通过热处理降低因子Ⅶ多肽组合物中的二聚体含量的制作方法

专利名称：通过热处理降低因子Ⅶ多肽组合物中的二聚体含量的制作方法
技术领域：
本发明涉及降低因子VII多肽组合物特别是包含因子VII变异体的组合物中二聚 体含量的方法。
背景技术：
参与凝血级联的因子VII已证明为治疗各种病理状态的可用治疗剂。因此，对包 含药学可接受的并显示均一和预定临床功效的活化因子VII多肽的制剂的需求日益增长。在商业生产因子VII多肽的过程中，避免聚集物例如目标多肽的二聚体和寡聚体 的形成是一大难题。该类产物-相关杂质是不利的因为它们具有潜在的抗原性。通常避免 极端PH和高温以控制生产过程中聚集物/ 二聚体的形成。WO 2007/026020A1涉及纯化包含生产双产物(biproduct)因子VII和因子VIIa 多肽的组合物并最小化因子VII或因子VIIa自体降解产物同时形成的方法。因此，关于因子VII多肽的生产，需要一种生产步骤藉此降低因子VII多肽二聚体 (包括更高级的寡聚体)的存在而不显著降低产率。这将可以获得更安全和更稳定的药物 并最终获得更安全和更稳定的药品。发明概述本发明通过应用热处理步骤降低二聚体(和更高级的寡聚体)的含量解决了之前 提及的问题。具体而言，本发明提供了降低包含因子VII多肽的组合物中二聚体含量的方法， 所述方法包括以下步骤(a)必要时将所述组合物的pH调节至4. 5-10. 0范围内的值(于5°C测定)；(b)将该组合物加热至20-50°C范围内的温度至少5分钟；以及(c)接着冷却组合物至最高为10°C的温度。附图简述

图1显示了于37°C热处理120分钟的V158D/E296V/M298Q-FVII组合物样品中二 聚体含量的变化。标度以分钟计时。图2显示了除分别于23°C或37°C加热或保存于5-8°C (对照)48小时之外三个相 同的V158D/E296V/M298Q-FVII组合物样品中二聚体含量的变化。标度以小时计时。图3显示了本文所述发明结束后残留HMWP(多聚体和寡聚体)、单体和盐的量。图4显示了 V158D/E296V/M298Q-FVII组合物样品中二聚体含量的变化，其中于 37°C热处理168小时之前已将pH调节至9. 5。标度以小时计时。发明详述如上文所述，本发明涉及降低包含因子VII多肽的组合物中二聚体含量的方法。 该方法可有利地应用于生产因子VII多肽的总过程的最后阶段，因为对组合物的进一步操 作，包括加热、PH变化、与色谱物质接触等可能引起二聚体的重新形成。该方法包括以下步骤，其中步骤(a)是非强制性的(a)必要时将所述组合物的pH调节至4. 5-10. 0范围内的值(于5°C测定)；
(b)将该组合物加热至20-50°C范围内的温度至少5分钟；以及(c)接着冷却该组合物至最高为10°C的温度。包含因子VII多肽的组合物如本文所使用，用语“组合物”意指液体组合物，优选含水液体组合物，即包含小于5%非水溶剂的组合物。用于该方法的组合物包含因子VII多肽以及二聚体形式的某些杂 质。术语“二聚体”包括任何因子VII多肽的真正二聚体以及更高级的寡聚体和聚集物(例如三聚体、四聚体等)。已观察到一些因子VII多肽变异体与野生型因子VII相比形 成二聚体的趋势增加。这一增加的二聚体形成可由以下事实解释，即因子VII多肽变异体 与野生型因子VII具有不同的结构并因此具有不同的性质。该不同性质的一个实例为它们 的展开温度，即它们的熔点。当因子VII多肽展开时，它们的表面变得更加疏水并且它们因 此倾向于和其他未展开的疏水因子VII多肽相互作用，藉此形成二聚体。由于这一原因，本 发明可尤其，尽管不是专有地，应用于该类因子VII多肽变异体的组合物。本发明方法尤其可用于具有相对高含量二聚体的组合物，即未处理组合物(即步 骤(b)之前)中的二聚体含量至少为3%，例如至少4%、例如至少5%、例如至少6%、例如 至少8%或甚至至少10%。术语“因子VII多肽”更详细地描述于下文。基于初步观察，我们认为本发明尤其 适用于非天然形式的因子VII，例如因子VII变异体，因为这一组内的多肽显示出形成二聚 体的更高倾向。因此在一个实施方案中，用于本发明方法的因子VII多肽为非野生型人因 子Vila，例如因子VII变异体。组合物中因子VIIa浓度方便地表示为mg/mL或IU/mL，Img通常表示 43000-56000IU或更多。组合物中因子VII多肽的浓度通常为至少0. 01mg/mL或至少 0. lmg/mL。在不同的实施方案中，组合物中存在的因子VII多肽的浓度为0. l-90mg/mL ； 0. 5-80mg/mL ；1. 0_80mg/mL ；1. 5_70mg/mL ； 2_60mg/mL ；3_50mg/mL ；或 5_50mg/mLo组合物在步骤(a)之前，并且特别是在步骤(a)的任何应用之后，可包括可保持pH 在特定范围之内即4. 5-10. O的缓冲剂(应理解为单一试剂或试剂的组合)。在一个实施方案中，该缓冲剂为至少一种选自以下的组分MES、PIPES、ACES、BES、 TES、HEPES、TRIS、组氨酸、咪唑、甘氨酸、双甘氨肽、甘氨酰胺、磷酸、醋酸(例如醋酸钠或醋 酸钙)、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸的酸和盐。应理解的是缓冲 剂可包含两种或更多种组分的混合物，其中所述混合物可提供在特定范围内的PH值。醋酸 和醋酸钠等可作为实例提及。选择缓冲剂的浓度使可以维持组合物优选的pH。在各个实施方案中，缓冲剂的浓 度为 I-IOOmM ； l-50mM ;l-25mM ；或 2_20mM。已观察到当pH升高时因子VII多肽易于自体活化和降解。另一方面，当pH降低 时因子VII多肽更可能二聚体化和聚集。选择因子VII多肽组合物的PH范围这样可在解 决这两个PH-相关问题之间找到最好的折衷方案。该pH范围预期在化学和因此结构特性 互不相同的不同因子VII多肽之间不同。在本发明的一个实施方案中，组合物的pH保持在 4. 5-10的范围内，例如5-10的范围内，例如9-10的范围内。在本发明的另一实施方案中， 组合物的PH保持在4. 5-9. 5的范围内；例如在4. 5-8. 5的范围内；例如在4. 5-7. 5的范围内，例如在4. 5-6. 5的范围内；例如在4. 5-6. O的范围内；例如在5. 0-6. 5的范围内；例如 在5. 0-6. 0的范围内；例如在5. 2至约5. 9的范围内。当提及pH值时，采用在约5°C测量的值。组合物在应用热处理(步骤(b))之前优选保持于最高为10°C，特别是最高为5°C 的温度。在优选的实施方案中，组合物包含钙盐或镁盐，例如氯化钙或醋酸钙。钙离子结合因子VII多肽并对于因子VII多肽Gla结构域的正确折叠是必需的，这样因子VII多肽特 别是其Gla结构域可避免自体蛋白水解降解。预期镁离子可以与钙离子相同的方式保护因 子VII多肽。组合物也可包括其他组分，例如可调节溶液重量摩尔渗透压浓度的张力调节剂。 该张力调节剂通常包括至少一种选自以下的物质中性盐、氨基酸、2-5个氨基酸残基的 肽、单糖、双糖、多糖和糖醇。在一些优选的实施方案中，该组合物包含两种或更多种该类物 质的组合。“中性盐”指当溶于水溶液中不是酸也不是碱的盐。在一个实施方案中，至少一种张力调节剂为选自以下的中性盐钠盐、钾盐、钙盐 和镁盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化钙、醋酸钙、葡糖酸钙、乙酰丙酸钙、氯化镁、醋酸镁、葡糖 酸镁和乙酰丙酸镁。在一个优选的实施方案中，该张力调节剂包括氯化钠与选自氯化钙、醋酸钙、氯化 镁和醋酸镁的至少之一的组合。在另一优选的实施方案中，该张力调节剂为选自氯化钠、氯化钙、蔗糖、葡萄糖和 甘露醇的至少之一。通常，该张力调节剂的浓度为至少ImM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM、 至少lOOmM、至少200mM、至少400mM、至少800mM、至少lOOOmM、至少1200mM、至少1500mM、至 少 1800mM、至少 2000mM 或至少 2200mM。在一系列的实施方案中，该张力调节剂的浓度为5_2200mM，例如25-2200mM,50_2200mM，100_2200mM，200_2200mM，400_2200mM，600_2200mM， 800-2200mM,1000_2200mM，1200_2200mM，1400_2200mM，1600_2200mM，1800_2200mM，或 2000-2200mM ；5_1800mM，25_1800mM，50_1800mM，100_1800mM，200_1800mM，400_1800mM， 600-1800mM,800-1800mM,1000-1800mM,1200-1800mM,1400-1800mM,1600-1800mM ； 5-1500mM,25_1400mM，50_1500mM，100_1500mM，200_1500mM，400_1500mM，600_1500mM， 800-1500mM,1000-1500mM,1200-1500mM ；5-1200mM,25-1200mM,50-1200mM,100-1200mM, 200-1200mM, 400-1200mM, 600-1200mM,或 800-1200mM。通常，包含因子VII多肽的组合物获自之前的纯化步骤。在尤其相关的实施方案 中，步骤(a)之前有阴离子交换色谱法步骤。已观察到在这一阴离子交换步骤中产生高浓 度的因子VII多肽二聚体。因此，将这一步骤置于可一起降低剩余二聚体数量的本发明调 节PH、加热和冷却步骤之前尤其有用。因子VII多肽如本文所使用，术语“因子VII多肽”或“FVII多肽”指包含野生型人因子VIIa的 氨基酸序列1-406 (即具有美国专利号4，784，950公开的氨基酸序列的多肽)的任何蛋白 质、其变异体以及因子VII-相关多肽、因子VII衍生物和因子VII缀合物。这包括相对于野生型人因子Vila显示出实质(substantially)相同或提高的生物学活性的因子VII变 异体、因子VII衍生物和因子VII缀合物。术语“因子VII”涵盖未裂解(酶原)形式的因子VII多肽以及经蛋白水解加工 形成它们各自生物学活性形式的那些，其可命名为因子Vila。通常因子VII在残基152和 153之间裂解形成因子Vila，即因子VII的活化形式。该因子VII的变异体可显示相对于 人因子VII不同的性质，包括稳定性、磷脂结合、改变的特异活性等。上述定义内的“因子VII”或“因子Vila”还包括从一个个体到另一个可能存在和 发生的天然等位基因变异。而且，糖基化或其他翻译后修饰的程度和位置可随所选宿主细 胞和该宿主细胞环境的性质变化。如本文所使用，“野生型人FVIIa”为具有美国专利号4，784，950中公开的氨基酸 序列的多肽。如本文所使用，“因子VII-相关多肽”包括相对于野生型因子VIIa的活性其中的 因子VIIa生物学活性被实质性修饰例如降低的多肽，包括变异体。这些多肽包括但不限 于已向其中引入的修饰或破坏该多肽生物活性的特异氨基酸序列改变的因子VII或因子 VIIa0如本文所使用术语“因子VII衍生物”意指相对于野生型因子VII显示出实质相 同或提高的生物学活性的FVII多肽，其中母体肽的一个或更多个氨基酸被遗传和/或化学 和/或酶促修饰，例如通过烷基化、糖基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等。这包括但 不限于PEG化人因子Vila、半胱氨酸-PEG化人因子VIIa及其变异体。因子VII衍生物的 非限制性实例包括WO 03/31464和美国专利申请US 20040043446， US 20040063911， US 20040142856， US 20040137557， US 20040132640，W02007022512,和 US20070105755 (Neose Technologies, Inc.)中公开的 糖 PEG 化 FVII 衍生物；如 WO 01/04287、美国专利申请 20030165996、WO 01/58935、WO 03/93465 (Maxygen ApS)和W002/02764、美国专利申请20030211094 (明尼苏达大学)中公 开的FVII缀合物。术语“提高的生物活性”指i)与重组野生型人因子VIIa相比具有实质相同的或 增加的蛋白水解活性的FVII多肽或ii)与重组野生型人因子VIIa相比具有实质相同的或 增加的TF结合活性的FVII多肽或iii)与重组野生型人因子VIIa相比具有实质相同或增 加的血浆半衰期的FVII多肽。术语“PEG化人因子Vila”指具有与人因子VIIa多肽缀合的PEG分子的人因子 Vila。应理解的是该PEG分子可结合至因子VIIa多肽的任何部分，包括因子VIIa多肽的 任何氨基酸残基或碳水化合物部分。术语“半胱氨酸-PEG化人因子Vila”指具有与引入人因子VIIa的半胱氨酸的巯 基基团缀合的PEG分子的因子Vila。如本文所使用，术语“因子VII变异体”指显示出与野生型因子VII实质相同或更 好生物活性，或相对于野生型因子VII显示出被实质性修饰的或降低的生物活性的FVII多 肽，并且是具有通过插入、缺失或替换一个或更多个氨基酸与野生型因子VII序列不同的 氨基酸序列的多肽。与重组野生型人因子VIIa相比具有实质相同或增加的蛋白水解活性的因子 VII 变异体的非限制性实例包括 S52A-FVIIa、S60A_FVIIa(Lino 等，Arch. Biochem. Biophys. 352 182-192，1998)；如美国专利号5，580，560公开的显示出增强的蛋白水解 稳定性的FVIIa变异体；在残基290和291之间或残基315和316之间被蛋白水解裂解 的因子 Vila(MolIerup 等，Biotechnol. Bioeng. 48 :501_505，1995)；因子 VIIa 的氧化形 式(Kornfelt 等，Arch. Biochem. Biophys. 363 :43_54，1999) ；PCT/DK02/00189 (对应于 WO 02/077218)中公开的FVII变异体；和WO 02/38162中公开的显示出增强的蛋白水解稳定 性的FVII变异体；如以下公开的具有经修饰的Gla-结构域并显示出增强膜结合的FVII变 异体WO 99/20767，美国专利 US 6017882 和 US 6747003，美国专利申请 20030100506 (明 尼苏达大学)和 WO 00/66753，美国专利申请 US 20010018414、US 2004220106 和 US 200131005，美国专利US6762286和US 6693075 (明尼苏达大学)；以及以下公开的FVII变 异体WO 01/58935、美国专利 US 6806063、美国专利申请 20030096338 (Maxygen ApS)、WO 03/93465(Maxygen ApS)、WO 04/029091(Maxygen ApS)、WO 04/083361(Maxygen Ap S)和 WO 04/111242 (Maxygen ApS)以及 WO 04/108763 (加拿大血液服务中心(CanadianBlood Services))。与野生型FVIIa相比具有增强的生物学活性的FVII变异体的非限制性实例包括 如以下公开的 FVII 变异体W0 01/83725、W002/22776、WO 02/077218、WO 03/027147、WO 04/029090、W005/075635 和申请号为 05108713. 8 (Novo Nordisk A/S)的欧洲专利申请、WO 02/38162 (Scripps Research Institute)；以及如 JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeut ic Res Inst.)中公开的具有增强活性的FVIIa变异体。因子VII变异体的实例包括但不限于P10Q-FVII,K32E-FVII,P10Q/K32E-FVII,L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/ L305V-FVII， V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII， K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, 禾口 S336G-FVII，L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/ M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/ V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/ M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/ Vl58T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII， S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/ M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/ V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/ L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/ M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/ E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/ L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/ E296V-FVII， S314E/L305V/E296V/M298Q-FV II， S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII， S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/ L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/ L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, Κ316Η/ L305V/V158D-FVII, Κ316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/ V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, Κ316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, Κ316Η/ L305V/K337A/E296V-FVII, Κ316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/ M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, Κ316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, Κ316Η/ L305V/V158T/E296V-FVII，Κ316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/ E296V/M298Q-FVII, Κ316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, Κ316H/L305V/V158T/ K337A/M298Q-FVII, Κ316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, Κ316H/L305V/V158D/ K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/ E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/ L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, Κ316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/ M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/ K337A/M298Q-FVII， Κ316Q/L305V/K337A/E296V-FVII， K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/ M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, Κ316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/ L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/ V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/ K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/ M298Q/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/K337A-FVII， F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/ S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/ L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/ M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/ S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/ S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/ S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/ V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/ L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/ E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/ L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/ S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/ M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/ K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/ E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/ V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/ E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/ V158T/M298Q/E296V-FVII， F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/ S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/ S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/ S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/ S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ K337A/S314E-FVII， F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII， F374Y/L305V/E296V/ M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/ E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/ L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-因子 VII， S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII，S344A-因子 VII，T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G29IN-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/ V317T-FVII ；和在氨基酸序列233Thr至240Asn中具有替换、添加或缺失的FVII ；在氨基酸 序列304Arg至329Cys中具有替换、添加或缺失的FVII ；和在氨基酸序列153Ile至223Arg 中具有替换、添加或缺失的FVII。因此，因子VII多肽中的替换变异体包括但不限于ΡΙΟ, K32, L305, M306, D309, V158, E296, K337, M298, S336, S314, K316, F374, S52, S60, R152, S344, T106, K143, N145, V253, R290, A292, G291, R315, V317 位的替换，以及氨 基酸序列T233至N240或R304至C329 ；或1153至R223中的替换、添加或缺失，或其组合， 特别是变异体例如 P10Q, K32E, L305V, M306D, D309S, L305I, L305T, F374P, V158T, M298Q, V158D, E296V, K337A, M298Q, M298K, S336G, S314E, K316H, K316Q, F374Y, S52A, S60A, R152F, S344A, T106N, K143N, N145T, V253N, R290N, A292T, G291N, R315N, V317T,以及氨基酸序列 T233至N240，或R304至C329，或1153至R223中的替换、添加或缺失，或其组合。
凝血中因子Vila的生物学活性源自其(i)结合至组织因子(TF)和(ii)催化因 子IX或因子X蛋白水解裂解产生活化的因子IX或x(分别为因子IXa或Xa)的能力。
对于本发明目的，可参考本文描述的测定法4通过检测制剂促进凝血的能力定量 因子VII多肽的生物学活性。在这一测定法中，生物学活性表示为相对于对照样品凝血时 间的减少并且通过与包含1单位/mL因子VII活性的混合人血清标准品比较转化成“因子 VII单位”。或者，可通过以下方式定量因子VIIa的生物学活性(i)检测因子Vila或因 子VII-相关多肽在包含嵌入脂膜中的TF和因子X的体系中产生活化的因子X(因子Xa) 的能力(Persson 等，J. Biol. Chem. 272 19919-19924，1997) ； (ii)在含水体系中检测因子 X水解("体外蛋白水解测定法"，见下文测定法2) ； (iii)采用基于表面等离子体共振的 仪器检测因子VIIa或因子VII-相关多肽与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts. 413 359-363,1997) ； (iv)检测因子Vila和/或因子VII-相关多肽对合成底物的水解(“体外 蛋白水解测定法"，见下文测定法1)；或(ν)在非TF依赖的体外系统中检测凝血酶的生成 (见下文测定法3)。相对于野生型因子VIIa具有实质相同或提高的生物学活性的因子VII变异体包 括在如上文所述的凝血测定法(测定法4)、蛋白水解测定法(测定法2)或TF结合测定法 之一或更多中测试时显示出至少约25%、优选至少约50%、更优选至少约75%并且最优选 至少约90%的相同细胞类型产生的因子VIIa特异活性的那些。相对于野生型因子VIIa具 有实质降低的生物学活性的因子VII变异体为在如上文所述的凝血测定法(测定法4)、蛋 白水解测定法(测定法2)或TF结合测定法之一或更多中测试时显示出小于约25%、优选 小于约10%、更优选小于约5%并且最优选小于约的相同细胞类型产生的野生型因子 VIIa特异活性的那些。相对于野生型因子VII具有实质被修饰的生物学活性的因子VII变 异体包括但不限于显示出非TF-依赖型因子X蛋白水解活性的因子XII变异体和结合TF 但不裂解因子X的那些。步骤(a)_调节pH在第一个非强制性步骤(a)中，必要时将组合物的pH调节至4. 5-10. 0范围内的 值。如上文所述，这通常通过加入一种或更多种缓冲剂达成。已具有指定范围内PH的组合 物当然不需要调节PH，但是例如，考虑到任何后续活化和制剂步骤，调节pH可能是有利的。调节组合物pH的步骤也包括稀释或浓缩(例如蒸发溶剂)组合物。在步骤(a)中组合物优选保持于最高10°C、特别是最高5°C、更特别是接近0°C的 温度。步骤(b)_热处理热处理是减少组合物中二聚体含量的关键步骤。已发现加热温度应至少为20°C以使二聚体含量至少在合理的时间范围内例如72 小时内减少。另一方面，我们认为高于50°C的加热温度将引起因子VII多肽变性(并因此 失活)的风险。可通过将包含组合物的容器置于恒温浴例如油浴或水浴或烘箱中达到加热至需 要温度。达到所需温度需要的时间将尤其取决于容器相对于环境介质的热传导系数。通常 需要尽可能快地达到所需温度或至少尽可能快地达到20°C的温度或低于设定点约5°C的温度。
在可选择的实施方案中，在流通(flow-through)反应器中分批或以持续方式进行热处理，其中流通时间对应于热处理需要的时间。许多可操作的实施方案对本领域技术 人员而言是显而易见的。热处理需要的温度和必需的时间可例如在如本文实施例2描述的模型实例中测 定。热处理所需时间的最小值通常为约5分钟，例如10分钟，而时间的最大值理论上可为 数天或许多天，例如168小时。因为实际原因，该处理的时间优选为10分钟至72小时。人们认为延长热处理可引起与热处理降低的类型不同的二聚体类型的形成。这一 假设受到实施例2中的观察结果的支持，其中于37°C热处理超过10小时实际上引起二聚体 的显著(再)形成。尽管如此，于30_45°C热处理的优选时间通常为10-600分钟。于20_30°C热处理 的优选时间通常为5-72小时，并且于35-50°C热处理的优选时间通常为10-300分钟。在目 前最优选的实施方案中，热处理在约37°C进行10-120分钟。应理解的是本发明方法的优化可导致不必要涉及恒定温度的热处理，但是证明了 在整个20-50°C的温度范围内逐渐或分段地升高温度和/或逐渐分段地降低温度可能是有 利的。热处理的目的在于降低包含因子VII多肽的组合物中二聚体的含量。特别地期望 显著的降低以使整个生产过程中的其他步骤合理化。因此，优选所述组合物中表示为相对 于总体因子VII多肽百分比的二聚体水平(如通过本文描述的HMWP GPC方法测定)被降 低至少六分之一，例如至少三分之一，特别是至少二分之一或甚至至少三分之二。设想可将二聚体含量降低至低于5%的水平，特别是低于4%的水平，并且更优选 低于3%的水平或甚至低于2%的水平或甚至更优选低于1. 5%的水平。步骤(C)-冷却接着将组合物冷却至最高为10°C，例如最高为5°C的温度。非常迅速地进行冷却 是有利的，例如通过在冰浴(约o°c)中冷却，或通过向组合物中加入冰。或者，如上所述， 可在流通反应器中进行冷却。通过快速冷却，可避免二聚体再次形成条件(例如在5-15°C 的温度)的延长存在。冷却后，可对组合物进行进一步的加工步骤。应考虑这些加工步骤应优选不引起 二聚体的任何显著再形成。尽管如此，在优选的实施方案中，在步骤(b)的后续步骤中活化 因子VII多肽，即在冷却组合物之前或之后活化因子VII多肽。优选在加热过程的后续步 骤中活化因子VII多肽因为在加热过程中难以控制活化。优选实施方案在一个尤其优选的实施方案中，本发明涉及降低包含因子VII变异体的组合物中 二聚体含量的方法，所述方法包括以下步骤(a)必要时将所述组合物的pH调节至5. 0-6. 5范围内的值；(b)将该组合物加热至30_45°C范围内的温度20-600分钟；以及(c)接着冷却该组合物至最高为5°C的温度。优选实施方案在第二个尤其优选的实施方案中，本发明涉及降低包含因子VII变异体的组合物 中二聚体含量的方法，所述方法包括以下步骤
(a)必要时将所述组合物的pH调节至9. 0-10. 0范围内的值；(b)将该组合物加热至30_45°C范围内的温度20-600分钟；以及(c)接着冷却该组合物至最高为5°C的温度。因子VII多肽的制备和纯化可应用于本发明方法的经纯化的人因子VIIa优选通过DNA重组技术制备，例如，如 Hagen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :2412_2416，1986 所描述，或欧洲专利号 0 200 421(ZymoGenetics, Inc.)中所描述。因子 VII 也可通过 Broze 和 Majerus，J. Biol. Chem. 255(4) 1242-1247，1980 以 及 Hedner 和 Kisiel, J. Clin. Invest. 71 :1836_1841，1983 描述的方法制备。这些方法产 生不含可检测量的其他凝血因子的因子VII。一种进一步纯化的因子VII制剂可通过包括 附加的凝胶过滤作为最终纯化步骤获得。因子VII接着通过已知方法被转化为活化的因 子Vila，例如通过数种不同的血浆蛋白，例如因子XIIa、IXa或Xa的作用。或者，如Bjoern 等.(Research Disclosure，2691986年9月，第564-565页)所述，可通过使其通过离子交 换色谱柱例如Mono Q(Pharmacia fine Chemicals)等或通过在溶液中自体活化将因子
VII活化。本发明方法步骤优选在因子VII多肽活化之前立即应用。因子VII-相关多肽可通过修饰野生型因子VII或通过重组技术产生。与野生型 因子VII相比具有改变的氨基酸序列的因子VII-相关多肽可通过修饰编码野生型因子VII 的核酸序列产生，其方式为通过已知方法例如定点诱变改变氨基酸密码子或移除编码天然 因子VII的核酸中的一些氨基酸密码子。本领域技术人员显而易见可在对因子VIIa分子的功能至关重要的区域之外进行 替换而仍然得到活性多肽。因子VII多肽活性必需的氨基酸残基(因此优选不进行替换) 可根据本领域已知的操作鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见，例如，Cunningham ^P Wells, 1989, Science 244:1081-1085)。在后一技术中，在该分子的各正电荷残基处引 入突变并且检测所得突变分子的凝结、各自交联活性以鉴定对该分子活性至关重要的氨基 酸残基。底物_酶相互作用的位点也可通过分析由例如核磁共振分析、结晶学或光亲和标 记的技术测定的三维结构来测定(参见，例如，de Vos等，1992，Science 255:306-312; Smith 等，1992，Journal of Molecular Biology 224 :899_904 ;Wlodaver 等，1992，FEBS Letters 309 :59_64)。向核酸序列中引入突变用一种核苷酸交换另一种核苷酸可通过使用本领域已知 的任何方法进行定点诱变达成。尤其可用的是应用具有目标插入物的超螺旋双链DNA载体 和包含所需突变的两个合成引物的操作。各自与载体的相反链互补的寡核苷酸引物在温度 循环中通过Pfu DNA聚合酶的作用延伸。一旦掺入引物便生成包含交错切口的突变质粒。 温度循环之后，用特异于甲基化和半甲基化DNA的Dpnl处理产物以消化亲代DNA模板并筛 选包含突变的合成DNA。也可使用本领域已知的用于产生、鉴定和分离变异体的其他操作， 例如基因重排或噬菌体展示技术。从细胞来源分离多肽可通过本领域任何已知的方法达成，包括但不限于从黏附细 胞培养物去除包含所需产物的细胞培养基；离心或过滤以去除非黏附性细胞等。任选可进一步纯化因子VII多肽。可使用本领域已知的任何方法完成纯化，包 括但不限于例如在抗-因子VII抗体柱上的亲和色谱法(参见，例如，Wakabayashi等，J. Biol. Chem. 261 :11097，1986 ；和 Thim 等，Biochem. 27 :7785，1988)；疏水相互作用色 谱法；离子交换色谱法；大小排阻色谱法；电泳操作(例如制备型等电聚焦(IEF))；差 异溶解(例如硫酸铵沉淀)或萃取等。一般性参见，Scopes, ProteinPurification, Springer-Verlag, New York, 1982 ；禾口 Protein Purification, J. C. Janson 禾口 Lars Ryden 编辑，VCH出版社，纽约，1989。纯化后，制备物优选包含少于重量比10%更优选少于5%并 且最优选少于的来源自宿主细胞的非因子VII多肽。因子VII多肽可通过蛋白水解裂解活化，其方式为使用因子XIIa或其他具有胰蛋 白酶样特异性的蛋白酶，例如因子IXa、激肽释放酶、因子Xa和凝血酶。参见，例如，Osterud 等，Biochem. 11 2853(1972) ； Thomas,美国专利号 4, 456, 591 ；和 Hedner 等，J.Clin· Invest. 71 =1836(1983) 或者可通过使其通过离子交换色谱柱例如Mono Q (Pharmacia) 等或通过在溶液中自体活化将因子VII多肽活化。如上所述，本发明方法步骤优选在因子 VII多肽活化之前立即应用。所得活化的因子VII多肽可接着如本领域所述进行制剂并给药。以下实施例显示了本发明的实施。这些实施例仅用于说明目的并且不以任何方式 限制所要求发明的范围。实施例
方法测定二聚体含量-HMWP GPC法将大小排阻色谱法SE-HPLC用于在非解离条件下分析FVIIa样品。HMWP (高分子 量蛋白)即二聚体、寡聚体和多聚体形式的FVIIa聚集物的含量通过相对于单体目标产物 峰的面积百分比测定。使用的柱子为Waters Protein Pak 300SW(7. 5*300mm，对应于 13，25mL 的柱体 积)或具有相似规格的柱子。常用分析条件为温度RT (21-25°C )；检测在柱子出口处于215nm进行紫外检测；流速0. 5ml/ min，对应于 2. 25CV/hr。使用具有以下组成的运行缓冲液进行分析运行0. 2M硫酸铵、5%异丙醇，调节至 ρΗ7· 0。柱平衡之后并使用0. 5CV运行缓冲液，将包含约Img FVIIa/ml的FVIIa样品融化 并通过注射25微升样品体积(对应于相对于柱体积0. 2%的样品体积)进行分析。接着将样品洗脱1. 5CV。色谱图通常由两个主峰和两个次峰组成，如图3所示。从左边开始，观察到表示 HMWP的两个次峰(多聚体和二聚体/寡聚体峰)。第一个主峰表示FVIIa单体，第二个主 峰表示盐峰。实施例1-于37°C热处理因子VIIa变异体将15mM CaCl2、30mM NaCl、10mM组氨酸、ρΗ 6.0(在 5°C)中的 1.5mg/mL FVIIa变 异体溶液通过0. 22微米滤器过滤至700mlHDPE瓶中。用IM HCl或IM NaOH将pH调节至 5. 8 (在5°C )。将瓶子置于温度为37°C的水浴中。将HDPE瓶的温度升高至37°C约需要20 分钟。溶液已达到37°C 45分钟后，通过将瓶子置于冰上终止该反应。起始二聚体含量经GPC测定为7.3%，在热处理后降低为2.8%。因此于37°C热处理45分钟足以将二聚体含量降低多于二分之一。进行了总共120分钟的相似试验中二聚体含量降低的变化显示于图1。通过频繁 收集样品；将样品迅速冷冻至-80°C ；和后续分析(见下文)监控该试验。比较实施例1-于5_8°C保存因子VIIa变异体将15mM CaCl2、30mM NaCl、10mM组氨酸、ρΗ 6.0(在 5°C)中的 1.5mg/mL FVIIa变 异体溶液通过0. 22微米滤器过滤至700mlHDPE瓶中。用IM HCl或IM NaOH将pH调节至 5.8(在5°0。将瓶子置于温度为5-8°C的水浴中。60分钟后通过将瓶子置于冰上终止该 反应。 起始二聚体浓度为7.7%，热处理后为7.9%。实施例2-于23°C和37°C延长热处理因子VIIa变异体将基本如实施例1(ρΗ 5.7)描述的在37°C的热处理试验进行总共48小时并于 23°C将相似的实验进行总共48小时。通过频繁收集样品；将样品迅速冷冻至-80°C ；和后 续分析(见下文)监控两个试验。采用两个不同温度的二聚体含量减少的变化显示于图2。 在37°C观察到二聚体含量的快速下降，而23°C样品的二聚体含量降低较为缓慢，48小时后 二聚体含量可能并未降低至其最小值。这些类型的实验可用于测定用于其他因子VII多肽 和在其他所选温度下的最优条件(用于热处理的足够时间)。为了比较，将一个样品(与比较实施例1相似；pH5. 7)于5_8°C放置总共48小时。在这一例子中观察到二聚体含量的轻微增加(见图2，上曲线)。实施例3-于pH 9. 5延长热处理因子VIIa变异体将基本如实施例1描述的热处理试验进行总共168小时；但是将起始pH调节从 PH 5. 8增加至pH 9.5。通过频繁收集样品；将样品迅速冷冻至-80°C ；和后续分析监控该 试验。升高PH时二聚体含量降低的变化显示于图4。pH 9. 5时观察到二聚体含量的相似 快速降低，之后为缓慢的二聚体形成。
权利要求
降低包含因子VII多肽的组合物中二聚体含量的方法，所述方法包括以下步骤(a)必要时将所述组合物的pH值调节至5.0-10.0范围内的值(于5℃测定)；(b)将该组合物加热至20-50℃范围内的温度至少5分钟；以及(c)接着冷却该组合物至最高为10℃的温度。
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的所述温度在30-45°C的范围内并且步骤(b) 中的加热时间在10-600分钟的范围内。
3.之前所述权利要求任一项的方法，其中在步骤(a)中将所述pH调节至5.0-6. 5。
4.之前所述权利要求任一项的方法，其中所述因子VII多肽为因子VII变异体。
5.之前所述权利要求任一项的方法，其中所述组合物包含钙盐。
6.之前所述权利要求任一项的方法，其中所述组合物中表示为相对于总体因子VII多 肽百分比的二聚体水平已被降低至少二分之一。
7.之前所述权利要求任一项的方法，其中所述因子VII多肽在步骤(b)的后续步骤中 活化。
8.之前所述权利要求任一项的方法，其中在步骤(a)之前有阴离子交换色谱步骤。
全文摘要
本申请涉及通过热处理降低因子VII多肽组合物中二聚体含量的方法。
文档编号C12N9/64GK101802187SQ200880103945
公开日2010年8月11日 申请日期2008年8月22日 优先权日2007年8月24日
发明者J·克拉鲁普 申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司