L-氨基酸的生产方法
【专利摘要】本发明涉及L-氨基酸的生产方法，具体的涉及在含有甘油作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力、且经过修饰使得甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性增强的属于肠杆菌科的微生物，来生产L-氨基酸。
【专利说明】L-氨基酸的生产方法
[0001]本申请是申请日为2008年02月22日，申请号为200880005958.2 (国际申请号为PCT/JP2008/053020 )，发明名称为“L-氨基酸的生产方法”的发明专利申请的分案申请。
【背景技术】
[0002]L-氨基酸是通过使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)等的微生物的发酵方法来进行工业生产的。在这些生产方法中，使用从自然界分离的菌株或该菌株的人工突变株，并且还使用通过重组DNA技术进行修饰从而增加了碱性L-氨基酸生物合成酶的活性的微生物等。(专利文献I~9)
[0003]通常，在使用微生物进行氨基酸生产时，在基质中使用糖类作为主成分，但甘油也可以与糖类一样用作基质。(专利文献10、11)
[0004]已知大肠杆菌(Escherichia coli)中存在多个甘油代谢相关基因。然而，缺损甘油激酶的编码基因glpK、或甘油3磷酸脱氢酶的编码基因glpD中的任一个的突变株在以甘油为单 一碳源的培养基中不能生长，由此可知:甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶担负着大肠杆菌的主要甘油同化途径。(非专利文献I)
[0005]大肠杆菌的甘油脱氢酶也是甘油代谢相关的酶之一，已知在使用缺损了glpR(glpK、glpD、glp调节子的阻遏物)的3个基因的突变株进行的筛选中，它可使在以甘油为单一碳源的培养基中的致死性得以回复。(非专利文献2)
[0006]目前为止，如上述，经由甘油-3-磷酸的甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶被认为是属于肠杆菌科的微生物的主要同化途径，而经由二羟基丙酮的甘油同化途径被认为是属于肠杆菌科的微生物的甘油同化的非必要途径。
[0007]专利文献IEPOM3I35B
[0008]专利文献2EP0733712B
[0009]专利文献3EPH77565A
[0010]专利文献4EP0796912A
[0011]专利文献5EPO837IiMA
[0012]专利文献6W001/53459
[0013]专利文献7EP1170376A
[0014]专利文献8W02005/010175
[0015]专利文献9W096/17930
[0016]专利文献IOEPl7I5O55A
[0017]专利文献IlEPl7I5O56A
[0018]非专利文献IJ.Bacteriol.23(2006)8259-8271
[0019]非专利文献2J.Bacteriol.131 (1977) 1026-1028
【发明内容】
[0020]发明所要解决的问题
[0021]本发明的问题是提供一种与传统方法相比进一步有所改良的、通过使用含有甘油的基质的发酵方法进行的L-氨基酸生产方法。
[0022]解决问题的方法
[0023]本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现:虽然单独增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶这两种经由二羟基丙酮的甘油同化途径中的酶没有效果，但通过同时增强甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶，可以大幅提高从甘油生产L-氨基酸的能力，从而完成了本发明。
[0024]即，本发明如下所述。
[0025](I) 一种生产L-氨基酸的方法，包括在含有甘油作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力且经过修饰而增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性的属于肠杆菌科的微生物，从而在该培养基中或菌体内生成和蓄积L-氨基酸，并且从该培养基或菌体收集L-氨基酸。
[0026](2) (I)所述的方法，其中，所述酶的活性是通过提高编码所述甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因的拷贝数或者通过修饰所述基因的表达调节序列来增强的。
[0027](3) (I)~(2)所述的方法，其特征在于，所述二羟基丙酮激酶以ATP为磷酸供体。
[0028](4) (I)~(3)中任一项所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而增强了甘油的摄入活性。
[0029](5) (I)~(4)中所述`的方法，其中，所述微生物还经过修饰而增强了选自由丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖1，6- 二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛缩酶组成的群组中的I种以上的酶活性。
[0030](6) (I)~(5)中所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而降低了甘油激酶和/或膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的酶活性。
[0031](7) (I)~(6)中所述的方法，其中，所述属于肠杆菌的微生物为埃希氏菌属细菌或泛菌属(Pantoea)细菌。
[0032](8)⑴~(7)中所述的方法，其中，所述L-氨基酸为选自由L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-组氨酸组成的群组中的I种或2种以上的L-氨基酸。
[0033]本发明还涉及如下方面:
[0034]1.一种生产L-氨基酸的方法，包括在含有甘油作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力且经过修饰而增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性的属于肠杆菌科的微生物，从而在该培养基中或菌体内生成和蓄积L-氨基酸，并且从该培养基或菌体收集L-氨基酸。
[0035]2.项I所述的方法，其中，所述酶的活性是通过提高编码所述甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因的拷贝数或者通过修饰所述基因的表达调节序列而增强的。
[0036]3.项I或2所述的方法，其特征在于，所述二羟基丙酮激酶以ATP为磷酸供体。
[0037]4.项I~3中任一项所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而增强了甘油的摄入活性。[0038]5.项I~4中任一项所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而增强了选自由丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖1，6- 二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛缩酶组成的群组中的I种以上的酶活性。
[0039]6.项I~5中任一项所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而降低了甘油激酶和/或膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的酶活性。
[0040]7.项I~6中任一项所述的方法,其中,所述属于肠杆菌科的微生物为埃希氏菌属细菌或泛菌属细菌。
[0041]8.项I~7中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸为选自由L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-组氨酸组成的群组中的I种或2种以上的L-氨基酸。
[0042]实施本发明的最佳模式
[0043]以下，对本发明进行详细说明。
[0044]<1>本发明的微生物
[0045]本发明的微生物是具有L-氨基酸生产能力，且经过修饰而增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的活性增强的属于肠杆菌科的微生物。这里，L-氨基酸生产能力是指:当在培养基中培养本发明的微生物时，在培养基中或菌体内生成并蓄积L-氨基酸的能力。而且，本发明的微生物可以是具有多种L-氨基酸的生产能力的微生物。作为具有L-氨基酸生产能力的微生物，可以是本身具有L-氨基酸生产能力的微生物，也可以是采用突变方法或重组DNA技术对如下所述的 微生物进行修饰而具有了 L-氨基酸生产能力的微生物。
[0046]对于L-氨基酸的种类没有特殊限制，可以列举:L_赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸等碱性氨基酸，L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-甘氨酸等脂肪族氨基酸，L-苏氨酸、L-丝氨酸等作为羟基单氨基羧酸的氨基酸，L-脯氨酸等环式氨基酸，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸等酸性氨基酸，L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等侧链具有酰胺基的氨基酸。本发明的微生物可以是具有2种以上氨基酸的生产能力的微生物。
[0047]作为本发明的属于肠杆菌科的微生物，可以使用以埃希氏菌属细菌、泛菌属细菌为代表的属于肠杆菌科的微生物。作为其它的属于肠杆菌科的微生物，可以列举:肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等属于Y-变形细菌的属于肠杆菌科的微生物。
[0048]在本发明中，“甘油脱氢酶”是指:以NAD为辅酶，可逆地催化将甘油转变为二羟基丙酮的以下氧化反应的酶(EC:1.1.1.6)。
[0049]甘油(glycerol)+NAD=二羟基丙酮(dihydroxyacetone)+NADH+H+
[0050]在本发明中，“经过修饰而升高了甘油脱氢酶的活性”对应于下列情形:相对于野生株或非修饰株，平均每个细胞的甘油脱氢酶分子数增加，或者甘油脱氢酶的平均每个分子的活性提高。此外，当在野生株中不能检出的酶活性提高到能够检出的程度时，这种情况也包含在所述的“活性升高”中。这里，在本发明中，甘油脱氢酶的活性只要能够检出即可，优选经过修饰从而具有0.05U/mg以上、优选0.25U/mg以上、更优选0.5U/mg以上的酶活性。这里，作为属于肠杆菌科的微生物中的作为对照的野生株，可以列举大肠杆菌MG1655株(ATCC N0.47076)、和 W3110株(ATCC N0.27325),Pantoea ananatis AJ13335 株(FERM BP-6615)等。甘油脱氢酶活性可以参考Ansis，R.E等的方法来测定((1953) J.Biol.Chem.2-3，153-159)。
[0051]在本发明中，“二羟基丙酮激酶”是指:可逆地催化将二羟基丙酮转变为磷酸二羟基丙酮的以下反应的酶，该酶中有的以ATP为磷酸供体(EC2.7.1.29)，有的以PEP为磷酸供体(EC2.7.1.29) (Cell.Mol.Life Sc1.63 (2006) 890-900, Biochemistry.43 (2004) 1337-13045)。
[0052]ATP+二羟基丙酮(dihydroxyacetone) =ADP+憐酸二羟基丙酮(dihydroxyacetonephosphate) (EC2.7.1.29)
[0053]憐酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate) + 二羟基丙酮(dihydroxyacetone)=丙酮酸(pyruvate) + 憐酸二羟基丙酮(dihydroxyacetone phosphate) (EC2.7.1.29)
[0054]在本发明中，特别优选使用以ATP为磷酸供体的二羟基丙酮激酶。
[0055]“经过修饰而升高了二羟基丙酮激酶活性”对应于这样的情况:与野生株或非修饰株相比，每个细胞平均的二羟基丙酮激酶分子数增加，或者二羟基丙酮激酶的平均每个分子的活性提高。此外，当在野生株中不能检出的酶活性提高到能够检出的程度时，这种情况也包含在所述的“活性升高”中。优选经过修饰使得二羟基丙酮激酶的活性与野生株或非修饰株相比，平均每个菌体提高150%以上、优选200%以上，更希望平均每个菌体提高300%以上。这里，作为对照的属于肠杆菌科的微生物的野生株包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCCN0.47076)和 W3110 株(ATCC` N0.27325)、Pantoea ananatis AJ13335 株(FERM BP-6615)等。二羟基丙酮激酶活性可以参考Johnson EA等的方法来测定(J Bacteriol.19840ct ；160(1):55-60)。
[0056]编码甘油脱氢酶的基因包括例如gldA基因，这其中希望使用属于肠杆菌科的微生物来源的gldA基因。作为属于肠杆菌科的微生物，可以列举大肠杆菌。这里，作为大肠杆菌的基因，可以列举例如SEQ ID NO:1的gldA基因(GenBank登录号NC_000913的碱基序号4135955..4137058的互补链)。
[0057]而且，编码甘油脱氢酶的基因的同源物可以是基于与上述示例的基因的同源性，从埃希氏囷属、肠杆囷属、克雷伯氏囷属、沙雷氏囷属、欧文氏囷属、耶尔森囷属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属、弧菌属(vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、朽1 樣酸杆菌属(Citrobacter)、棒状杆菌属细菌等克隆得到的基因。表1示出了与大肠杆菌gldA基因具有高同源性、可以在本发明中作为编码甘油脱氢酶的基因利用的基因的例子。
[0058][表 I]
[0059]与大肠杆菌gldA基因的同源性高的、编码甘油脱氢酶的基因
【权利要求】
1.一种生产L-氨基酸的方法,包括: 在含有甘油作为碳源的培养基中培养具有L-氨基酸生产能力且经过修饰而增强了甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性的大肠杆菌，从而在该培养基中或菌体内生成和蓄积L-氨基酸，并且 从该培养基或菌体收集L-赖氨酸， 其中所述甘油脱氢酶源自大肠杆菌且所述二羟基丙酮激酶源自酿酒酵母。
2.权利要求1所述的方法，其中所述甘油脱氢酶是具有SEQID N0:2的氨基酸序列的蛋白质。
3.权利要求1所述的方法，其中所述二羟基丙酮激酶以ATP为磷酸供体。
4.权利要求1所述的方法，其中所述二羟基丙酮激酶是具有SEQID N0:4的氨基酸序列的蛋白质。
5.权利要求1所述的方法，其中所述甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶活性是通过增加编码甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶的基因的拷贝数，和/或修饰所述基因的表达控制序列而增强的。
6.权利要求1所述的方法，其中所述微生物还经过修饰而增强了甘油易化蛋白活性， 其中甘油易化蛋白活性是通过增加编码甘油易化蛋白的基因的拷贝数，或者将所述基因的启动子更换成更强的启动子而增强的。
7.权利要求1所述的方法，其中所述微生物还经过修饰而增强了选自由丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖1，6- 二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛缩酶组成的群组中的I种以上的酶活性。
8.权利要求1所述的方法，其中，所述微生物还经过修饰而降低了甘油激酶和/或膜结合型甘油-3-磷酸脱氢酶的酶活性。
【文档编号】C12R1/19GK103642863SQ201310367411
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2008年2月22日 优先权日:2007年2月22日
【发明者】长井由利, 林和之, 植田拓嗣, 臼田佳弘, 松井和彦 申请人:味之素株式会社