专利名称：因子vii融合多肽的制作方法
因子Vl I融合多肽本发明涉及具有延长半衰期的凝血因子VII (FVII)融合多肽，其中所述FVII多肽可被激活或者呈活化型。FVII是由肝脏产生的糖蛋白。FVII的活化型叫做FVIIa，在凝血中具有重要的作用。凝血过程是由于若干胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶之间的级联相互作用实现的。这些酶中的大多数被合成为无活性的前体酶原，在限制性蛋白水解期间酶原经过切割产生其活化型。具体而言，FVII被激活为FVIIa，FVIIa结合组织因子，其为在某些细胞的膜上组成型表达的脂蛋白。已知包括FXa和FIXa在内的某些蛋白酶引起FVII激活为FVIIa。FVII 的激活涉及通过蛋白酶剪切Arg (152)和Ile (153)之间的肽键将单链的FVII转化为双链活化型(FVIIa)。Ile (153)和Asp (343)之间盐桥的形成驱使从酶原样到活化型的FVIIa转化。当血管遭到破坏时，组织因子暴露于血液和循环中的FVIIa。随后已结合的组织因子与FVIIa分别使因子IX (FIX)和因子X (FX)激活，形成FIXa和FXa。血友病患者很少有或没有功能性凝血因子VIII或因子IX，并且一些患者产生了针对给予的因子的中和抗体，需要用旁路药剂(bypassing agent)诸如因子Vila进行治疗。尽管由于因子FVIIa的半衰期较短，利用因子VIIa进行预防在目前很麻烦并且昂贵，但是治疗血友病的最佳方式仍是预防性的。为了将因子VIIa的血浆浓度在要求时间期间内保持高于阈值水平，需要重复给药。开发了经修饰的FVII多肽，试图解决半衰期短的问题。例如，W02006/018204中阐述通过在FVII多肽序列的140到152氨基酸之间插入来自FX或者FIX的激活肽来进行修饰的FVII多肽。然而，在W02006/018204中阐述的该修饰多肽不能被激活为FVIIa。因此，仍然需要用于在保留FVII被激活为FVIIa的能力的同时增加FVII和FVIIa的半衰期的方法。本发明人确证通过将来自FX或者来自FIX的活化肽序列加到FVII多肽的某个位置，产生了可被激活为FVIIa的融合FVII多肽，其中未激活的FVII多肽和活化FVII多肽(FVIIa)均具有延长的半衰期。本发明第一方面涉及包含FVII或FVIIa多肽或其同源物和FX或FIX活化肽或其同源物的多肽，其中FX或FIX活化肽在FVII或FVIIa多肽的C-末端融合。FVII/FVIIa多肽和FX/FIX活化肽的同源物是生物学活性同源物。FVII/FVIIa多肽同源物和活化肽同源物的“生物学活性”在以下定义。本文所用术语“FVII多肽”，指未激活的成熟FVII多肽。本文所用术语“FVIIa多肽”，指FVII多肽的活化型，即FVII多肽在Argl52-Ilel53处的单个肽键断裂导致通过二硫键连接在一起的两条多肽链的形成。因此，FVIIa多肽与FVII多肽具有相同的序列，但是FVIIa多肽由两条多肽链而不是一条链形成。可将本发明的FVII或FVIIa多肽截短，然后在截短的多肽的C-末端融合FX或FIX活化肽。本文所用术语“截短的FVII或FVIIa多肽”，包括这样的FVII或FVIIa多肽，其不包含在野生型或同源FVII或FVIIa多肽的C末端的起始1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。本发明截短的FVII或FVIIa多肽具有生物学活性。亦可延长本发明FVII或FVIIa多肽，然后在延长多肽的C-末端融合FX或FIX活化肽。本文所用术语“延长的FVII或FVIIa多肽”，包括这样的FVII或者FVIIa多肽，其另外包含在野生型或同源的FVII或FVIIa多肽的C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基。本发明延长的FVII或FVIIa多肽具有生物学活性。本发明FVII和FVIIa融合多肽分别与野生型FVII多肽和/或野生型FVIIa多肽相比具有延长的半衰期。“FIX活化肽”或“FX活化肽”，指当成熟的FIX或FX多肽分别从其无活性型(酶 原)转化为其活性型时自成熟肽释放的肽。可将FIX和FX活化肽截短。术语“截短的FIX肽”和“截短的FX肽”分别包括这样的FIX肽或FX肽，其不包含在野生型或同源FIX或FX活化肽的C-末端和/或N-末端存在的起始1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。截短的FIX或FX活化肽具有生物学活性。亦可延长本发明FX或FIX活化肽。本文所用术语“延长的FX或FIX活化肽”包括这样的FX或FIX活化肽，其包含在野生型或同源活化肽的N-末端和/或C-末端的另外1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸残基。延长的FVII或FVIIa多肽具有生物学活性。野生型FVII多肽和野生型FVIIa多肽的序列如SEQ ID NO: I所示。该序列代表无前导序列的成熟FVII或FVIIa多肽。SEQ ID NO: I中的三字母表示“GLA”意即4_羧基谷氨酸U -羧基谷氨酸)。野生型FIX活化肽的序列在SEQ ID NO: 2中阐述。野生型FX活化肽的序列在SEQID NO:3中阐述。在本发明的一个实施方案中，本发明涉及这样的多肽，其包含SEQ ID NO: I所述的氨基酸序列的第 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 个到 397、398、399、400、401、402、403、404、405或406个残基或其同源物，所述活化肽包含SEQ ID N0:2所述氨基酸序列的第1、2、3、4、5或6个到30、21、32、33、34或35个残基或其同源物，或SEQ ID NO: 3所述氨基酸序列的第
1、2、3、4、5或6个到47、48、49、50、51或52个残基或其同源物。因此，本发明包括以下多肽序列，其为以SEQ ID N0:1的第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 位残基中的任一个开始并以 SEQ ID NO: I 的第 397、398、399、400、401、402、403、404 或405位残基中的任一个结束的多肽序列，其在C末端与活化肽融合，所述活化肽以SEQ IDN0:2的第1、2、3、4、5或6位残基中的任一个开始并以SEQ ID NO:2的第30、31、32、33、34或35位残基中的任一个结束或以SEQ ID N0:3的第1、2、3、4、5或6位残基中的任一个开始并以SEQ ID N0:3的第47、48、49、50、51或52位残基中的任一个结束。本文术语“多肽”概括性地指通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。它与肽、寡肽、寡聚物或蛋白质可互换使用并意思相同，并包括糖蛋白及其衍生物。术语“多肽”还意欲包括同源物，其中所述同源物与参考蛋白保持相同(或更高)的生物学活性。在本发明中，FVII或FVIIa多肽的同源物与在SEQ ID NO: I中所述的野生型FVII或FVIIa多肽具有相同或更高生物学活性。在本文中，术语同源物包括变体。
野生型FVIIa的生物学活性是该多肽将其底物FX转变为活性FXa的能力。当本发明多肽是FVII多肽时，在可测定其生物学活性之前必须首先将其激活为FVIIa。FVIIa多肽的生物学活性可用如下的“体外蛋白水解测定”来确定
在含有0.1 M NaCl、5 mM CaCl2和I mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100微升50 mMHepes (pH 7.4)中，将因子Vila (10 nM)和因子X (0.8 U M)于微滴板中孵育15分钟。然后通过加入含有0. I M NaCl、20 mM EDTA和I mg/ml牛血清白蛋白的50微升50 mM Hepes(pH 7. 4)来终止FX切割。通过加入终浓度为0. 5 mM的显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺(S-2765，Chromogenix，瑞典)来测量产生的FXa的量。在SpectraMax (TM) 340读板仪(Molecular Devices, USA)中连续测量其在405 nm处的吸光度。将在10分钟期间显 现的吸光度减去不含FVIIa的空白孔的吸光度后，用于计算同源FVIIa和野生型因子FVIIa(如SEQ ID NO: I中所述)的蛋白水解活性的比率
比率=(A405 nm因子VIIa同源物)/(A405 nm SEQ ID NO: I中所述的因子VIIa多肽)在本测试中，将高于0.8 (任选包括约为或高于1、1. 25和1.5)的比率定义为本发明生物活性多肽。在一个实施方案中，本发明的FVII或FVIIa多肽延伸至与SEQ ID NO: I中定义的野生型FVII或FVIIa多肽具有至少80%同源性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述序列可与SEQ ID NO: I中的野生型FVII或FVIIa多肽氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 4% 或 99. 5% 的同源性 / 同一性。众所周知，氨基酸水平的同源性一般是就氨基酸的相似性或同一性而言。可通过目测和数学计算来测定序列同源性百分比。用可公开获得的计算机软件例如BLAST或ALIGEN，可以以多种方式来实现用于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对。例如，可用XBLAST程序来进行蛋白质检索，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适的参数，包括在所比较的序列全长范围内的最大比对所需的任何算法。本发明FVIIa多肽的同源物与SEQ ID NO: I的野生型FVIIa多肽具有相同或更高的生物学活性。一旦FVII多肽被激活为FVIIa多肽，则本发明FVII多肽的同源物与SEQ ID NO: I的野生型FVIIa多肽具有相同或更高的生物学活性。本发明变体多肽包括在US2006/0166915、W002/077218、US2003/0100075、US2003/0130191 和 W02004/029090 中公开的所有变体多肽序列，这些公开内容通过弓I用全部并入本文。在一个实施方案中，本发明FIX或FX活化肽延伸至分别与SEQ ID N0:2或N0:3中的野生型FIX或FX活化肽有至少80%同源性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述序列与所述野生型FIX或FX活化肽氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 4% 或 99. 5% 的同源性 / 同一性。在本发明背景下FIX或FX活化肽的生物活性，是提高本发明融合多肽的血浆半衰期高于添加活化肽之前FVII或FVIIa多肽血浆半衰期的能力。融合蛋白半衰期比添加活化肽之前的FVII或FVIIa多肽半衰期长大约或超过5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%或 200%。术语血楽；“半衰期”是指使对于特定蛋白而言,仅剩余初始蛋白库(protein pool)的50%所花的时间。半衰期可通过ELISA测量。
本发明FVII或FVIIa多肽或FIX或FX肽的同源物可为(i)其中一个或更多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的多肽，且所述取代的氨基酸残基可由或可不由遗传密码编码；或(ii)其中一个或更多个氨基酸残基包括取代基的多肽。优选具有以上定义的多肽氨基酸序列的同源物，其中若干个例如5-10、1-5、1_3、
2、1或没有氨基酸残基以任意组合被取代、缺失或添加。其中尤其优选沉默取代、缺失和添加，其不改变本发明蛋白的性质和活性。在这方面还尤其优选保守取代。因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(含有脂肪族侧链的氨基酸)经常可以彼此取代。其中可能的取代优选用甘氨酸和丙氨酸来相互取代(因为它们有相对短的侧链)和用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸相互取代(因为它们有较大的疏水脂肪族侧链)。可经常彼此取代的其它氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(含有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(含有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(含有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(含有酰胺侧链的氨基酸)；半胱氨酸和甲硫 氨酸(含有含硫侧链的氨基酸)。这种类型的取代通常被称为“保守”或“半保守”氨基酸取代。亦可相对于用于以上提及的融合多肽的氨基酸序列进行氨基酸缺失。因此，例如，对多肽的活性没有实质影响或至少不会消除所述活性的氨基酸可缺失。所述缺失可为有利的，因为可降低多肽的全长和分子量但同时保持活性。这可使特定目的所需的多肽的量降低一例如可降低剂量水平。亦可相对于以上融合多肽的序列来进行氨基酸插入。可实施插入以改变本发明的物质的性质(例如有助于鉴定、纯化或表达，其如以上关于融合多肽所解释的)。可用任何适当的技术例如通过用定向诱变来使相对于以上a)中所给的序列发生
氨基酸变化。应该了解，可用天然存在的或非天然存在的氨基酸来进行本发明范围内的氨基酸取代或插入。不管使用的是天然还是合成的氨基酸，优选只存在L-氨基酸。在本发明又一实施方案中，本发明FVII或FVIIa多肽延伸至相对于SEQ ID NO: I的氨基酸序列包含一个或更多个取代的同源物，其中所述取代为用选自以下位置的任何一个或更多个氨基酸取代对应于SEQ ID NO: I氨基酸位置的第172、173、175、176、177、196、197、198、199、200、203、235、237、238、239、240、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、297、299、319、320、321、327、341、363、364、365、366、367、370 或 373 位。本文所用术语“任何一个或更多个氨基酸”是指与SEQ ID NO: I中氨基酸不同的一个或更多个氨基酸。这包括但不限于可由多核苷酸编码的氨基酸。在一个实施方案中，不同的氨基酸呈天然的L-型，可由多核苷酸编码，具体实例是L-半胱氨酸(Cys)。在以下实施方案中，表述“至少”是指仅指定的氨基酸被取代，或除分子中一个或更多个其它氨基酸发生变化外，还有特定氨基酸被取代。在以下实施方案中，关于SEQ ID NO: I的氨基酸取代如下字母代表在SEQ IDNO: I位置中天然存在的氨基酸，后面的数字代表在SEQ ID NO: I中的位置。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少G237被选自Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少T238被选自Ala、Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少T239被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少Q286被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。
在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L287被选自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L288被选自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少D289被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少R290被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少A292被选自Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少T293被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少A294被选自Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L295被选自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L297被选自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少V299被选自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少M327被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少K341被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或V IIa多肽为同源物，其中至少S363被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少W364被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少G365被选自Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少Q366被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少Q366被选自Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser 的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少V172被选自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少N173被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少A175被选自Gly、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少Q176被选自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L177被选自Gly、Ala、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少D196被选自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少K197被选自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少1198被选自Gly、Ala、Leu、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少K199被选自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少N200被选自 Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少N203被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少V235被选自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少N240被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少D319被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少S320被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少P321被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys、Arg、Cys> Ser 或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少G367被选自Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少T370被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少H373被选自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少i) L287被选自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被选自Thr或Ser的氨基酸取代，和iii) M298被Lys取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少i) L287被选自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被选自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) E296被选自lie、Leu、Thr或Val的氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少i) L287被选自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被选自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) V185被选自Asp或Glu的氨基酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少i) L287被 选自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被选自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) E296被选自lie、Leu、Thr或Val的氨基酸取代，和v) V158被选自Asp或Glu的氨基酸取代。关于SEQ ID NO: I,以下阐述的用于氨基酸取代的术语如下
第一个字母代表在SEQ ID NO: I位置中天然存在的氨基酸。后面的数字代表在SEQ IDN0:1中的位置。第二个字母代表取代天然氨基酸的不同的氨基酸。实例为K197A-FVII，其中SEQ ID NO: I中197位置的赖氨酸被丙氨酸取代。在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为选自以下的多肽
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权利要求
1.一种多肽，所述多肽包含因子VII (FVII)或因子Vila (FVIIa)多肽或其同源物和因子X (FX)或因子IX (FIX)活化肽或其同源物，其中所述FX或FIX活化肽在所述FVII或FVIIa多肽的C末端融合。
2.权利要求I的多肽，其中所述FVII或FVIIa多肽包含SEQID NO: I所述氨基酸序列或其同源物的第 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 到 397、398、399、400、401、402、403、404、405 或406位残基，并且所述活化肽包含SEQ ID NO:2所述氨基酸序列或其同源物的第1、2、3、4、5或6到30、31、32、33、34或35位残基或SEQ ID NO:3所述氨基酸序列或其同源物的第I、2、3、4、5 或 6 到 47、48、49、50、51 或 52 位残基。
3.权利要求I或权利要求2的多肽，其中所述FVII或FVIIa多肽相对于SEQID NO: I的氨基酸序列包含一个或更多个取代，其中所述取代是被选自对应于SEQ ID NO:l的氨基酸位置的第 172、173、175、176、177、196、197、198、199、200、203、235、237、238、239、240、 286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、297、299、319、320、321、327、341、363、364、365、366、367、370或373位的任何一个或更多个氨基酸的取代。
4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述多肽为分离多肽和/或为重组多肽。
5.—种核酸序列，其编码权利要求1-4中任一项的多肽。
6.—种载体,其包含权利要求5的核酸。
7.—种宿主细胞，其包含权利要求5的核酸或权利要求6的载体。
8.—种产生FVII多肽的方法，所述方法包括在促进所述多肽表达的条件下培养权利要求7的宿主细胞，并从培养物中回收所表达的多肽。
9.权利要求8的方法，所述方法还包括纯化所表达的多肽的步骤。
10.权利要求9的方法，其中所述纯化步骤包括激活所述FVII多肽。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项的多肽。
12.权利要求1-4中任一项的多肽或权利要求11的药物组合物，其用于药物。
13.权利要求1-4中任一项的多肽在制备用于治疗凝血缺陷的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述凝血缺陷是A型血友病出型血友病；因子XI缺陷和因子VII缺陷；包括手术或其它组织损伤出血在内的过量出血或不必要的出血；或因血小板功能缺陷、血小板减少症或血管性血友病而导致的出血。
15.一种治疗与凝血缺陷相关病况的方法，所述方法包括给予受试者权利要求1-4中任一项的多肽或权利要求11的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及具有延长的半衰期的因子VII(FVII)融合多肽，其中所述FVII多肽可被激活或处于活化型。
文档编号C12N15/62GK102753575SQ201180007544
公开日2012年10月24日 申请日期2011年1月27日 优先权日2010年1月28日
发明者E.珀森 申请人:诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司