限定:步骤2中在离屯、力为1900 Xg条件下离屯、。步骤4中在离屯、力为 800 Xg条件下离屯、。步骤2中肠道病毒样本按下述投入量投加：1L纯水中诺如病毒的投入量 1.47E+03~1.47E+07; 1L纯水中轮状病毒1.06E+03~1.0犯+07; 1L纯水中星状病毒2.07E+ 02~2.07E+06; 1L纯水中科萨奇病毒3.50E+01~3.50E+06; 1L纯水中肠道腺病毒3.60E+02 ~3.60化07。
[0024] 本发明方法相对于现有方法做出了 W下改变，将洗脱液由有机溶剂牛肉浸出液换 成了无机溶剂多聚憐酸盐溶液，一方面克服了 Centricon? Plus-70设备过滤堵塞的问题，同 时保证洗脱效率和病毒活性，减小了浓缩样本终体积，提高了单位体积内病毒样本含量。
【附图说明】
[002引图1是离屯、杯结构示意图；图2是收集装置示意图；图中1一一盖，2-一样品杯， 3--CenUicon卽lus-70滤忍，4--滤液杯，5--收集杯。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0026] 一：本实施方式中水中肠道病毒分离纯化方法是采用专利号 201410234128.4公开的装置进行的，具体步骤如下：
[0027] 步骤一、将水样装入存储罐中，闭合顶盖；
[0028] 步骤二、然后通入氮气调节存储罐内的压力，打开控制阀，使水样通过过滤器流向 滤膜支架；
[0029] 步骤Ξ、待水样全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐， 使罐体泄压；
[0030] 步骤四、更换新的存储罐，向新的存储罐中加入1L质量浓度为1%的多聚憐酸钢溶 液，通入氮气使存储罐内的压力上升至0.7个标准大气压，
[0031 ]其中，所述多聚憐酸钢溶液是由3.8mmol/LNa2HP〇4、6.5mmol/L K出P〇4、0.05mol/L 氨基乙酸(glycine)和去离子水配制的；
[0032] 步骤五、打开控制阀，使多聚憐酸钢溶液流向滤膜支架进行洗脱，通过放水管收集 洗脱液，待全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止洗脱；
[0033] 步骤六、将滤液杯4安装于带有样品杯2胞C谢扣城n?Plus-70滤忍3上，组装成两套 离屯、杯(参见图1)，然后用去离子水预润洗；
[0034] 步骤屯、取步骤五获得的洗脱液120ml分成两等份，然后分别装入两套离屯、杯的样 品杯2中后盖盖1，再将两套离屯、杯对称放置在离屯、机内，在离屯、力为1900 Xg条件下离屯、10 分钟，取出两套离屯、杯后将两个样品杯分别由滤液杯4上取下，弃去两个滤液杯4中过滤液；
[0035] 步骤八、重复步骤屯直至步骤五收集的洗脱液全部过滤完毕；
[0036] 步骤九、将经步骤八处理后的两个带有样品的Cemricon't Plus-70滤忍3分别与收 集杯5组装成两套收集装置(参见图2)，然后对称置于离屯、机中，在离屯、力为800 Xg条件下 离屯、2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM培养基(minimum essential medium)稀 释至ImL，移至离屯、管内-70°C保藏备用。
【具体实施方式】 [0037] 二：本实施方式中水中肠道病毒分离纯化方法是由下述步骤完成 的：
[0038] 本发明的第一方案一一水中肠道病毒分离纯化方法是由下述步骤完