修饰的因子vii多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了修饰的因子VII多肽及其应用。这种修饰的FVII多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。本发明提供的修饰的FVII多肽是活性改变的那些多肽，通常具有改变的促凝血活性，包括促凝血活性增加。因此，这种修饰的多肽是治疗剂。
【专利说明】修饰的因子Vl I多肽及其应用
[0001]本申请是申请日为2008年4月11日的申请号为200880016982.6标题为“修饰的因子VII多肽及其应用”的申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]要求2007 年 4 月 13 日提交的题为 “MODIFIED FACTOR VII POLYPEPTIDES ANDUSES THEREOF”的美国临时申请N0.60/923，512的优先权，该临时申请的 申请人:为EdwinMadison, Christopher Thanos, Sandra Waugh Ruggles 和 Snaun Coughlin。
[0004]本申请涉及对应的美国申请N0.12/082, 662，题为“MODIFIED FACTOR VIIPOLYPEPTIDES AND USES THEREOF，，， 申请人:为 Edwin Madison, Christopher Thanos, SandraWaugh Ruggles和Shaun Coughlin,也要求美国临时申请N0.60/923, 512的优先权。
[0005]在允许的情况下，上述申请的每ー个的主题都全文包含在内作为參考。
发明领域
[0006]本发明提供了修饰的治疗性蛋白质。本发明特别提供了修饰的因子VII多肽及其应用，所述多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。
[0007]发明背景
[0008]止血是使出血停止的一个复杂的生理学过程。血小板、血浆蛋白、血管和内皮细胞是这个过程的三个成分，每个成分在组织损伤后的紧接事件中起重要作用，并且在正常情况下使血凝块快速形成。关键的是凝血级联反应，这是一系列蛋白酶解事件，其中某些血浆蛋白(或者凝血因子)在“级联”中相继被另一先被活化的凝血因子激活，导致凝血酶的迅速形成。随后在这个级联中产 生的大量凝血酶使纤维蛋白原裂解为血凝块形成所需的纤维蛋白肽。
[0009]凝血因子作为无活性的单链酶原循环，在一或多个部位被活化而产生双链活性形式的蛋白质。因子VII(FVII)是维生素K依赖性血浆蛋白，最初在血液中以酶原形式循环。FVII酶原在单一位置Arg152-1le153被蛋白酶解，产生由一个ニ硫键连接的双链蛋白酶(FVIIa)。FVIIa结合其辅因子-组织因子(TF)-形成复合物，其中FVIIa可有效地使因子X(FX)活化为FXa，从而起始导致纤维蛋白形成和止血的一系列事件。
[0010]虽然在大多数情况中实现正常止血，但是该过程中的缺陷可以导致出血性疾病，其中血凝块形成的时间延长。这种疾病可以是先天或者后天的。例如，血友病A和B是遗传性疾病，特征分别在于因子VIII (FVIII)和因子IX(FIX)的缺陷。替代治疗是血友病A和B的传统治疗方法，包括静脉内给予从人血浆中制备的或者作为重组蛋白质的FVIII或者FIX。然而在许多情况中，患者产生注入的蛋白质的抗体(也称作抑制剂)，其降低治疗
效カ或者使治疗无效。已经许可重组FVIIa (Novoseveii+11)用于治疗具有FVI11或FIX抑
制剂的血友病A或者B患者，且还用于终止与外伤和/或手术相关的出血事件或者防止出血。重组FVIIa也被许可用于治疗先天性FVII缺陷的患者，并越来越多地用于适应症外使用(off-label use)，如治疗与非血友病患者中先天性或者获得性出血疾病、外伤和手术相关的出血。[0011 ] 重组FVIIa促进血凝块形成的应用突出了其治疗治疗剂的越来越重要的特点。FVIIa治疗明显未满足临床需要。例如，给予临床试验数据，需要在6小时或更多的时间平均3剂的FVIIa以处理血友病患者的急性出血事件。需要更有效的FVIIa变体以减少这些需求。因此，本发明的ー个目的是提供修饰的FVII多肽，其被修饰为具有改良的治疗性质。
[0012]发明概述
[0013]本发明提供了修饰的因子VII (FVII)多肽。本发明特别提供了呈现促凝血活性的修饰的FVII多肽。该FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比在ー级序列中被修饰，且可包括氨基酸插入、缺失和置換。本发明提供的修饰的FVII多肽包括这样的多肽，其呈现出对于组织因子途径抑制剂(TFPI)的抑制作用抗性增加、对于抗凝血酶-1II (AT-1II)的抑制作用抗性增加、Zn2+结合力降低、药动学性质改良如半衰期延长、在有和/或无TF的条件下催化活性増加，和/或与活化的血小板的结合增強。所述修饰的FVII多肽可含有本文提供的修饰的任何组合，由此与未修饰的FVII多肽相比一或多个活性或者性质被改变。典型地，修饰的FVII多肽保留促凝血活性。本发明还提供了编码/表达修饰的FVII多肽的核酸分子、载体和细胞。本发明还提供了药物组合物、制品、试剂盒和治疗方法。FVII多肽包括等位基因和种变体以及具有影响其它活性和/或性质的修饰的多肽和其它变体。本发明还包括包含本发明提供的修饰的FVII多肽的活性片段。举例FVII多肽是包含所示氨基酸序列的那些多肽以及与其具有 60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的变体。
[0014]本发明的因子VII(FVII)多肽与未修饰的FVII多肽相比在ー级序列中被修饰，所述修饰可包括氨基酸插入、缺失和置換。本发明提供的修饰的FVII多肽包括这样的FVII多肽，其呈现出对于TFPI的抑制作用抗性增加，对于AT-1II的抑制作用抗性增加，Zn2+结合力下降，药动学性质改良，如半衰期延长，在有和/或无(组织因子)TF条件下催化活性增カロ，和/或与活化的血小板结合增強。所述修饰的FVII多肽可含有本发明提供的修饰的任意组合，从而与未修饰的FVII多肽相比该多肽的一或多种活性或者性质被改变。所述FVII多肽可包括改变性质和/或活性的其它修饰。典型地，所述修饰的FVII多肽保留促凝血活性。本发明还提供了编码/表达修饰的FVII多肽的核酸分子、载体和细胞。本发明也提供了药物组合物、制品、试剂盒和治疗方法。
[0015]特别地，本发明提供的修饰的因子VII (FVII)多肽的等位基因和种变体或者其活性片段或者其它变体。本发明提供了 FVII多肽，包括其等位基因变体和种变体或者其活性片段，其在对应具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽的D196、K197或者K199位置或者在FVII多肽包括其等位基因变体和种变体、活性片段的对应残基具有修饰，本发明还提供了针对其它活性或者性质修饰的其它FVII多肽。所述FVII多肽在对应含有SEQ IDNO: 3所示氨基酸序列的FVII多肽中D196、K197或K199的位置或者在FVII多肽的对应位置含有至少ー个修饰。所述修饰是选自如下的疏水性或者酸性氨基酸的插入和/或置換:Val (V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、Tyr(Y)、Cys(C)、Asp(D)和 Glu(E)。当提供活性片段时，该活性片段包含这种修饰。例如，本发明提供了这样修饰的因子VII (FVII)多肽、其等位基因和种变体或者其活性片`段或其它变体，其也包含选自如下的置換:D196F、D196W、D196L、D1961、D196Y、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199D、K199E 和 K197Y。[0016]此外，本发明提供的修饰的FVII多肽在其另一位置可含有进ー步的修饰，包括氨基酸置換、插入和缺失。在一些实例中，所述进ー步修饰是在对应选自D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341的位置的氨基酸置換，其中第一个修饰和第二个修饰位于不同的氨基酸。这些修饰可包括但不限于:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D 和 K341Q。其它举例的氨基酸插入修饰例如但不限于是如下任意插入:G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA和K197I198insS。其它举例的修饰的FVII多肽包括如下修饰:D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q 或 K197E/K199E/K341Q。[0017]本发明还提供了这样修饰的FVII多肽，包括其等位基因和种变体或者其活性片段或其它变体，其也可含有对应具有SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的FVII多肽或者FVII多肽对应位置中如下任一或多个氨基酸修饰:D196R、D196Y、D196F、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197E、K197D、K197L、K197M、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199D、K199E、G237W、G2371、G237V、R290M、R290V、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、 G237T238insSA、 D196K197insK、 D196K197insR、 D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA或者K197I198insS。此外，这些修饰的FVII多肽可含有在另一位置的进ー步的修饰，包括氨基酸置換、插入或者缺失。在一些实例中，所述进ー步修饰可以是在对应D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341位置的氨基酸置換，其中所述进ー步修饰与第一个修饰在不同位置。例如，所述修饰的FVII多肽可另外含有选自如下的氨基酸置换:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D和K341Q。举例的这种修饰的FVII多肽是包含选自如下修饰的那些多肽:D196R/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q和 K196V/K197E。
[0018]在一些情况中，修饰的因子VII (FVII)多肽、包括其等位基因和种变体或者其活性片段或者其它变体，可包含FVII多肽中两或多个修饰，其中至少两个氨基酸修饰对应具有或包含SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的FVII多肽如下修饰或者FVII多肽中对应残基的修饰:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA或者K197I198insS。所述多肽可包含多于两个的修饰，例如2、3、4、5、6或者7个修饰。
[0019]举例的这些多肽是这样的FVII多肽，其包含选自如下的修饰:D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、D196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q 和 K197E/G237V/M298Q。[0020]上述任何修饰的FVII多肽均可呈现出与未修饰的FVII多肽比对于组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增加。在一些实例中，所述修饰的FVII多肽的TFPI抗性是至少大约或是 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更高。此外，这些修饰的FVII多肽也可以含有实现磷脂结合的异源Gla结构域或者其足够部分。
[0021]本发明还提供了这样修饰的FVII多肽，其含有实现磷脂结合的异源Gla结构域或者其足够部分，如 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的异源Gla结构域。上述任何及所有修饰的FVII多肽也可包含Gla交换(swap)，包括本文举例和描述的Gla交換。
[0022]异源Gla结构域可选自因子IX(FIX)、因子X(FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长阻滞特异蛋白(Growth-arrest-specific protein)6 (Gas6)或者Z蛋白的Gla结构域。在一些实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽中的异源Gla结构域具有SEQ ID NO: 110-118、120和121所示任一氨基酸序列或者其足够部分以实现磷脂结合。对FVII多肽的修饰可以通过除去天然FVII Gla结构域的所有或者邻近部分而实现，这可包括具有或者包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中1_45位氨基酸或者FVII多肽中对应残基，并且用异源Gla结构域或者其足够部分置換以实现磷脂结合，例如増加磷脂结合。这种修饰可导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现出磷脂结合力增强。例如，所述修饰的FVII多肽可呈现出磷脂结合力增强至少大约或者增强1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更高。
[0023]所述修饰的FVII多肽的全部或者邻近部分的天然FVII Gla结构域被除去，并用异源Gla结构域或者其足够部分置換以实现磷脂结合。举例的这种多肽是这样的多肽，其中天然FVII Gla结构域包含具有或包含SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的FVII多肽中1_45位氨基酸或者FVII多肽中对应残基。Gla修饰包括但不限于Gla Swap FIX、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S 和 Gla Swap 凝血酶。
[0024]通过交換，修饰的FVII多肽可呈现出磷脂结合力增强。这种磷脂结合增强可以是增强至少大约或者增强 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更闻。
[0025]含有异源Gla结构域的修饰的FVII多肽在某些位置可含有进ー步修饰，导致或者呈现出与未修饰的FVII多肽相比对于组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增加。举例的这种修饰是在具有或包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341位置或者FVII多肽对应残基中的一或多个氨基酸修饰。特别地，这种修饰可包括选自如下的一或多个氨基酸修饰:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、 D196K197insY、 D196K197insW、 D196K197insA、 D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA 和 K197I198insS。例如，含有异源 Gla 结构域的修饰的FVII多肽也可含有氨基酸置换和/或氨基酸插入，例如但不限于:D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E 以及 D196R/K197M/K199E/R290E。
[0026]在一些情况中，这种进一步修饰导致修饰的多肽与不含有修饰-即未修饰的FVII多肽相比对于TFPI的抗性增加。
[0027]上述任何修饰的FVII多肽，包括呈现出对于TFPI抗性增加或者磷脂结合力增强或者这些性质的任意组合的多肽，可另外含有其它修饰，包括本领域所述的任何修饰。这种进ー步的氨基酸修饰可增加对抗凝血酶-1II (AT-1II)的抗性，增加与磷脂的结合和/或亲和性，增加对于组织因子(TF)的亲和性，增强内在活性，改变多肽的构象以改变酶原性，包括使构象改变为更具酶原样形状或者更不具备酶原样形状，増加蛋白酶抗性，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，提高稳定性，和/或促进化学基团连接。例如，本发明提供的修饰的FVII多肽可含有在具有或包`含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Q176、M298或者E296位置或者FVII多肽中对应残基中的修饰。在一些实例中，修饰的FVII多肽可另外含有选自Q176A、M298Q、E296V和/或E296A的的氨基酸修饰。在其它实例中，修饰的FVII多肽除了 Gla交換和/或其它指定的修饰之外，可另外含有一或多个如下进ー步的氨基酸修饰:S278C/V302C、L279C/N301C、V280C/V301C、S281C/V299C、在第 4 位的酪氨酸插入、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、I30D、I30E、K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A341、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82T T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N1451、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、
【权利要求】
1.修饰的因子VII(FVII)多肽，其包含异源Y-羧基谷氨酸(Gla)结构域或者其实现磷脂结合的足够部分，其中: 所述修饰的FVII多肽具有促凝血剂活性； 所述异源Gla结构域选自因子X(FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长停滞特异性蛋白6(Gas6)和Z蛋白中的Gla结构域；以及 所述足够部分是来自所述异源Gla结构域的30个或更多个连续氨基酸，由此与具有天然Gla结构域的FVII多肽相比，所述FVII多肽的磷脂结合被改变。
2.修饰的FVII多肽，其包含异源Gla结构域或者其实现磷脂结合的足够部分，其中: 所述异源Gla结构域选自因子IX (FIX)、因子X (FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长停滞特异性蛋白6 (Gas6)和Z蛋白中的Gla结构域； 所述修饰的FVII多肽具有促凝血剂活性； 所述足够部分是来自所述异源Gla结构域的30个或更多个连续氨基酸，由此与具有天然Gla结构域的FVII多肽相比，所述FVII多肽的磷脂结合被改变；以及 所述修饰的FVII多肽包含一或多个进ー步的氨基酸修饰，其中所述修饰选自:增加对抗凝血酶-1II (AT-1II)的抗性、增强对磷脂的结合和/或亲和性、増加对组织因子(TF)的亲和性、増加内在活性、増加TF依赖性催化或者凝血活性、増加凝血活性、改变多肽构象以改变酶原性、通过改变高活性与低活性FVIIa构象之间的平衡使之有利于高活性构象而增加催化或凝血活性、增加对蛋白酶的抗性、降低糖基化、增加糖基化、降低免疫原性、增加稳定性、和/或促进化学基团连接的插入、缺失和取代。
3.权利要求1的修饰的FVII多肽，其中所述异源Gla结构域具有SEQID NO: 110-118、120和121任一项所示的氨基酸序列，或者其实现磷脂结合的足够部分。
4.权利要求2的修饰的FVII多肽，其中所述异源Gla结构域具有SEQID NO: 110-118、120和121任一项所示的氨基酸序列，或者其实现磷脂结合的足够部分。
5.权利要求2的修饰的FVII多肽，其包含选自GlaSwap FIX,Gla Swap FX,Gla SwapProt C、Gla Swap Prot S、PGla Swap 凝血酶的修饰。
6.权利要求1的修饰的FVII多肽，其包含位于如下位置处的ー或多个进ー步的氨基酸修饰，所述位置选自具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341或FVII多肽中的对应残基。
7.权利要求2的修饰的FVII多肽，其中: 修饰的FVII多肽含有进ー步的修饰，与未修饰的FVII多肽相比表现出对组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增强。
8.权利要求7的修饰的FVII多肽，其中所述进ー步修饰是位于如下位置处的ー或多个氨基酸修饰，所述位置选自具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341或FVII多肽中的对应残基。
9.权利要求8的修饰的FVII多肽，其中所述ー或多个氨基酸修饰选自对应于如下的置换:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、 G237T238insSA、 D196K197insK、 D196K197insR、 D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA和 K197I198insS。
10.权利要求9的修饰的FVII多肽，其中所述ー或多个氨基酸修饰选自对应于如下的置换:D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E 和 D196R/K197M/K199E/R290E。
11.核酸分子，其包含编码权利要求1-10任ー项的修饰的FVII多肽的核苷酸序列。
12.载体，其包含权利要求11的核酸分子。
13.权利要求12的载体,其中所述载体是原核载体、病毒载体或者真核载体。
14.权利要求12或13的载体，其是哺乳动物载体。
15.权利要求13的载体，其中所述载体是选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒载体的病毒载体。
16.分离的细胞或培养的细 胞，其包含权利要求12-15任一项的载体或者权利要求11的核酸分子。
17.细胞，其包含权利要求12-15任一项的载体或者权利要求11的核酸分子，其中所述细胞是真核细胞。
18.权利要求17的细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
19.权利要求18的细胞，其中所述哺乳动物细胞选自幼仓鼠肾细胞(BHK-21)、293细胞和CHO细胞。
20.权利要求17的细胞，其是酵母细胞。
21.权利要求20的细胞，其是毕赤酵母(Pichiasp.)细胞。
22.权利要求21的细胞，其是巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。
23.药物组合物，其在药物可接受的载体中包含治疗有效浓度或量的权利要求1-10任ー项的修饰的FVII多肽，或者权利要求11的核酸分子，或者权利要求12-15任一项的载体，或者权利要求17-20任ー项的细胞。
24.权利要求23的药物组合物，其被配制为用于局部、系统或者局域给予。
25.权利要求23或24的药物组合物，其被配制为用于ロ服、经鼻、肺、颊、透皮、皮下、十二指肠内、肠道、胃肠外、静脉内或者肌内给予。
26.权利要求23-25任一项的药物组合物，其被配制为用于控制释放。
27.权利要求23-25任一项的药物组合物，其被配制为用于单ー剂量给予。
28.权利要求1-10任ー项的修饰的FVII多肽，用于治疗选自如下的疾病或病症:血液凝固病症、血液病、出血性病症、血友病、因子VII缺陷、出血病症、手术出血或者外伤导致的出血。
29.权利要求23-27任一项的药物组合物在制备治疗疾病或病症的药物中的应用，所述疾病或病症选自:血液凝固病症、血液病、出血性病症、血友病、因子VII缺陷、出血病症、手术出血或者外伤导致的出血。
30.权利要求28的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是是血友病A、血友病B或者血友病C。
31.权利要求28的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是先天性或获得性血友病。
32.权利要求28的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是由于手术或外伤所致的出血并发症所导致。
33.权利要求32的修饰的FVII多肽，其中出血表现为急性关节积血、慢性血友病性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血，或者脑出血。
34.权利要求32的修饰的FVII多肽，其中手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊椎手术、脑手术、血管手术、口腔手术，或者器官移植术。
35.权利要求34的修饰的FVII多肽，其中手术是选自骨髓、心、肺、胰腺和肝的移植木。
36.修饰的因子VII(FVII)多肽，所述修饰的因子VII(FVII)多肽在FVII多肽、其等位基因和种变体或者其活性片段中包含修饰，其中 所述修饰是在对应于具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽的D196、K197和K199的一或多个位置或在FVII多肽的对应残基的氨基酸置換；以及 所述修饰对应于选自如下的置换:D196F、D196W、D196L、D1961、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197Y、K197F、K197W、K199D 和 K199E,由此 所述修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比表现出对组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增强、对ATIII 抑制的抗性增强和/或凝血活性增强。
37.权利要求36的修饰的FVII多肽，其中FVII多肽中的修饰对应于选自K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199D 和 K199E 的置換。
38.权利要求36的修饰的FVII多肽，其中FVII多肽中的修饰对应于用Y置换197位的氨基酸。
39.权利要求36的修饰的FVII多肽，其进ー步包含在FVII多肽中另一位置的进ー步修饰。
40.权利要求39的修饰的FVII多肽，其中所述进ー步修饰是氨基酸置換、插入或者缺失。
41.权利要求39的修饰的FVII多肽，其中所述进ー步修饰是氨基酸置換或者插入，所述氨基酸置换或插入的位置对应于选自D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341的位置，其中第一个修饰与第二个修饰在不同氨基酸。
42.权利要求39的修饰的FVII多肽，其中所述进ー步氨基酸修饰选自对应于如下的置换:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D和 K341Q。
43.权利要求41的修饰的FVII多肽，其中所述进ー步修饰是选自如下的氨基酸插入:G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA 和 K197I198insS。
44.权利要求42的修饰的FVII多肽，其包含选自对应于如下置换的修饰:D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q 和 K197E/K199E/K341Q。
45.权利要求36的修饰的因子VII(FVII)多肽，所述修饰的因子VII (FVII)多肽在FVII多肽、其等位基因或种变体或者其活性片段中包含两或多个修饰，其中: 所述两或多个氨基酸修饰选自对应于具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的两或多个如下氨基酸修饰或者在FVII多肽的对应残基中的氨基酸修饰:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、 D196K197insK、 D196K197insR、 D196K197insY、 D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K1971198insE、K1971198insY、K197I198insA 或K197I198insS ； 至少ー个修饰选自 D196F、D196W、D196L、D1961、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197Y、K197F、K197W、K199D和K199E，并且第二个修饰与第一个修饰不同。
46.权利要求45的修饰的FVII多肽，其中所述FVII多肽含有2、3、4、5、6或7个修饰。
47.权利要求45的 修饰的FVII多肽，其包含选自如下的修饰:D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、D196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q 和K197E/G237V/M298Q。
48.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其与未修饰的FVII多肽相比表现出组织因子途径抑制剂(TFPI)抗性增加。
49.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其进ー步包含异源Gla结构域或者其实现磷脂结合的足够部分。
50.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其包含一或多个进ー步的氨基酸修饰，该修饰増加对抗凝血酶-1II (AT-1II)的抗性、增强磷脂结合力和/或亲和性、増加组织因子(TF)亲和性、増加内在活性、増加TF依赖性催化或者凝血活性、増加凝血活性、改变多肽构象以改变酶原性、通过改变高活性与低活性FVIIa构象之间的平衡使之有利于高活性构象而增加催化或凝血活性、増加蛋白酶抗性、降低糖基化、增加糖基化、降低免疫原性、増加稳定性，和/或促进化学基团连接。
51.权利要求36的修饰的FVII多肽，其包含在具有SEQID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的Q176、M298或E296位置或者在FVII多肽的对应残基中的一或多个进ー步修饰。
52.权利要求51的修饰的FVII多肽，其中所述氨基酸修饰选自Q176A、M298Q、E296V和 E296A。
53.权利要求52的修饰的FVII多肽，其包含选自如下的氨基酸修饰:K197E/G237V/M298Q、K197E/G237V/M298Q/K341Q、K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q、和 K197E/M298Q。
54.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其包含选自如下的一或多个进ー步
55.权利要求54的修饰的FVII多肽，其中未修饰的FVII多肽具有SEQID NO:3所示氨基酸序列。
56.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其中未修饰的FVII多肽具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列。
57.权利要求36-56任ー项的修饰的FVII多肽，其具有SEQID NO:225_230、232、233、235、242-244和250任一项所示氨基酸序列。
58.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其是人多肽。
59.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其是非人多肽。
60.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其是活性或者成熟多肽。
61.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其中仅ー级序列被修饰。
62.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其进ー步包含化学修饰或者翻译后修饰。
63.权利要求62的修饰的FVII多肽，其中FVII多肽被糖基化、羧化、羟化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化，或者与聚こニ醇(PEG)部分缀合。
64.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其是单链多肽。
65.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其是双链多肽。
66.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其是活化的多肽。
67.权利要求66的修饰的FVII多肽，其中活化通过自身激活蛋白酶解、因子IX(FIXa)裂解、因子X(FXa)裂解、因子XII (FXIIa)裂解或者凝血酶裂解实现。
68.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其保留未修饰的FVII多肽的ー或多种活性。
69.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60个氨基酸位置的修饰，条件是所述多肽保留未修饰的FVII多肽的至少ー种FVII活性， 其中所述ー或多种活性选自组织因子(TF)结合、因子X(FX)活化、因子IX(FIX)活化、磷脂结合力以及凝血活性。
70.核酸分子，其包含编码权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽的核苷酸序列。
71.载体,其包含权利要求70的核酸分子。
72.权利要求71的载体,其中所述载体是原核载体、病毒载体或者真核载体。
73.权利要求71的载体，其中所述载体是哺乳动物载体。
74.权利要求71的载体，其中所述载体是选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒的病毒载体。
75.分离的细胞或细胞培养物，其包含权利要求71的载体。
76.权利要求75的细胞或细胞培养物，其是真核细胞。
77.权利要求76的细胞或细胞培养物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
78.权利要求77的细 胞或细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞选自幼仓鼠肾细胞(BHK-21)或者293细胞或者CHO细胞。
79.细胞，其包含权利要求71的载体，其中所述细胞是酵母细胞。
80.权利要求79的细胞，其是毕赤酵母(Pichiasp.)细胞。
81.权利要求79的细胞,其是巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。
82.药物组合物，其包含治疗有效浓度或量的权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽。
83.权利要求82的药物组合物，其被配制为经局部、系统或者局域(topical)给予的形式。
84.权利要求82的药物组合物，其被配制为经ロ服、经鼻、肺、颊、透皮、皮下、十二指肠内、肠道、胃肠外、静脉内或者肌内给予的形式。
85.权利要求82的药物组合物，其被配制为控制释放形式。
86.权利要求82的药物组合物，其被配制为单ー剂量给予形式。
87.权利要求36-47任ー项的修饰的FVII多肽，用于治疗通过给予FVII或者促凝剂治疗的疾病或病症。
88.权利要求82的药物组合物在制备治疗通过给予FVII或者促凝剂治疗的疾病或病症的药物中的应用，其中要治疗的疾病或病症选自血液凝固疾病、血液病、出血性疾病、血友病、因子VII缺陷、出血疾病、手术出血或者外伤导致的出血。
89.权利要求87的修饰的FVII多肽，其中被治疗的疾病或病症选自血液凝固疾病、血液病、出血性疾病(hemorrhagic disorder)、血友病、因子VII缺陷、出血疾病(bleedingdisorder)、手术出血或者外伤导致的出血。
90.权利要求89的修饰的FVII多肽，其中所述疾病是血友病A或者血友病B或者血友病Co
91.权利要求89的修饰的FVII多肽，其中所述疾病是先天性或获得性血友病。
92.权利要求89的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是由于手术或外伤所致出血并发症导致。
93.权利要求92的修饰的FVII多肽，其中出血是急性关节积血、慢性血友病性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血，或者脑出血。
94.权利要求92的修饰的FVII多肽，其中手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊椎手术、脑手术、血管手术、口腔手术，或者器官移植术。
95.权利要求94的修饰的FVII多肽，其中所述手术是选自骨髄、心、肺、胰腺和肝的移植术的器官移 植手术。
【文档编号】C12N15/81GK103451172SQ201310367450
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2008年4月11日 优先权日:2007年4月13日
【发明者】E·L·麦迪逊, C·D·萨诺斯, S·W·拉格尔斯, S·库格林 申请人:催化剂生物科学公司