一种利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法
【专利摘要】一种利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法，属于分析化学【技术领域】；其特征在于利用适配体可以引起巯基乙胺修饰的AuNPs的聚集，从而使AuNPs溶液的颜色由酒红色变为蓝色，吸收峰发生红移，四环素与适配体先作用后形成四环素-适配体结合物后不会引起AuNPs聚集，可以通过肉眼和紫外分光光度计检测食品中的四环素的残留量，该方法可简单、快速、灵敏的检测四环素，为以后的研究、生产、监管等提供了方便。
【专利说明】—种利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法
【技术领域】
[0001]利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法，属于分析化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]四环素类为广谱抗菌药，是抗生素中最为便宜的一类，常用的四环素类药物有四环素、金霉素、土霉素、强力霉素等。
[0003]在四环素类药物中四环素的使用较为广泛，低廉的价格使得四环素在发展中国家大受欢迎，不仅作为药物广泛用于人类与动物疾病的治疗，同时也作为添加剂大量使用，用于预防和治疗畜禽疾病，用于提高饲料利用效率，促进动物生长。但由于该类药物的使用不合理及滥用，容易诱导产生耐药菌株，也会导致发生在食品及牛奶中四环素的残留问题。欧盟及我国均规定牛奶中四环素的最大残留限量为0.lmg/kg。
[0004]儿童长期反复使用四环素，有可能影响牙齿的发育和形成，不但使牙齿变黄，还会引起牙釉质发育不良(牙齿表面不光滑，出现小凹陷)或牙齿畸形。同时也容易患龋齿。老年患者服用过量常伴有肾功能减退等症状，严重影响人体健康，给人类健康带来重大隐患。
[0005]四环素残留的测定方法主要有微生物法、酶联免疫法(ELISA)、薄层色谱法和液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)等，尽管这些方法灵敏度高，但这些方法存在特异性差的缺点，这些方法需要昂贵的设备，测定时间较长，成本高，需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测食品中的四环素。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法，以快速、简单、灵敏的检测食品中抗生素四环素的残留量。
[0007]技术问题:利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法基于以下原理:
[0008]新制备的正电AuNPs，即巯基乙胺修饰的AuNPs分散均匀，由于AuNPs表面氨基的作用而带正电荷，溶液呈现酒红色。
[0009]当加入适配体后，由于其含有带有负电的磷酸根，由于静电吸附作用而使AuNPs聚集，颜色由酒红色变成蓝色，吸收峰发生红移。
[0010]如果四环素与适配体先作用后形成四环素-适配体结合物后，在加入到正电AuNPs溶液中，就不会引起AuNPs聚集，溶液仍呈现酒红色。
[0011]本发明的技术方案:巯基乙胺修饰的AuNPs的制备；利用比色法观察和检测含有不同浓度的四环素的体系。
[0012](I)巯基乙胺修饰的AuNPs的制备
[0013]首先，400 μ L0.213Μ的半胱胺盐酸盐和40mLl.40mM的HAuCl4的混合液加入到IOOmL的圆底烧瓶中。该混合液在黑暗中搅拌20分钟，快速加入10 μ LlOmM的新配置的NaBH4溶液，继续在黑暗中搅拌30分钟。将所得到的溶液冷却至室温后用0.4 μ m的微孔膜去掉沉淀物，滤液放置在4°C冰箱中以备检测使用。[0014](2)利用比色法观察和检测含有不同浓度的四环素的体系
[0015]配制以下混合溶液:分别将40 μ L不同浓度的四环素标准品与20 μ L50nM的适配体加入到1.5mL的离心管中，涡旋震荡1411^11，然后加入4(^1^的AuNPs，将最终体积用水稀释到500 μ L,室温下反应12min。AuNPs的颜色和吸收峰会随着四环素溶液浓度的变化而变化；根据A522与四环素的浓度建立标准曲线。
[0016]所用四环素标准品最终浓度依次为:0.2 μ g/mL, 0.4 μ g/mL, 0.6 μ g/mL, I μ g/mL,
1.2 μ g/mL, 1.6 μ g/mL, 2 μ g/mL。线性范围为 0.2 μ g/mL-2 μ g/mL。
[0017]本发明的有益效果:本发明制备了巯基乙胺修饰的AuNPs，并建立了一个简单、快速、灵敏的信号法，能够快速检测四环素，为今后的监管提供了方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1不同体系的紫外吸收图:(a) AuNPs，(b) AuNPs -四环素，(C)AuNPs-四环素-适配体，(d) AuNPs-适配体 AuNPs:8.3 X ICTiqM,四环素，2μ g/mL。
[0019]图2不同浓度的四环素标准品与AuNPs作用的紫外吸收图:a_g: 0.2 μ g/mL，
0.4 μ g/mL,0.6 μ g/mL,I μ g/mL,1.2 μ g/mL,1.6 μ g/mL,2 μ g/mL。
[0020]图3莱克多巴胺的标准曲线图:以A522与四环素的浓度建立标准曲线。
[0021]图4不同反应时间(2min-20min,每两分钟检测一次)对AuNPs-四环素-适配体体系的影响图:四环素，2μ g/mL,适配体，2nM。
【具体实施方式】
[0022]巯基乙胺修饰的AuNPs的制备
[0023]材料/试剂=HAuCl4购置于北京化学试剂公司
[0024]方法:首先，400 μ L0.213Μ的半胱胺盐酸盐和40mLl.40mM的HAuC14的混合液加入到IOOmL的圆底烧瓶中。该混合液在黑暗中搅拌20分钟，快速加入10 μ LlOmM的新配置的NaBH4溶液，继续在黑暗中搅拌30分钟。将所得到的溶液冷却至室温后用0.4 μ m的微孔膜去掉沉淀物，滤液放置在4°C冰箱中以备检测使用。
[0025]结果:AuNPs的紫外吸收光谱在527nm处有最大吸收峰，这与文献报道相一致。
[0026]由于实验的体系受到反应时间的影响，所以需要研究体系时间变化的影响。
[0027]材料/试剂:巯基乙胺修饰的AuNPs ;四环素标准品购自生工生物(上海)股份有限公司。
[0028]方法:将40 μ L25 μ g/mL四环素标准品与20 μ L50nM的适配体加入到1.5mL的离心管中，涡旋震荡不同的时间(2min-20min)，每两分钟后加入40 μ L的AuNPs，将最终体积用水稀释到500 μ L，室温下反应12min，测定紫外吸收光谱。
[0029]结果:说明时间对整个体系是有影响的，当反应时间为14分钟时，反应最完全，因此，最终选取14分钟作为该反应的反应时间。
[0030]该方法用于莱克多巴胺的检测
[0031]材料/试剂:巯基乙胺修饰的AuNPs ;四环素标准品购自生工生物(上海)股份有限公司。
[0032]方法:(1)分别将40yL不同浓度的四环素标准品与20yL50nM的适配体加入到1.5mL的离心管中，涡旋震荡14min，然后加入40 μ L的AuNPs，将最终体积用水稀释到500 μ L,室温下反应12min。AuNPs的颜色和吸收峰会随着四环素溶液浓度的变化而变化；
[0033](2)所用四环素标准品最终浓度依次为:0.2 μ g/mL, 0.4 μ g/mL, 0.6 μ g/mL,
Iμ g/mL,1.2 μ g/mL,1.6 μ g/mL,2 μ g/mL。
[0034]结果:根据A522与四环素的浓度建立标准曲线；线性范围为0.2 μ g/mL-2 μ g/mL。
【权利要求】
1.一种利用适配体和正电AuNPs比色检测四环素的方法，属于分析化学【技术领域】，其特征在于利用适配体可以引起巯基乙胺修饰的AuNPs的聚集，从而使AuNPs溶液的颜色由酒红色变为蓝色，吸收峰发生红移，四环素与适配体先作用后形成四环素-适配体结合物后不会引起AuNPs聚集，可以通过肉眼和紫外分光光度计检测食品中的四环素的残留量，检测步骤包括:巯基乙胺修饰的AuNPs的制备；利用比色法检测四环素。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述巯基乙胺修饰的AuNPs的制备步骤如下:首先，400 μ L0.213Μ的半胱胺盐酸盐和40mLl.40mM的HAuCl4的混合液加入到IOOmL的圆底烧瓶中，该混合液在黑暗中搅拌20分钟，快速加入10 μ LlOmM的新配置的NaBH4溶液，继续在黑暗中搅拌30分钟，将所得到的溶液冷却至室温后用0.4 μ m的微孔膜去掉沉淀物，滤液放置在4°C冰箱中以备检测使用。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述利用比色法观察和检测含有不同浓度的四环素的体系步骤如下: 配制以下混合溶液:分别将40 μ L不同浓度的四环素标准品与20 μ L50nM的适配体加入到1.5mL的离心管中，涡旋震荡1411^11，然后加入4(^1^的AuNPs，将最终体积用水稀释到.500 μ L,室温下反应12min, AuNPs的颜色和吸收峰会随着四环素溶液浓度的变化而变化； 根据A522与四环素的浓度建立标准曲线，线性范围为0.2 μ g/mL-2 μ g/mL。
【文档编号】G01N21/33GK103994984SQ201410245653
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】孙春燕, 罗叶丽, 郭佳佳, 李莹, 曹先一, 许景月, 沈斐 申请人:吉林大学