甲基化胞嘧啶的检测方法

专利名称：甲基化胞嘧啶的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测标本DNA中的甲基化胞嘧啶的方法及用于该方法的寡核苷酸。
背景技术：
在高等真核生物的染色体DNA中，构成DNA的碱基中C (胞嘧啶)的第5位有时会 被甲基化修饰。在此高等真核生物中，DNA甲基化发挥着抑制遗传信息表达的功能。比如， 当大量含有某种基因的启动子常见的CpG序列区域(CpG岛、CG岛)甲基化时，其基因转录 受到抑制。与此相反，当CpG岛未被甲基化时，转录因子可结合到启动子，基因进入可转录 状态。如此，DNA甲基化是基因表达的调控方式之一。因此，DNA甲基化对初期胚胎发生、 组织特异性基因表达、哺乳动物特有的基因印记和X染色体失活、染色体稳定化、DNA复制 的时机等各种生理和病理现象发挥着重要的作用。特别是近年来，已显而易见，这种DNA甲 基化强烈地干预癌症和其他疾病。作为分析DNA甲基化的方法，已知有甲基化特异性PCR法(Methylationspecific Polymerase Chain Reaction)(参考非专利文献1)。此方法是用亚硫酸氢钠等转化碱基的 试剂对生物试样中的DNA进行转化处理，将未甲基化胞嘧啶转化为其他碱基，区分甲基化 胞嘧啶和未甲基化胞嘧啶。然而，已知进行这种使用转化碱基的试剂和DNA接触进行转化 处理时，生物试样中的大部分DNA会因化学反应而分解。近年来，(专利文献1)公开了一种检测DNA试样中的胞嘧啶甲基化的方法，S卩，用 与DNA试样杂交的探针，在DNA试样和探针之间形成杂交，使DNA试样中的预期甲基化的胞 嘧啶形成突起结构或错配后，用锇酸盐等氧化剂特异性地氧化突起结构或错配部分的甲基 化胞嘧啶，检出氧化反应物。这种方法是利用甲基化胞嘧啶的甲基化嘧啶碱基环的碳原子 易氧化的特点，通过检出已被氧化的反应物来检测胞嘧啶的甲基化。当用氧化剂处理DNA试样时，作为检测目标的甲基化胞嘧啶以外的甲基化胞嘧啶 和与甲基化胞嘧啶同样有甲基的胸腺嘧啶也会被氧化。因此，在此方法中，DNA试样和探针 杂交，在DNA试样中的检测目标以外的胸腺嘧啶等碱基和探针之间形成碱基对，防止检测 目标以外的碱基被氧化。然而，在DNA试样和探针之间形成突起结构或错配，有时会使杂交后的双螺旋结 构的立体结构发生变形。更具体而言，在突起结构中，会出现作为甲基化检测目标的胞嘧啶 从DNA试样和探针杂交所形成的双链DNA飞出的状态。因此，在立体结构上，特别是与DNA 试样中的突起结构相邻的碱基难以与探针所对应的碱基形成碱基对。而形成错配的探针也 同样，不与作为甲基化检测目标的胞嘧啶形成碱基对的碱基会成为立体结构上的障碍，与 错配相邻的碱基难以与探针所对应的碱基形成碱基对。特别是当与预期甲基化的胞嘧啶相 邻的区域存在胸腺嘧啶时，以及DNA试样中有CpG岛时，立体结构发生变形的可能性很大。 因此，DNA试样中的检测目标以外的碱基和探针之间不能充分形成碱基对，检测目标以外的
3胸腺嘧啶等有可能被氧化。当用检测甲基化胞嘧啶来进行上述癌症和其他疾病诊断时，从诊断结果的可靠性 方面来说，需要更高的检测精度。因此，人们希望进一步提高甲基化胞嘧啶检测精度。专利文献1 国际公布第2006/132022号文本非专利文献1 甲基化特异性PCR:—种新的用于检测CpG岛甲基化状态的 PCR(James G. HERMAN et al. , Methylation-specific PCR :A novel PCRassay for methylation status of CpG islands, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 93,pp.9821-9826, September 1996)

发明内容
本发明要解决的课题鉴于以上情况，本发明目的之一是提供一种精确检测甲基化胞嘧啶的方法，使用 寡核苷酸与标本DNA杂交时，立体结构不易发生变形、且易与预期甲基化的胞嘧啶以外的 碱基形成碱基对。本发明的目的之二是提供用于上述甲基化胞嘧啶检测方法的甲基化胞嘧啶检测 用的寡核苷酸。本发明的目的之三是提供一种含有固定上述寡核苷酸的固相载体的甲基化胞嘧 啶检测用核酸芯片。解决课题的方法有鉴于此，本项发明的发明者们锐意研究，终于发现使用在与标本DNA中的预期 甲基化的胞嘧啶互补的位置上有脱碱基部位的寡核苷酸，该寡核苷酸可以不发生立体结构 变形，直接与标本DNA杂交。进而发现通过在该寡核苷酸与标本DNA之间形成杂交可以用 氧化剂更特异性地氧化标本DNA中的甲基化胞嘧啶，从而完成了本项发明。SP，本发明提供(1) 一种检测甲基化胞嘧啶的方法，包括以下步骤寡核苷酸与标本DNA杂交的步骤，所述寡核苷酸与DNA标本中含预期甲基化的胞 嘧啶的区域杂交且在与所述胞嘧啶的互补位置有脱碱基部位；氧化步骤，使氧化剂与所述步骤中生成的杂交标本DNA进行反应，当存在甲基化 胞嘧啶时，使所述甲基化胞嘧啶氧化；以及检测步骤，即检出被氧化的甲基化胞嘧啶；(2)上述(1)所述检测方法，其特征在于检测步骤包括用碱基物质对所述与氧化 剂反应的标本DNA进行处理的步骤和判断用碱基物质处理的所述标本DNA有无被切断的判 断步骤；(3)上述(2)所述检测方法，其特征在于碱基物质是哌啶或苯胺；(4)上述⑵或(3)所述检测方法，其特征在于判断步骤包括对标本DNA中含预 期甲基化的胞嘧啶的区域进行核酸扩增的步骤，以及检出核酸扩增步骤所产生的扩增产物 的步骤；(5)上述(1)_(4)中任一项所述检测方法，其特征在于氧化剂选自高锰酸盐、锇 酸盐、钨酸盐、高碘酸盐、过氧化氢水、叔丁基氢过氧化物、过安息香酸、过安息香酸衍生物、碘、七氧化二铼、过氧乙酸、过氧乙酸衍生物及锰_萨伦络合物至少其中之一；(6)上述(5)所述检测方法，其特征在于氧化剂是锇酸盐；(7)上述(6)所述检测方法，其特征在于已被氧化的甲基化胞嘧啶与锇酸盐形成 锇络合物；(8)上述(1)所述检测方法，其特征在于氧化剂是锇酸盐，与氧化剂反应的步骤 包括使与氧化剂反应的标本DNA再与能作为锇离子配体的化合物反应，检测步骤则是检测 形成配体配位结合的锇络合物的甲基化胞嘧啶；(9)上述(8)所述检测方法，其特征在于配体用标记物标记；(10)上述⑶或9所述检测方法，其特征在于，配体是吡啶、联吡啶或菲咯啉；(11) 一种用于甲基化胞嘧啶检测方法的寡核苷酸，所述甲基化胞嘧啶检测方法是 用氧化剂对DNA标本进行处理、检测被氧化的甲基化胞嘧啶的方法，所述寡核苷酸与标本 DNA中含有预期甲基化的胞嘧啶的区域杂交且在与所述胞嘧啶互补的位置有脱碱基部位；(12)上述(11)所述寡核苷酸，其特征在于所述胞嘧啶是CpG岛区域中的胞嘧啶；(13)上述(11)或(12)所述寡核苷酸，其特征在于脱碱基部位由不含碱基的核 苷酸形成；(14)上述(11)-(13)中任一项所述寡核苷酸，其特征在于其与存在于标本DNA 中、和寡核苷酸杂交的区域中的所有胸腺嘧啶形成碱基对；(15) 一种用于使用氧化剂进行甲基化胞嘧啶检测的核酸芯片，包含固定有权利要 求(11)-(14)中任一项所述寡核苷酸的固相载体。发明效果本发明可以提供一种当与标本DNA杂交时，立体结构不易发生变形，预期甲基化 的胞嘧啶以外的碱基容易形成碱基对的检测甲基化胞嘧啶用的寡核苷酸和用此寡核苷酸 的核酸芯片。用此寡核苷酸或核酸芯片，运用氧化剂进行甲基化胞嘧啶检测的话，可以防止标 本DNA中预期甲基化的胞嘧啶以外的碱基、如胸腺嘧啶等被氧化剂氧化。从而可以更具特 异性地氧化甲基化胞嘧啶，提高甲基化胞嘧啶的检测精度。本发明的寡核苷酸和核酸芯片适用于特别是将在与检测甲基化目标的胞嘧啶相 邻的区域存在胸腺嘧啶的DNA作为标本DNA使用时的状况，以及使用含有CpG岛的DNA时 的状况。本发明可以提供一种用上述甲基化胞嘧啶检测用寡核苷酸精确检测甲基化胞嘧 啶的方法。用本发明的甲基化胞嘧啶检测方法，会全面防止标本DNA中预期甲基化胞嘧啶以 外的碱基如胸腺嘧啶等被氧化剂氧化，因此可以仅精确检测出氧化的甲基化胞嘧啶。


图1显示了锇酸盐氧化反应和哌啶处理后的试样1-4的电泳结果。
具体实施例方式<杂交步骤>
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本发明的甲基化胞嘧啶检测方法包括使用与标本DNA中含预期甲基化的胞嘧啶 的区域杂交且在与上述胞嘧啶的互补位置有脱碱基部位的寡核苷酸与标本DNA杂交的步 骤(以下也称“杂交步骤”)。在本实施方式中，作为标本DNA只要是含DNA的物质并无特别限定，但最好是含 生物的基因组DNA，尤以含有给予疾病诊断等临床评价的DNA的物质为宜。作为标本DNA， 比如有从临床标本获得的DNA等。具体而言，可列举出从血液、血清、淋巴液、尿液、乳头分 泌液、体液以及通过手术或活检采集的组织等获得的DNA，特别是含有从肿瘤细胞中获得的 DNA的物质最为理想。更具体地说，作为标本DNA，当临床评价以检测肿瘤为目的时，可以举出调节癌遏 制基因和癌基因表达的基因组DNA。当以检测其他疾病为目的时，可举出调节参与该疾病 的基因表达的基因组DNA。比如，作为检测肿瘤相关的基因组DNA，可以举出14-3-3、MGMT、 CDH13、HICl、Twist、pl6、Rassfla、ERa 、RARb、CDHl、GSTPl、Cyclin D2、DAPK、HIN1 和 pl4 等。最好标本DNA含有这些调节基因组DNA的CpG岛区。这些基因组DNA的序列从公共数 据库可以获得。上述标本DNA可以有一个或几个预期甲基化的胞嘧啶。本实施方式中的寡核苷酸是一种与标本DNA中含预期甲基化的胞嘧啶的区域杂 交且在与上述胞嘧啶的互补位置有脱碱基部位的物质。该寡核苷酸可以是DNA或RNA其中 之一，但最好是DNA。S卩，上述寡核苷酸的序列具有与上述含预期甲基化的胞嘧啶的区域的标本DNA的 部分或全部核苷酸序列互补的序列，且在与该胞嘧啶互补的位置上有脱碱基部位。在本说明书中，所谓“预期甲基化的胞嘧啶”指所要检测的是否已被甲基化的胞嘧 啶。标本DNA中的该胞嘧啶可能已甲基化或尚未甲基化，如已甲基化时，可能是5-甲基胞 嘧啶或6-甲基胞嘧啶。在本说明书中，所谓脱碱基部位，其意思与在该领域通常的认识相同。即，所谓脱 碱基部位是指，在可形成双链的核酸中，由于在一个核酸中一定核苷酸所对应位置上的另 一个核酸的互补位置的核苷酸不具碱基，而在双链核酸之间不形成氢键结合型碱基对的部 位。更具体而言，这种脱碱基部位可以通过具有碱基部分已脱离的核苷酸结构或有与之类 似结构的寡核苷酸形成。对于与标本DNA中预期甲基化的胞嘧啶的互补位置上形成脱碱基部位的化合物 无特别限制，只要其能在寡核苷酸与标本DNA杂交形成双链核酸时在与标本DNA中目标胞 嘧啶互补的位置上形成脱碱基部位且又不会破坏双链核酸的立体结构即可。所谓不会破坏 双链核酸的立体结构指一种状态，即，标本DNA与寡核苷酸杂交时，标本DNA中位于脱碱基 部位的胞嘧啶以外的碱基可以在不妨碍立体结构的情况下与寡核苷酸中的碱基形成碱基 对，整体上可形成双螺旋结构的状态。通过在制备寡核苷酸时，使与标本DNA形成杂交时能在与预期甲基化的胞嘧啶之 间产生空间的物质聚合在寡核苷酸中希望的位置上，以形成上述脱碱基部位。作为该物质 比如可列举出不含碱基的核苷酸。用这种核苷酸合成寡核苷酸就可在寡核苷酸形成碱基部 分脱离的核苷酸结构。这种化合物作为无碱基间隔基(dSpacer)被广泛知晓。上述脱碱基部位可对应于标本DNA中预期甲基化的胞嘧啶的数目并包含在寡核苷酸中，可以在寡核苷酸中存在1个或2个以上。本发明的寡核苷酸可以按照公知的核酸合成方法制造。众所周知，在上述寡核苷 酸的任意位置插入无碱基间隔基，合成有脱碱基部位的寡核苷酸。已插入无碱基间隔基的 寡核苷酸也可从市场购买。寡核苷酸的长度可根据检测氧化的甲基化胞嘧啶的方法和标本DNA的序列适当 选择，无特别限制。比如，作为可与标本DNA中含预期甲基化的胞嘧啶区域杂交的长度为 20-100个碱基。上述杂交条件可根据标本DNA的种类、所用寡核苷酸的长度适当选择。上述杂交 可在如pH7-9、0. 001-0. 05M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl)、0. 05_0. 15M钠离子浓 度(或其他碱)、25-55°C的条件下进行。当标本DNA是双链DNA时，在上述杂交步骤前，可先将标本DNA在90-100°C加热 1-10分钟使其变性。本发明的方法是，用氧化剂特异性地检出标本DNA中的目标甲基化胞嘧啶。因此， 将标本DNA和上述寡核苷酸杂交，使目标胞嘧啶以外的碱基埋没在双链核酸的双螺旋结构 中，难以与氧化剂反应。更具体而言，让标本DNA中易与氧化剂反应的胸腺嘧啶和存在于目 标胞嘧啶以外的部位的甲基化胞嘧啶与上述寡核苷酸的腺嘌呤和鸟嘌呤等形成碱基对，使 其不易受到氧化剂的氧化反应。特别是胸腺嘧啶和甲基化胞嘧啶同样，易于被氧化剂氧化。 因此，存在于与寡核苷酸杂交区域的标本DNA中的胸腺嘧啶最好全部通过杂交与上述寡核 苷酸形成碱基对。<氧化剂反应步骤>通过上述杂交步骤，标本DNA与上述寡核苷酸杂交。本发明的方法包括氧化步骤 (以下也称“氧化剂反应步骤”)，让氧化剂作用于已形成杂交的标本DNA，当存在甲基化胞 嘧啶时，氧化该甲基化胞嘧啶。在本实施方式中，氧化剂只要能氧化嘧啶环的5位和6位碳原子间的双键即可，并 无特别限制。作为氧化剂，比如有高锰酸钾(KMnO4)等高锰酸盐、四氧化锇(OsO4)和二水 合锇酸钾(K2OsO4)等锇酸盐、钨酸钠(Na2WO4)等钨酸盐、高碘酸钠(NaIO4)等高碘酸盐、过 氧化氢水(H2O2)、叔丁基氢过氧化物(t-BuOOH)、过安息香酸及其衍生物(间氯过氧苯甲酸 (!1￡ 8幻、3，5-二硝基苯甲酸)、碘(I2)、七氧化二铼(Re2O7)、过氧乙酸(AcOOH)及其衍生物 以及锰-萨伦(salen)络合物等。氧化剂可以使用其中一种或二种以上。还原上述氧化剂时，可以与上述氧化剂一起使用能使已被还原的氧化剂再氧化的 化合物。作为具有这种再氧化作用的化合物，可以举出铁氰化钾等。关于用氧化剂处理标本DNA的条件，只要根据氧化剂种类能够在与寡核苷酸杂交 的标本DNA中氧化未形成碱基对的甲基化胞嘧啶即可，无特别限定。比如将根据氧化剂种 类适当调制浓度的氧化剂水溶液加入寡核苷酸和标本DNA杂交的产物中，在0-40°C左右温 度下处理1分钟-1小时，即可进行氧化剂的反应。氧化剂浓度可根据氧化剂种类适当选择，但最好在0. I-IOOOmM之间。另外，和寡核苷酸杂交的标本DNA与氧化剂的反应最好在PH7-9的碱基条件下进 行。以此可加快氧化速度，更明确地区分胞嘧啶和甲基化胞嘧啶。特别是在PH7-9时，寡核 苷酸和标本DNA杂交的产物双链DNA可保持稳定。
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<检测步骤>本发明的方法包括检测步骤，即检测在上述氧化剂反应步骤生成的氧化甲基化胞 嘧啶。在本实施方式中，作为检测氧化的甲基化胞嘧啶的方法使用国际公布第 2006/132022号文本记载的众所周知的方法即可，无特别限制。检测氧化的甲基化胞嘧啶的方法比如有(A)基于用上述氧化剂处理寡核苷酸和 标本DNA的杂交产物后用碱基物质处理的方法，和(B)当使用锇酸盐作为氧化剂时检测在 该锇酸盐和甲基化胞嘧啶之间形成的锇络合物的方法等。(A)用碱基物质处理的方法当采用用碱基物质处理氧化的甲基化胞嘧啶的方法时，上述检测步骤最好包括用 碱基物质处理与氧化剂反应的标本DNA的步骤和判断用碱基物质处理的标本DNA有无切断 的步骤。当标本DNA中存在甲基化胞嘧啶时，通过用碱基物质处理在氧化剂的氧化反应中 所生成的标本DNA中氧化的甲基脱氧胞苷，与相邻核苷酸之间的磷酸二酯键会发生水解。 由此，如果标本DNA中预期甲基化的胞嘧啶是甲基化胞嘧唳，标本DNA就会因在此步骤中用 碱基物质处理而在甲基化胞嘧啶的位置被切断。另一方面，如果标本DNA中预期甲基化的 胞嘧啶是胞嘧啶，即使在此步骤用碱基物质处理标本DNA也不会被切断。也就是说，由于通 过用碱基物质处理，如果是甲基化胞嘧啶，标本DNA中预期甲基化的胞嘧啶的部位就会发 生切断，因此，通过判断标本DNA有无因碱基物质处理而发生的切断，就可以检测出有无甲 基化胞嘧啶。关于本实施方式中的碱基物质无特别限制，只要能水解标本DNA中的氧化的甲基 脱氧胞苷及其与相邻核苷酸之间的磷酸二酯键即可。作为碱基物质的一例，比如有含氮碱 基物质，更具体地说，有哌啶或苯胺等，尤以哌啶为宜。上述用碱基物质的处理可以将适当浓度的碱基物质水溶液与已和氧化剂反应的 标本DNA混合，在60-100°C的温度下反应1分钟_1小时。碱基物质的浓度可依碱基物质种 类适当选择，比如用吡啶时，最好浓度为1-20容量％。测定用碱基物质处理生成的DNA片段的大小以判断标本DNA是否被切断。DNA片 段的大小可用公知的方法测定，比如核酸扩增法、电泳法等。当用核酸扩增法时，上述判断步骤最好包括对含有预期甲基化的胞嘧啶的标本 DNA区域进行核酸扩增的步骤和检测核酸扩增步骤生成的扩增产物的步骤。上述核酸扩增法是扩增经碱基物质处理后的标本DNA中含预期甲基化的胞嘧啶 的区域，测定扩增产物的大小。作为核酸扩增法，只要是用引物扩增核酸的众所周知的方法 即可，无特别限制。比如，可以是PCR法、LAMP法、ICAN法、SDA法或TAS法等，尤以PCR法 为宜。上述引物只要能与要扩增的标本DNA区域的核苷酸序列互补地结合，且用上述核 酸扩增法能够扩增核酸即可。这种引物序列的设计和制造方法为业内人士所周知。扩增产物的检测可以测定核酸扩增的效率(比如实时PCR法)或将扩增产物供后 述电泳。上述电泳法是包括众所周知的核酸电泳和其后的核酸检测的方法。电泳可用丙烯酰胺、琼脂糖等凝胶进行。核酸检测可用溴化乙锭等核酸染色剂进行。(B)检测锇络合物的方法在上述反应步骤中，如果使用锇酸盐作为氧化剂，标本DNA中的甲基化胞嘧啶和 锇酸盐就能形成锇络合物。通过检测有无此锇络合物即可检出甲基化胞嘧啶。用此方法只 要标本DNA中预期甲基化的胞嘧啶是甲基化胞嘧啶，就可以形成锇络合物。因此，只要检出 锇络合物，就可判断目标胞嘧啶被甲基化。与此相反，如果标本DNA中预期甲基化的胞嘧啶 是胞嘧啶，就不形成锇络合物，也就检测不出锇络合物。据此可判断目标胞嘧啶未被甲基 化。作为检测有无锇络合物的方法，比如有使用可作为锇离子配体的化合物(以下也 称“配位化合物”)的方法。比如，让标记物标记的配位化合物作用于由甲基化胞嘧啶和锇 酸盐形成的锇络合物，形成配体后检测此标记，即可检出已形成锇络合物的甲基化胞嘧啶。 另外，让配位化合物作用于由甲基化胞嘧啶和锇酸盐形成的锇络合物，形成配体后再标记 配体，检测此标记，也可以检出已形成锇络合物的甲基化胞嘧啶。在此，作为配位化合物，只要是能成为锇离子配体的化合物即可，并无特别限定。 比如可以是吡啶、联吡啶和菲咯啉，尤以联吡啶为宜。作为标记物只要能够标记上述配体，无特别限制。比如可以是酶标记、荧光标记、 电化标记和放射标记等。标记物尤以电化的便于检测，故最好是蒽醌。制造上述标记物标记的配位化合物的方法和用标记物标记配体的方法为众所周 知。比如可以使用国际公布第2006/306359号文本上记载的化合物。本发明还提供一种包含固定上述寡核苷酸的固相载体的甲基化胞嘧啶检测用核 酸芯片。在本实施方式中，作为核酸芯片，只要具有固定上述寡核苷酸的固相载体，无特别 限制。固相载体只要是能固定寡核苷酸的固相载体即可。如，聚苯乙烯、金、玻璃、磁性氧化 铁等磁性粒子、具有量子点性能的硫化锌等微粒子。核酸芯片的制作方法众所周知。即，可以让上述寡核苷酸与经表面处理以使其有 所希望的能与醛基、氨基等核酸结合的官能基的上述固相载体接触，使该寡核苷酸结合到 固相载体表面。使用这种核酸芯片，可以对与固相载体上的寡核苷酸杂交的标本DNA进行包括上 述杂交步骤、氧化剂反应步骤和检测步骤在内的处理以及在处理过程中清洗固相载体。下面实施例详细说明本项发明，但本发明不限于此。实施例1(制备标本DNA)合成以下序列号1和2的碱基序列所示DNA，作为标本DNA使用。序列号1 5’ -GAGGCCTTCGCTGGAGTTTCGCCGCCGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTAC-3’序列号2 5 ’ -GAGGCCTTCGCTGGAGTTTMGCMGCMGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTAC-3’序列号2所示碱基序列中，“M”表示甲基化胞嘧啶。在本实施例中，以从序列号1 和2所示标本DNA的5’端到第23位胞嘧啶作为甲基化检测目标的胞嘧啶。
(制备寡核苷酸)合成以下序列号3和4的碱基序列所示DNA，作为用于甲基化胞嘧啶检测的寡核苷酸。序列号3:5’ -GTACTCACTGGTGGCGAAGACTGCGGCGGCGAAACTCCAGCGAAGGCCTC-3’序列号4:5’ -GTACTCACTGGTGGCGAAGACTGCGGCNGCGAAACTCCAGCGAAGGCCTC-3’序列号3所示寡核苷酸具有与序列号1和2所示标本DNA完全互补的碱基序列。序列号4所示寡核苷酸在与上述标本DNA杂交时插入了用于形成脱碱基部位的无 碱基间隔基，取代用于与序列号1和2所示标本DNA的5’端到第23位胞嘧啶或甲基化胞 嘧啶形成碱基对的鸟嘌呤。无碱基间隔基在碱基序列上用“N”表示。为了使序列号1和2与序列号3和4杂交时的状态更加易懂，序列号3和4显示 为3’端到5’端的序列，一并标记序列号1-4如下。序列号1 5 ’ -GAGGCCTTCGCTGGAGTTTCGCCGCCGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTAC-3’序列号2:5 ’ -GAGGCCTTCGCTGGAGTTTMGCMGCMGCAGTCTTCGCCACCAGTGAGTAC-3’序列号3:3 ’ -CTCCGGAAGCGACCTCAAAGCGGCGGCGTCAGAAGCGGTGGTCACTCATG-5’序列号4:3 ’ -CTCCGGAAGCGACCTCAAAGCGNCGGCGTCAGAAGCGGTGGTCACTCATG-5’如上所示，在与序列号1和2的5’端到第23位胞嘧啶或甲基化胞嘧啶的互补位 置上，序列号3的核苷酸有鸟嘌呤，而序列号4的核苷酸有无碱基间隔基。(标本DNA和寡核苷酸的杂交)如以下表1所示，将序列号3和4所示的寡核苷酸混入上述序列号1和2所示标 本DNA，制备试样1-4。各标本DNA (序列号1和2)及寡核苷酸(序列号3和4)用TE缓冲 液(ImM EDTA, IOmM Tris-HCl，pH7. 4)溶解到浓度为10 μ M。稀释液也使用同样的TE缓冲液。[表1]
权利要求
一种检测甲基化胞嘧啶的方法，包括以下步骤寡核苷酸与标本DNA杂交的步骤，所述寡核苷酸与DNA标本中含预期甲基化的胞嘧啶的区域杂交且在与所述胞嘧啶的互补位置有脱碱基部位；氧化步骤，使氧化剂与所述步骤中生成的杂交标本DNA进行反应，当存在甲基化胞嘧啶时，使所述甲基化胞嘧啶氧化；以及检测步骤，即检出被氧化的甲基化胞嘧啶。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，检测步骤包括用碱基物质对所述与氧 化剂反应的标本DNA进行处理的步骤和判断用碱基物质处理的所述标本DNA有无被切断的 判断步骤。
3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，碱基物质是哌啶或苯胺。
4.根据权利要求2或3所述检测方法，其特征在于，判断步骤包括对标本DNA中含预 期甲基化的胞嘧啶的区域进行核酸扩增的步骤，以及检出核酸扩增步骤所产生的扩增产物 的步骤。
5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，氧化剂选自高锰酸盐、锇酸盐、钨酸盐、 高碘酸盐、过氧化氢水、叔丁基氢过氧化物、过安息香酸、过安息香酸衍生物、碘、七氧化二 铼、过氧乙酸、过氧乙酸衍生物及锰-萨伦络合物至少其中之一。
6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，氧化剂是锇酸盐。
7.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，已被氧化的甲基化胞嘧啶与锇酸盐形 成锇络合物。
8.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，氧化剂是锇酸盐，与氧化剂反应的步骤 包括使与氧化剂反应的标本DNA再与能作为锇离子配体的化合物反应，检测步骤则是检测 形成配体配位结合的锇络合物的甲基化胞嘧啶。
9.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于，配体用标记物标记。
10.根据权利要求8或9所述检测方法，其特征在于，配体是吡啶、联吡啶或菲咯啉。
11.一种用于甲基化胞嘧啶检测方法的寡核苷酸，所述甲基化胞嘧啶检测方法是用氧 化剂对DNA标本进行处理、检测被氧化的甲基化胞嘧啶的方法，所述寡核苷酸与标本DNA中 含有预期甲基化的胞嘧啶的区域杂交且在与所述胞嘧啶互补的位置有脱碱基部位。
12.根据权利要求11所述寡核苷酸，其特征在于，所述胞嘧啶是CpG岛区域中的胞嘧啶。
13.根据权利要求11或12所述寡核苷酸，其特征在于，脱碱基部位由不含碱基的核苷 酸形成。
14.根据权利要求11所述寡核苷酸，其特征在于，其与存在于标本DNA中、和寡核苷酸 杂交的区域中的所有胸腺嘧啶形成碱基对。
15.一种用于使用氧化剂进行甲基化胞嘧啶检测的核酸芯片，包含固定有权利要求11 所述寡核苷酸的固相载体。
全文摘要
本发明的甲基化胞嘧啶检测方法包括以下步骤使寡核苷酸与标本DNA杂交的步骤，该寡核苷酸与标本DNA中含预期甲基化的胞嘧啶的区域杂交且在与上述胞嘧啶互补位置有脱碱基部位；氧化步骤，使氧化剂与上述步骤中生成的杂交标本DNA进行反应，当存在甲基化胞嘧啶时，氧化该甲基化胞嘧啶；以及检出被氧化的甲基化胞嘧啶的步骤。
文档编号C12N15/09GK101960020SQ20088010391
公开日2011年1月26日 申请日期2008年8月20日 优先权日2007年8月23日
发明者山本宪明, 岡智子, 梶田昌裕, 石原英干, 酒井绫子 申请人:希森美康株式会社