专利名称：一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε -聚赖氨酸的方法，具体地说是指通过PH值控制和流加发酵的方法，利用葡萄糖和甘油共同作碳源高效发酵生产 ε -聚赖氨酸，属于发酵工程领域。
背景技术：
ε -聚赖氨酸(ε -PL) 一般是由25 ；35个L_赖氨酸的α -COOH和ε -ΝΗ2相互缩合而形成的L-赖氨酸聚合物，分子量在3500 4500Da。ε -PL只能由微生物合成， 且ε-PL产生菌仅分布于链霉菌属和北里孢菌属。目前，ε-PL主要作为食品防腐剂，广泛用于淀粉质类食品防腐。ε -PL作为一种新型食品防腐剂，相比于传统化学防腐剂和生物防腐剂，具有更广的抑菌谱(有效抑制G+、G-、酵母菌和霉菌等)、更好的水溶性、更强的热稳定性(100°C，30min或120°C，20min)和更广的pH适用范围(等电点为pH9.0左右)等；同时，ε-PL的添加不会影响食品风味。更为重要的是，ε-PL具有较高的安全性 ADME (Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion)实验证实 ε-PL 很难被生物体的肠胃吸收且急性口服剂量达5g/kg。因此，ε-PL是一种安全、高效的新型生物防腐齐U。事实上，ε -PL早在1980s即被日本允许作为食品防腐剂使用；随后，韩国也批准ε -PL 在食品中添加；2003年，ε -PL获得美国FDA认证(GRN000135)，并开始进入美国和欧洲市场。另外，ε-PL作为高分子聚合物前体，具有较高的生物相容性和特异阳离子性，被广泛用作生物可降解材料、乳化剂、高吸收性水凝胶、药物载体、抗癌增进剂和生物芯片外被等领域研究和应用。因此，ε-PL具有广阔的市场应用前景。然而，国际上只有日本窒素公司 (Chisso Corporation)实现了 ε-PL工业化发酵生产且已形成年产千吨级的规模。ε-PL 在国内的研究，大多处在实验室和中试开发阶段且发酵水平较日本差距较大。所以，建立 ε-PL高效发酵工艺提高ε-PL发酵产量和生产强度，对于建立我国ε-PL产业具有重要意义。葡萄糖是发酵生产ε -PL普遍采用的碳源。岩田敏治等人(CN 1260004Α)利用改造后的小白链霉菌Iysinopolymerus亚种11011Α-1 (FERM BP-1109)转化葡萄糖合成大量 ε-PL0徐虹等人(CN 101509021Α)利用细胞固定化方法培养北里孢菌PL6-3，以葡萄糖作碳源发酵生产ε -PL。贾士儒等人(CN 101671703A)利用葡萄糖作碳源并流加L-赖氨酸发酵生产ε-PL。虽然ε-PL产生菌能够快速利用葡萄糖合成菌体和ε-PL，但ε-PL产量和底物转化率不高，并且在补料阶段由于葡萄糖溶解度以及流加方式的限制，会引起发酵液稀释并导致ε-PL浓度降低，从而增加了后提取成本和废水处理负荷，最终引起ε-PL生产成本的增加。最近，我们提出了利用工业甘油作碳源发酵生产ε -PL的方法 001110250123.7)。该方法与以葡萄糖作碳源相比，尽管显著提高了 ε-PL发酵产量和底物转化率，但发酵时间较长，从而导致生产强度较低。
葡萄糖和甘油都是ε -PL产生菌最适碳源(Shima S, Sakai H. Agric Biol Chem 1981,45 :^97-250 。以葡萄糖为唯一碳源时，ε-PL产生菌的发酵速度快，但ε-PL产量低，葡萄糖转化率低。以甘油为唯一碳源时，转化率高，ε-PL产量高，但发酵速度慢。然而，我们研究发现简单的将葡萄糖和甘油混合共同作为碳源用于ε -PL发酵却并不能有效提高ε-PL发酵水平。其关键在于，如何确定最合适的葡萄糖和甘油混合比例？如何保证发酵中后期的葡萄糖和甘油比例维持在最佳水平以及如何控制发酵过程合适PH值？基于此，本发明在考察了葡萄糖和甘油混合比例的基础上，结合葡萄糖和甘油流加策略保持发酵中后期总碳源浓度维持在较低水平的方法以及PH值控制策略，建立了一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε -聚赖氨酸的方法，提高ε -PL发酵产量和生产强度，从而降低生产成本。本发明采用的技术方案如下利用ε -PL产生菌培养20 30h的种子液，接种葡萄糖和甘油混合碳源的培养基，在初始PH 6. 5 7. 0、温度为28 32°C、溶氧保持在15 40%的培养条件下，采用pH 值调控策略和流加发酵方法生产ε -PL。本发明所指的起始发酵培养基由葡萄糖、甘油、酵母膏、(NH4) 2S04、KH2PO4, MgSO4 · 7H20、和 FeSO4 · 7H20 组成。最优配方为葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4Jg/ L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L。本发明所指的pH值调控策略是当发酵起始pH值下降至3. 0 4. 5时，用氨水等碱性液体或液氨控制PH稳定在3. 0 4. 5，并保持到发酵结束。本发明所指的流加发酵法是在ε -PL发酵过程中，当甘油浓度低于2 3g/L时， 流加甘油，直到甘油浓度达到5 7g/L ；流加或不流加葡萄糖，控制发酵液中葡萄糖浓度为 0 7g/L。如采用葡萄糖流加策略，则在葡萄糖浓度低于2 3g/L时开始流加500g/L 800g/L葡萄糖；当(NH4)2SO4浓度低于1 2g/L，流加(NH4)2SO4,直到(NH4) 2SO4浓度达到 5 10g/L。与葡萄糖、甘油为单一碳源发酵牛产ε-PL方法相比，本发明所示的葡萄糖和甘
ε -PL m^m^^nt^ 1、提高了 ε-PL发酵产量。利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-PL能够明显提高ε "PL发酵产量，比葡萄糖作单一碳源提高46%，比甘油作单一碳源提高17%。2、提高了 ε -PL发酵生产强度。利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε "PL能够显著缩短发酵时间，分别比葡萄糖和甘油作单一碳源缩短25%和33% ； ε -PL生产强度分别提高了 63%和17%。
具体实施例方式根据下列实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件以及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。
^MM 1 现有工艺-葡萄糖单一碳源补料-分枇发酵牛产ε -PL在装有3. 25L发酵培养基的5L发酵罐中(培养基葡萄糖，50g/L ； (NH4) 2S04，IOg/ L ；酵母粉，5g/L ；MgSO4,0. 5g/L ；ZnSO4,0. 04g/L ；FeSO4,0. 03g/L ;Κ2ΗΡ04，0· 8g/L ；KH2PO4, 1. 36g/L)，接种0. 25L ε -PL产生菌的20 30h种子培养液，在初始pH 6. 8、温度为30°C、 溶氧保持在30%的培养条件下发酵。当pH值自然下降到4. 0左右，流加25%氨水维持该 PH值至发酵结束。在发酵后期，流加800g/L葡萄糖和80g/L (NH4) 2S04，使葡萄糖维持在IOg/ L左右。培养168h, ε -PL产量达到24g/L,生产强度为3. 86g/L/d。^MM 2 现有工艺-甘油单一碳源补料-分枇发酵牛产ε -PL在装有3. 25L培养基的5L发酵罐中(甘油培养基甘油，60g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ； 酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 ·7Η20，0· 8g/L ；FeSO4 ·7Η20，0· 05g/L)，接种 0. 25L ε -PL 产生菌的20 30h种子培养液，在初始pH 6. 8、温度为30°C、溶氧保持在30%的培养条件下发酵。当PH值自然下降到3.5，流加10 25%氨水维持pH至发酵36h，随后，用10 25%氨水使pH缓慢升至3. 8，保持到发酵结束。当发酵后期甘油浓度低于5g/L时，流加甘油，直到甘油浓度达到15g/L ；当(NH4)2SO4浓度低于5g/L，流加(NH4)2SO4,直到(NH4)2SO4浓度达到10g/L。培养168h，g-PL产量达到30. llg/L，生产强度为4. 18g/L/d。^MM 3 葡萄糖和甘油、混合碳源分枇发酵牛产ε -PL在装有3. 25L培养基的5L发酵罐中(培养基组成葡萄糖，50g/L ；甘油，10g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接种0. 25L ε -PL产生菌的20 30h种子培养液，在初始pH 6. 0、温度为38°C、溶氧保持在40%的培养条件下发酵。当pH值自然下降到3. 0，流加10 25%氨水维持pH恒定至发酵结束。培养40h, ε -PL产量达到6. 29g/L,生产强度为3. 86g/L/d。实施例4:葡萄糖和甘油混合碳源分批发酵生产ε-PL在装有3. 25L培养基的5L发酵罐中(培养基组成葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接种0. 25L ε -PL产生菌的20 30h种子培养液，在初始pH7. 5、温度为30°C、溶氧保持在 15%的培养条件下发酵。当pH值自然下降到4. 5，流加10 25%氨水维持pH恒定至发酵结束。培养34h，ε -PL产量达到6. 34g/L，生产强度为4. 54g/L/d。实施例5 葡萄糖和甘油混合碳源分批发酵生产ε -PL在装有3. 25L培养基的5L发酵罐中(培养基组成葡萄糖，15g/L ；甘油，45g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接种0. 25L ε -PL产生菌的20 30h种子培养液，在初始pH6. 8、温度为35°C、溶氧保持在 30%的培养条件下发酵。当pH值自然下降到3. 8，流加10 25%氨水维持pH恒定至发酵结束。培养38h，ε -PL产量达到6. 44g/L，生产强度为4. 13g/L/d。实施例6 葡萄糖和甘油混合碳源补料-分批发酵生产ε -PL在装有3. 25L培养基的5L发酵罐中(培养基组成葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接种0. 25L ε -PL产生菌的20 30h种子培养液，在初始pH6. 8、温度为30°C、溶氧保持在 30%的培养条件下发酵。当pH值自然下降到3. 8，流加10 25%氨水维持pH恒定至发酵结束。在发酵过程中，当葡萄糖浓度低于2 3g/L时，流加500g/L 800g/L葡萄糖，直到葡萄糖浓度达到 8g/L ；当甘油浓度低于2 3g/L时，流加甘油，直到甘油浓度达到 7 8g/L;当(NH4)2SO4浓度低于2g/L，流力口 (NH4)2SO4,直到(NH4) 2S04浓度达到5g/L。培养 174h，ε -PL 产量达到 35. 14g/L，产率为 4. 85g/L/d。
权利要求
1.一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε -聚赖氨酸的方法，其特征在于ε-聚赖氨酸产生菌以葡萄糖和甘油混合物为碳源，在初始PH 6. 0 7. 5、温度为25 38°C、溶氧保持在15 40%的培养条件下发酵生产ε-聚赖氨酸；当ε-聚赖氨酸开始合成时，采用PH值调控策略和流加补料发酵法，达到提高ε -聚赖氨酸发酵产量和生产强度，降低生产成本和减少废水量的目的。
2.如权利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε_聚赖氨酸的方法，其特征在于所述混合碳源是指葡萄糖利甘油共同存在形成的混合物；或在发酵部分阶段单独使用葡萄糖或甘油作为碳源而后又流加另一种碳源(甘油或葡萄糖)形成的混合物。
3.如权利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε_聚赖氨酸的方法，其特征在于发酵起始阶段控制发酵罐中葡萄糖浓度为80 40g/L，在发酵中后期流加或不流加葡萄糖，控制葡萄糖浓度在0 7g/L。
4.如权利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε_聚赖氨酸的方法，其特征在于发酵起始阶段控制发酵罐中甘油浓度为0 80g/L，在发酵后期甘油浓度低于 2 3g/L时，开始流加甘油，直到其浓度达到5 7g/L。
5.如权利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε_聚赖氨酸的方法，其特征在于采用PH值控制策略当发酵起始ρΗ值下降至3. 0 4. 5时，用氨水等碱性液体或液氨控制PH稳定在3. 0 4. 5，并保持到发酵结束。
6.如权利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε_聚赖氨酸的方法，其特征在于采用(NH4)2SCV流加发酵方法发酵起始(NH4)2SO4浓度为5 20g/L，当(NH4)2SO4 浓度低于1 2g/L，流加(NH4)2SO4溶液，直到(NH4)2SO4浓度达到5 10g/L。
7.如权利要求4所述的混合碳源，在发酵初始阶段发酵罐中甘油浓度的极值为Og/L， 此时葡萄糖为发酵初始阶段的唯一碳源。
全文摘要
本发明涉及到一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法采用葡萄糖和甘油共同作为碳源，结合流加发酵方法和pH控制策略生产ε-聚赖氨酸。利用本发明建立的发酵工艺，比葡萄糖单独作碳源的ε-聚赖氨酸发酵产量提高40％以上；比甘油单独作碳源的ε-聚赖氨酸发酵产量提高20％以上。本发明改变了现有ε-聚赖氨酸生产方法，显著提高了ε-聚赖氨酸的发酵产量和生产强度。
文档编号C12P13/02GK102352386SQ20111027432
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者唐蕾, 张宏建, 张建华, 李树, 毛忠贵, 陈旭升 申请人:江南大学