用于制备抗真菌病原体的植物的多核苷酸和方法

专利名称：用于制备抗真菌病原体的植物的多核苷酸和方法
技术领域：
本发明涉及用于生成或增强植物的病原体抗性的组合物和方法。另外，本发明涉 及已经用本发明的组合物遗传转化的植物。
背景技术：
禾生毛盘孢(Colletotrichum graminicola) (Ces. ) (Cg)更通常地称作炭疽病，是 影响玉蜀黍(Zea mays) (L.)的炭疽病叶斑病、炭疽病茎腐烂(ASR)和顶梢枯死的病原体， 所述玉蜀黍也称为玉米(maize)或玉米(corn)。它是仅仅已知的也会造成叶斑病的普通茎 腐烂(Bergstrom，等，(1999) ,Plant Disease, 83 596-608, White,D. G. (1998)，Compendium ofCorn Diseases, pp. 1-78)。在美国，已知它从1855年开始发生，且已经在美洲、欧洲、非 洲、亚洲和澳大利亚有所报道(McGee, D. C. (1988)，Maize Diseases :A Reference Source for Seed Technologists, APS Press, St. Paul, MN ；White, (1998)同上；White，等，(1979) Proc. Annu. CornSorghum Res Conf (34th)，1-15)。只是在美国，每年感染超过 3750 万英亩， 全国范围内的平均产量降低6. 6% (参见

图1)。产量降低是由于受感染的植物的低核重量 和“倒伏”，也就是说，由于感染造成茎的柔弱，植物倒下(Dodd，J.，(1980),Plant Disease, 64:533-537)。倒伏植物更难以收割，且易感其它疾病。感染后，通常茎的顶部首先死亡， 而茎的下部仍然是绿色的。在外表，通过茎外皮上的斑点样黑斑，可以识别感染，同时在内 部，髓组织变色或呈现黑色。接种会以许多形式发生。根可以生长穿过茎碎片，且受到感 染。这将变成日益严重的问题，因为“免耕(no till)”农业方法由于它们的环境益处而被 更广泛采用。真菌也可以通过昆虫损伤和其它伤口感染茎(White(1998)同上)。叶感染可 能先于茎感染，从而造成叶斑病，并提供茎感染的接种物。关于自然界存在的Cg不同品种 或种族的数目，技术文献中尚有争论。病原体会由风或受污染的种子批传播。孢子可以存 活最高达 2 年(McGee (1988)同上；Nicholson，等，(1980)，Phytopathology, 70 :255_261 ； Warren, H.L. (1977)，Phytopathology, 67 160-162 ；Warren，等，(1975)，Phytopathology, 65 620-623)。通过使用杀真菌剂，农民可以与玉米真菌病例如炭疽病感染相斗争，但是它们具 有环境副作用，且需要田地监控和诊断技术来确定哪种真菌造成了感染，从而可使用正确 的杀真菌剂。特别对于大田作物例如玉米，这是困难的。如果可以将负责抗性的基因整合 入原种、高产种质且不减少产量，那么使用携带遗传的或转基因的抗性来源的玉米系是更 实用的。已经描述了对Cg的抗性的遗传来源。已经鉴别出携带一定水平的Cg抗性的几种 玉米系(White，等(1979)同上)。它们包括 A556、MP305、H21、SP288、CI88A 和 FR16。使用 A556的相互易位测交分析表明，控制对ASR的抗性的基因存在于染色体1、4和8的长臂上 以及染色体 6 的 2 个臂上(Carson, Μ. L. (1981)，Sources of inheritance ofresistance to anthracnose stalk rot of corn。 Ph.D.Thesis, University ofIllinois, Urbana-Champaign) 0源自这样的系的抗性的渐渗是复杂的。报道了另一个近交LB31携 带控制对ASR的抗性的单个显性基因，但是表现得不稳定，尤其在有欧洲玉米螟感染存在 时(Badu-Apraku 等，(1987)Phytopathology 77:957-959)。发现 MP305 系携带 2 个显性的抗性基因，一个起主要作用，一个起次要作用(Cars0n(1981)同上)。通过美国农业 U (Department of Agriculture) f= 的国胃才直·禾中M胃· (National PlantGermplasm System) (GRIN ID :NSL 250298)，可以从密西西比大学(University of Mississippi)得 至丨JMP305。参见 Compilation of NorthAmerican Maize Breeding Germplasm, J. T. Gerdes 等，Crop ScienceSociety of America,1993。 从 W. Paul Williams, Supervisory ResearchGeneticist USDA-ARS, Corn Host Plant Resistance Research Unit, Box9555, 340Dorman Hall, Mississippi State, MS 39762，可以得到 MP305 的种子。已经报道，在染色体4的长臂上连锁有2个赋予对Cg抗性的遗传上可分离的 (即它们作为分开的遗传基因座而发挥作用)基因(Toman，等，(1993)，Phytopathology， 83 :981-986 ;Cowen，N 等(1991)MaizeGenetics Conference Abstracts 33)。还己经 艮 道了染色体4上的显著抗性数量性状基因座(QTL) (Jung，等，(1994), Theoretical and AppliedGenetics, 89 413-418) Jung 等(同上)报道，UMC 15 可以用于选择 MP305 中染 色体4上的QTL，并提示QTL是在UMC 15和UMC66之间的染色体4的12 cM区域上。实际 上，如下面更详细地讨论的，在IBM2相邻4遗传学图上报道的UMC15和UMC66之间的区域 是约129cM，且按照Jimg等(1994，同上)指出的方式选择QTL，会最好也只不过选择具有 相当大的连锁拖曳和负表型作用的大染色体区间，且在最坏的情况下，在2个标记之间会 发生双重组，从而导致Rcgl基因座的假阳性选择。携带这些基因(负责染色体4上QTL所 赋予的表型)的区域在本文中将被称作Rcgl基因座或MP305抗性基因座；在其他地方，其 已经被称作ASR基因座。关于植物的一般疾病抗性机理已经进行了大量工作。一些抗性机理实际上是非病 原体特异性的，或所谓的“非宿主抗性”。它们可能基于细胞壁结构或类似的保护机制。但 是，尽管植物缺少含有循环抗体的免疫系统和哺乳动物免疫系统的其它属性，但它们确实 具有针对病原体进行特异性保护的其它机理。其中最重要的和最充分研究的是植物疾病抗 性基因，或“R”基因。该抗性机理和R基因的非常多的综述之一，可以参见Bekhadir等， (2004), Current Opinion in Plant Biology 7 :391_399。存在 5 类公认的 R基因含有核 苷酸-结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)的细胞内蛋白；含有胞外LRR结构域的跨膜 蛋白(TM-LRR)；含有胞质激酶结构域的跨膜和胞外LRR(TM-CK-LRR)；含有卷曲螺旋胞质结 构域的膜信号锚定蛋白(MSAP-CC)；和含有N-末端肉豆蔻基化位点的膜相关激酶(MAK-N) (参见，例如Cohn，等，(2001)，Immunology, 13 55-62 ；Dangl, ^ (2001), Nature, 411 826-833)。Broglie等人(US专利申请系列号11/397，153)描述了新型的R基因，其涉及 NBS-LRR型称为Rcgl，发现于之前由Jimg等人(如上)所描述的Rcgl基因座内。他们描 述了在育种中利用这种基因座作为标记物，其染色体区间可以为谷物植物赋予抗性，以及 含有Rcgl基因的转基因植物。本发明改进了 Broglie等人的工作，通过提供第二 NBS-LRR 基因，其与Rcgl基因不同，并被称作Rcglb，其与Rcgl联合是对Cg的抗性所必需的。Rcglb 基因与Rcgl在物理上(200-300kb)和遗传上(小于1厘摩)紧密相关，并且代表了 Rcgl 基因座的第二组分。本发明提供了 Rcglb的序列，结合Rcgl和Rcglb的嵌合构建体，和共 同利用Rcgl和Rcglb基因(Rcgl基因座)育种的方法和标记。发明概述
本发明的实施方案基于对来自系MP305的负责抗性表型的基因的精细作图、克隆 和表征，含有MP305抗性基因座(Rcgl基因座)的截短的染色体区间向具有很少或没有连 锁拖曳的其它系中的渐渗，这些基因作为转基因的应用的证实，和使用育种技术、用分子标 记将这些基因或转基因移进原种系中。实施方案包括分离的多核苷酸，其包含编码能连同Rcgl多肽赋予对毛盘孢属 (Colletotrichum)的抗性的Rcglb多肽的核苷酸序列，其中所述Rcgl多肽的氨基酸序 列基于Needleman-Wunsch比对算法，当与SEQ ID NO :3或在2006年2月22日保藏在 Agricultural ResearchService (ARS) Culture Collection 的专利保藏号NRRL B-30895 的 Rcgl序列所编码的肽相比时，具有至少50%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%和 至少95%同一性，以及进一步其中Rcglb多肽具有当与SEQID NO :246或在2007年6月26 日保藏在 Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection 的专利保藏号 NRRL B-50050的Rcglb序列所编码的肽相比时，具有至少50 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%和至少95%同一性的氨基酸，或该核苷酸序列的互补体，其中所述互补体和核苷 酸序列由相同数目的核苷酸组成，且100%互补。实施方案还包括分离的多核苷酸，其包含 编码连同Rcgl多肽能够赋予对毛盘孢属(Colletotrichum)的抗性的多肽的核苷酸，其中 所述多肽具有在与SEQNO 246相比时具有至少50 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少 90%和至少95%同一性的氨基酸序列。 本发明的其它实施方案包括载体，其包含编码本发明实施方案多肽的多核苷酸， 例如SEQ ID N0:3、SEQ NO :246，或保藏为专利保藏号NRRL-30895的质粒的多核苷酸序列， 或保藏为专利保藏号NRRLB-50050的质粒的多核苷酸序列以及包含可操作地连接到至少 一个调节序列上的本发明实施方案的多核苷酸的重组DNA构建体。本发明的其他实施方案 包括载体，其包含编码SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :246 二者的多核苷酸。本发明也包括植 物细胞、以及植物，它们各自包含本发明实施方案的重组DNA构建体，和包含实施方案的重 组DNA构建体的种子。本发明包括的方法包括1)转化宿主细胞、包括植物细胞的方法，其包含用本发明 实施方案的多核苷酸转化宿主细胞，2)生产植物的方法，其包含用本发明实施方案的重组 DNA构建体转化植物细胞，和从转化的植物细胞再生植物，和3)赋予或增强对毛盘孢属和 /或茎腐烂的抗性的方法，其包含用本发明实施方案的重组DNA构建体转化植物，从而赋予 和/或增强对毛盘孢属或茎腐烂的抗性。其它实施方案包括，测定玉米植物中存在或不存在本发明实施方案的多核苷酸或 Rcgl基因座的方法，其包含下述的至少一个(a)从玉米植物分离核酸分子，并通过扩增与 多核苷酸同源的序列，测定是否存在Rcgl基因，以及测定是否存在或不存在Rcglb基因(b) 从玉米植物分离核酸分子，并进行DNA印迹杂交，(c)从玉米植物分离蛋白，并使用Rcgl 蛋白和/或Rcglb蛋白的抗体进行蛋白印迹，(d)从玉米植物分离蛋白，并使用Rcgl蛋白 和/或Rcglb蛋白的抗体进行ELISA测定，(e)证实存在源自RcglmRNA转录物且Rcgl和 /或Rcglb蛋白特有的mRNA序列，或(f)通过表型测定证实新赋予或增强的对毛盘孢属 (Colletotrichum)感染的抗性的存在，从而确定玉米植物中存在多核苷酸或Rcgl基因座。本发明也包括改变植物或植物细胞中能赋予对毛盘孢属或茎腐烂的抗性的蛋白 表达水平的方法，其包含(a)用本发明实施方案的重组DNA构建体转化植物细胞，和(b)在适合表达重组DNA构建体的条件下，培养转化的植物细胞，其中重组DNA构建体的表达导致 在转化的宿主中生产改变水平的能赋予对毛盘孢属或茎腐烂的抗性的蛋白。本发明包括的另一种方法是，赋予或增强玉米植物中对毛盘孢属和/或茎腐烂的 抗性的方法，其包含(a)使缺少Rcgl基因座的第一种玉米植物与含有Rcgl基因座的第 二种玉米植物杂交，以生成分离群体，(b)筛选分离群体中含有Rcgl基因座的成员，所述 Rcgl基因座具有能与连接到或位于Rcgl基因座内的第二种核酸杂交的第一种核酸，不包 括UMC15a或UMC66，和(c)选择所述成员，用于进一步杂交和选择。本发明也包括增强对毛盘孢属和/或茎腐烂的抗性、或将毛盘孢属和/或茎腐烂 抗性渐渗入玉米植物的方法，其包含用核酸标记进行玉米植物的标记辅助选择，其中所述 核酸标记特异性地与具有第一种核酸序列的核酸分子杂交，所述第一种核酸序列连接在位 于MP305的Rcgl基因座上的第二种核酸序列上，并基于标记辅助选择来选择玉米植物。本 文公开的特异性的FLP、MZA和Rcgl-特异性的SNP标记是本发明的其它方面。
本发明的另一个实施方案是鉴定玉米植物的方法，所述玉米植物表现出新赋予的 或增强的对毛盘孢属感染的抗性，其通过检测Rcglb基因上或内部的至少一个标记的等位 基因，以及任选地通过检测Rcgl基因上或内部的第二标记。其它实施方案包括，通过检测玉米植物中至少2个标记的等位基因，鉴别表现出 新赋予的或增强的对毛盘孢属抗性的玉米植物的方法，其中至少一个标记是在UMC2041下 边、且在Rcglb基因上边的染色体区间上或内部，且至少一个标记是在Rcgl基因下边、且 在UMC2200上边的区间上或内部。该方法包含的类似实施方案包括，至少一个标记是在 UMC1086下边、且在Rcglb基因上边的染色体区间上或内部，在UMC2285下边、且在Rcglb基 因上边的染色体区间上或内部，且至少一个标记是在Rcgl基因下边、且在UMC2200上边的 区间上或内部，在Rcgl基因下边、且在UMC2187上边的区间上或内部，或在Rcgl基因下边、 且在UMC15a上边的区间上或内部。其它实施方案包括，通过检测玉米植物中至少2个标记的等位基因，鉴别表现出 新赋予的或增强的对毛盘孢属抗性的玉米植物的方法，其中在UMC2041下边、且在Rcglb基 因上边的染色体区间上或内部的至少一个标记选自表16列出的标记，且在Rcgl基因下边、 且在UMC2200上边的区间上或内部的至少一个标记也选自表16列出的标记。实施方案包 括，通过选择至少4个标记或至少6个，鉴别表现出新赋予的或增强的对毛盘孢属抗性的玉 米植物的方法，其中至少2个或3个标记是在UMC2041下边、且在Rcglb基因上边的染色体 区间上或内部，且至少2个或3个标记是在Rcgl基因下边、且在UMC2200上边的区间上或 内部。当在UMC2041下边、且在Rcglb基因上边的染色体区间上或内部的2或3个标记，以 及在Rcgl基因下边、且在UMC2200上边的区间上或内部的2或3个标记选自表16列出的 那些时，其它实施方案包括该相同方法。该方法的另一个实施方案包括，检测在MZA1112处 的等位基因7，检测在MZA2591处的等位基因2，或检测在MZA3434处的等位基因8。通过所 包括的方法生产的玉米植物和种子也是本发明的实施方案，包括不包含在表16所示的基 因座处在UMC2041处或其上面、或在UMC2200处或其下面的与MP305相同的等位基因的那 些玉米植物。其它实施方案包括，通过检测玉米植物中至少2个标记的等位基因，鉴别表现出 新赋予的或增强的对毛盘孢属抗性的玉米植物的方法，其中至少一个标记是在UMC2041下边、且在Rcglb基因上边的染色体区间上或内部，且至少一个标记是在Rcgl基因下边、且在 UMC2200上边的区间上或内部，且其中该方法检测位于Rcgl基因或Rcglb基因内的至少一 个标记的存在或不存在。另一个这样的实施方案包括该方法的修饰，其中选择4个标记，其 中2个标记是在UMC2285下边、且在Rcgl基因上边的染色体区间内部，且至少2个标记是 在Rcgl基因下边、且在UMC15a上边的区间内部。该方法的其它实施方案包括Rcgl基因和 Rcglb基因，这些基因已经从供体玉米植物，包括MP305或DE81IASR (BC5)，渐渗进受体玉米 植物，以生产渐渗的玉米植物。该方法也包括这样的情形，其中选择渐渗的玉米植物在Rcgl 基因下边和UMC15a上边的重组事件，从而使得渐渗的玉米植物保持第一个MP305衍生的在 Rcgl基因下边、且在UMC15a上边的染色体区间，且不保持第二个MP305衍生的在UMC15a处 和下边的染色体区间。通过这些方法生产的玉米植物和种子也是本发明的实施方案。本发 明包括的 渐渗的玉米植物包括作为PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基因座转变的那 些，或其后代。本发明的其它实施方案是鉴别表现出增强的对毛盘孢属感染的抗性的玉米植物 的方法，其通过检测玉米植物在Rcgl基因座处存在或不存在至少一个标记，和选择其中存 在至少一个标记的玉米植物来实现。实施方案包括，当至少一个标记是在SEQ ID NOs 137, 255，256，257，258或266上或内部时，以及当至少1个标记是在Rcgl或Rcglb编码序列上 或内部，或位于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :245所述多核苷酸上或内部时。本发明包括的渐渗的玉米植物包含，作为PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基 因座转变的那些，或其后代。这样的实施方案包括玉米种子，其包含第一个MP305衍生的由 BNLG2162和UMC1051定义的染色体区间，且不包含第二个MP305衍生的在UMC2041上边或 在UMC1051下边的染色体区间，且当该玉米种子包含Rcgl和Rcglb基因的至少一种，且当 生长时生成表现出对毛盘孢属感染的抗性的玉米植物。该实施方案的种子也包括下述玉米 种子，其包含第一个MP305衍生的在UMC2285和UMC15a之间但是不包括该二者的染色体区 间，且不包含第二个MP305衍生的在UMC2285处或上边、或在UMC15a处或下边的染色体区 间，而且这样的包含Rcgl和Rcglb基因的玉米种子在生长时，生成表现出对毛盘孢属感染 的抗性的玉米植物。由该种子生产的玉米植物和植物细胞也包含在本发明的实施方案中。本发明也包括作为PH705、PH5W4、PH51K或PH87P的Rcgl基因座转变的后代种子， 或其后代，以及包含在MZAl 1123处的等位基因7、在MZA2591处的等位基因2或在MZA3434 处的等位基因8中的至少2个或更多个的后代种子。其它实施方案包括，包含在MZA2591. 32 处的胞嘧啶核苷酸、在MZA2591. 35处的胸腺嘧啶核苷酸和在MZA3434. 17处的胞嘧啶核苷 酸的后代种子。实施方案也包括分别在SEQ ID NO 140-146上或内部的MZA3434、MZA2591、MZA 11123、MZA15842、MZA1851、MZA8761和MZA11455的遗传标记。其它实施方案包括位于Rcgl 基因座或Rcgl基因或Rcglb基因上或内的遗传标记，包括位于SEQ ID NO: 137上的那些， 或在SEQ ID NOs :255，256，257，258和266任一个上的那些。包含的标记也包括位于SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 245 上的那些。附图简述图1是显示各县在2002年炭疽病茎腐烂感染严重性的美国地图。图2 (a、b、c)是将它与其它已知NBS-LRR多肽相对比的实施方案多肽序列(SEQ IDNO:3)的比对。图3是用Windows QTL Cartographer软件生成的图，它显示了负责Cg抗性表型的 基因座位于FLP标记定义的染色体上的特定位置(X轴)处的机会(Y轴)的统计学分析。图4是RT-PCR反应物的等分试样的电泳凝胶印迹，它揭示了 260bp带的存在，该 260bp带存在于源自受感染的和未受感染的抗性植物的样品中，但是在易感样品中不存在。 从来自DE811和DE811ASR茎组织的12. 5ng总RNA中，得到了 RT-PCR片段。使用Rcgl特 异性的引物和18S rRNA引物作为内部标准，扩增通过反转录得到的cDNA。图5是用于验证Rcgl基因的Mu-标记策略的示意图。 图6是Rcgl的基因结构，它显示了 4种不同增变基因插入位点的位置。图7(a_b)是一系列遗传学像，以递增的分辨率显示了邻近Rcgl基因座的区 域的图。7(a)中标有“A”的图的图距按cM计，且与IBM2相邻4遗传学图有关。使用来自 BC7群体的184个个体，形成7(b)中标有“B”的图的图距，且使用来自BC7群体的1060个 个体，形成7(b)中标有“C”的图的图距。与公开的图相比时，BC7群体的遗传作图使图分 辨率增加超过10-倍。显示在每个图右边的标记的位置是基于它们在物理图上的定位的外 推。图8(a_b)的遗传学像显示了 DE811ASR(BC3)中含有Rcgl基因座的染色体区 间，在DE811ASR(BC5)中得到的含有Rcgl基因座的染色体区间的减小的大小，和最初使用 DE811ASR(BC5)作为供体来源得到的近交中染色体区间的进一步减小的大小。关于所有标 记，在Maize⑶B上可公开得到的IBM2相邻图上报道显示的图距，除了 MZA15842、FLP27和 FLP56之外，使用相对于图7(b)中图B和C的高分辨率图的回归分析，外推它们的图位置， 其中使用两种图共有的UMC2285、PHI093和CSU166a位置。图9 (a-b)。图9 (a)显示了来自DE811ASR(BC5)的非同线性区域相对于B73和Mol7 的比对。图9 (a)中的BAC大小是估计值。图9(b)显示了其上存在Rcgl的SEQ ID NO 137 所述的非同线性区域的部分，包括其中的重复区域以及Rcgl外显子1和2。图10 (a-b)显示了分别在DE811ASR(BC5)和DE811系中接种Cg后15天时不同单 个植物中平均叶子损伤大小的分布。图11显示了接种后7和15天时感染了 Cg的DE811和DE811ASR(BC5)植物上的 平均叶子损伤大小的对比。图12显示了使DE811ASR(BC5)和DE811与指示的系杂交产生的杂种的茎在接种 Cg后4-5周时疾病的平均严重性。图13显示了与使DE811与指示的系杂交产生的杂种的产量相比，使 DE811ASR(BC5)与指示的系杂交产生的杂种在接种Cg后成熟时产量的提高。图14显示了接种后4-5周从DE811ASR(BC5)或MP305衍生的近交系的茎中由Cg 造成的5个不同位置处的疾病严重性。Rcgl基因阳性和阴性的系之间的差异是统计学上显 著的，P值小于0. 05。图15显示了来自Rcgl阳性和阴性的近交PH705系的代表性茎的疾病进展。图16显示了来自Rcgl阳性和阴性的近交PH87P系的代表性茎的疾病进展。图17显示了通过使DE811ASR(BC5)与指定系杂交衍生的杂种的茎的在5个不同 位置处接种4-5周后由Cg造成的疾病严重性。Rcgl基因阳性和阴性的系之间的差异是统计学上显著的，P值小于0. 05，例外是位置5。图18显示了从Rcgl阳性和阴性的PH4CV和PH705系生成的杂种的代表性茎的疾
病进展。图19显示了从Rcgl阳性和阴性的PH705和PH87P系生成的杂种的代表性茎的疾
病进展。图20显示了给玉米茎的疾病严重性评分的方法。给茎评出指定为antgr75的评 分， 它代表着超过75%变色的节间的数目(最高达5，包括接种的节间)。这产生范围为0-5 的评分，0表示在接种的节间小于75%变色，且5表示前5个节间(包括接种的节间)的 75%或更多变色。图21显示了与插入了含有DE811ASR(BC5)的Rcgl非同线性区域的区域同源的 B73物理图上的毗连群，这证实了在可以得到序列信息的目标区域中可得到许多B73衍生 的细菌人工染色体(BAC)。图22显示了含有MZA和公开标记的遗传学图与Mol7和B73的物理图的比对。使 用来自BC7作图群体的1060个体，显示遗传学图距离。Mol7BAC文库的分析也表明Rcgl 基因座与Mo 17的对应区域是非同线性的。从Mo 17物理图定位外推出虚线显示的标记在 B73图中的定位。从B73物理图定位外推出虚线显示的标记在Mo 17图中的定位。图23显示了为使用INVADER 检测系统反应而设计的Rcgl杂交标记的寡核苷酸。图24显示了为使用TaqMan 检测系统反应而设计的Rcgi杂交标记的寡核苷酸。图25显示了从接种后0、3、6、9和13天(dpi)的抗性的和易感的植物分离的约 1. 5mg聚腺苷酸-富集的RNA得到的RNA印迹的结果。用随机引物标记的420bp Rcgl片段 探测膜。抗性组织来自DE811ASR(BC5)，且易感组织来自DE811。图26表明，使用Rcgl特异性的引物对的PCR扩增仅仅扩增抗性系DE811ASR(BC5) 和供体亲本MP305，但是在易感系DE811中却不能，例外是FLP110F-R，它扩增高度保守的卷 曲螺旋_核苷酸结合位点区域，并从而扩增DE811系的基因组中非Rcgl的其它区域。IOObp 梯用于片段定大小。图27显示了一系列V7-9玉米植物的叶鞘，其在组织创伤之后利用Cg孢子悬浮 液进行接种。这些结果被进一步讨论于实施例8中。在缺少Rcgl转基因时(顶行)，含有 Rcgl基因的植物的叶鞘展示了大的、扩展的坏死损伤。相反，当存在Rcgl转基因时(在该 情况中，由其自己的启动子驱动)(底行)，恢复了 ASR抗性表型，并且坏死被限定/限制于 创伤和真菌接种位点。图28显示利用ETJ115-ETJ116引物对进行的RT-PCR的结果。该数据明确显示 BAC克隆191超毗连群的NBS-LRR基因专有地表达于含有MP305基因渐渗区的DE811ASR植 物中，正如在实施例9中所讨论的。图29显示Rcglb基因的预测结构域结构，正如在实施例9中所讨论的。图30显示Northern印迹分析的结果，其允许独立地确认Rcglb表达，并提供了估 计的转录物大小。多聚A+来自于抗性和易感植物(0，6，13DPI)的RNA(0. 7mg)的Northern 印迹显示存在4. 75kb的转录物条带，其仅仅存在于抗性样品中，其与从LRR以及基因的激 酶区域制备的探针特异性杂交，正如在实施例9中所讨论的。
图31a 31g提供了实施方案的Rcglb肽(SEQ ID NO 246)与来自大麦和稻的许 多NBS-LRR蛋白的比对，其显示了同源区。图32a和32b提供了 SEQ ID NO 246 (其与SEQ ID NO 256所列是分开的)的氨 基酸1036 1399与在BLAST P同源性检索中所鉴定的许多推定蛋白激酶(SEQ ID NOs 252-254)的比对。图33总结了在存在和不存在天然Rcgl转基因时，RcglKO植物的叶鞘感染数据， 正如在实施例8中所讨论的。图34显示了来自被实施例10中所描述构建体E所转化的植物的叶鞘测定的结 果。可见到明显的Cg感染特征。图35显示来自被实施例10中所描述构建体C所转化的植物的叶鞘测定的结果。 可见到明显的Cg感染特征。
图36来自被实施例10中所描述构建体D所转化的植物的叶鞘测定的结果。这些 叶子明显显示了由于同时存在和表达Rcgl和Rcglb基因的Cg感染的抑制。发明详述本发明实施方案提供了涉及诱导植物的病原体抗性、尤其是真菌抗性的组合物和 方法(或工艺)。该组合物是赋予或增强对植物真菌病原体的抗性的新的核苷酸和氨基酸 序列。具体地，某些实施方案提供了具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 246所述氨基酸序列 的多肽，和其变体和片段。另外提供了分离的核酸分子，和其变体和片段，它们包含编码SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 246所示氨基酸序列的核苷酸序列。在SEQ ID NO :1和4中，描述了编码SEQ ID NO 3的多肽的核苷酸序列。编码SEQ ID NO 246的多肽的核苷酸序列列于SEQ ID NO 255 258以及246和266中。Rcglb基 因及其侧接区的基因组序列提供与SEQ ID NO 255 258或在SEQ ID NO 266中，其在实 施例9中被更详细地讨论。编码SEQ ID NO 246的多肽的cDNA序列列于SEQ IDNO 245 中。在本文中也公开了包含编码实施方案的多肽的核苷酸序列的植物、植物细胞、种子和微 生物。在布达佩斯条约规定下，2006年2月22日将Rcgl核酸分子保藏在位于国家农业 禾1Jfflff胃(National Center for Agricultural UtilizationResearch(NCAUR))白勺 微生物基因座和生物工艺研究单位(MicrobialGenomics and Bioprocessing Research Unit)的农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection)。为保藏物给出下面的登记号NRRL B-30895。NCAUR的地址是1815N. UniversityStreet, Peoria, IL，61604。在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯 条约的条款下，维持该保藏。该保藏仅仅为了本领域技术人员的方便而作出的，且不是对在 35U. S. C. § 112下需要的保藏物的承认。保藏将是不可撤回的，且在专利授权后对公众的获 取没有限制或条件。但是，应当理解，保藏物的可获得并不构成对破坏由政府行为授予的专 利权的实施主题发明的许可。在2006年3月13日，将2500粒DE8IlASR(BC5)种子的样品保藏在美国典型培 养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)), 10801University Blvd., Manassas, VA 20110-2209，USA，分配的保藏号是PT0-7434。在本申请未决期间，专利和商 标官员(Commissioner of Patentsand Trademarks)、在请求后获得授权的由官员确定的人员和在提交本专利申请的外国专利局的相应官员可以获得该保藏物。在国际承认用于专 利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款下，维持该保藏物。保藏将是不可撤回的，且在专 利授权后对公众的获取没有限制或条件。但是，应当理解，保藏物的可获得并不构成对破坏 专利权的实施主题发明或方法的许可。在布达佩斯条约规定下，2007年6月22日将Rcglb核酸分子保藏在位于国家农 WJfflff^Φ^^ (National Center for AgriculturalUtilization Research(NCAUR)) ^ 微生物基因座和生物工艺研究单位(Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit)的农业研究机 构保藏中心(Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection)。为保藏物给出下面的登记号NRRL B-50050。NCAUR的地址是1815N. University Street, Peoria, IL，61604。在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯 条约的条款下，维持该保藏。该保藏仅仅为了本领域技术人员的方便而作出的，且不是对在 35U. S. C. § 112下需要的保藏物的承认。保藏将是不可撤回的，且在专利授权后对公众的获 取没有限制或条件。但是，应当理解，保藏物的可获得并不构成对破坏由政府行为授予的专 利权的实施主题发明的许可。实施方案的两条全长多肽(SEQ ID NO 3和246)与NBS-LRR家族的已知多肽 具有不同程度的同源性。具体地，Rcgl(SEQ ID NO 3)与从稻(Oryza sativa)(登记号 NP_910480 (SEQ ID NO 14)、NP_910482 (SEQ ID NO 16)、NP_921091 (SEQ ID NO 17)禾口 NP_910483 (SEQ IDNO : 15))和大麦(Hordeum Vulgare)(登记号 AAG37354 (SEQ ID NO 18)； Zhou等，(2001)Plant Cell 13 :337_350)分离的NBS-LRR蛋白具有同源性。图2提供了 SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列与稻和大麦蛋白(SEQID NO 14-18)的比对。使用GAP程 序以将SEQ ID NO :3与各种上述稻和大麦序列的氨基酸比对表明，SEQ ID NO :3与稻蛋白 NP_910480 (SEQ ID NO 14)共有约 42. 3%序列相似性，与稻蛋白 NP_910482 (SEQID NO 16) 共有41.7%序列相似性，与稻蛋白NP_921091(SEQ ID N0 17)共有56. 9%相似性，且与稻 蛋白NP_910483 (SEQ ID NO 15)共有42. 1 %序列相似性。此外，SEQ ID NO :3与大麦蛋白 AAG37354(SEQ IDNO 18)共有约 42. 8%序列相似性。对Rcgl肽(SEQ ID NO 246)进行相似的分析，发现其与从稻分离的NBS-LRR蛋 白(登记号 Nos. ABA95308 (SEQ ID NO 250)，ABG66042 (SEQID NO 251), ABA92208 (SEQ ID NO 247)和 ABG66044(SEQ ID NO 248))和从大麦分离的蛋白(登记号 No. AAM22820 (SEQ ID N0249))具有同源性。图31a 31g提供了 SEQ ID NO :246所列氨基酸序列与其中上 面以登记号提供的稻和大麦蛋白(SEQ ID NOs 247-251)的比对。使用ClustalW成对比 对的氨基酸比对(缺口开口罚分=10，缺口延伸罚分=0. 1)表明SEQ ID N0:246与稻蛋 白ABA92208 (SEQ ID NO 247)具有大约37. 的序列同一性，与稻蛋白ABG66044(SEQ ID NO: 248)具有28. 2%的序列同一性，与稻蛋白ABA95308(SEQ ID NO 250)具有26. 6%的同 一性，与稻蛋白ABG66042(SEQ ID NO 251)具有31. 1 %的序列相似性。此外，SEQ ID N0: 3与大麦蛋白AAM22820(SEQ ID NO 249)具有25. 6%的序列相似性。NBS-LRR组的R-基因是迄今为止发现的最大类R-基因。在鼠耳芥(Arbidopsis thaliana)中，预期该基因组中存在超过150个(Meyers，等，(2003)，Plant Cell, 15 809-834 ;Monosi，等，(2004)，Theoretical andApplied Genetics, 109 1434—1447)，而在 稻中，已经预测了约500个NBS-LRR基因(Monosi，(2004)同上)。NBS-LRR类的R基因包含2个亚类。第一类NBS-LRR基因含有在它们的N’末端的TIR-Toll/白细胞介素_1样结 构域；迄今为止仅在双子叶植物中发现它们(Meyers，(2003)同上；Monosi，(2004)同上)。 第二类NBS-LRR含有在它们N末端的卷曲螺旋结构域或(nt)结构域(Bai，等(2002)Genome Research, 12 1871-1884 ；Monosi, (2004)同上；Pan，等，(2000), Journal of Molecular Evolution, 50 203-213)。已经在双子叶植物和单子叶植物物种中发现了第二类NBS-LRR。 (Bai, (2002)同上；Meyers，(2003)同上；Monosi，(2004)同上；Pan，(2000)同上)。基因的NBS结构域似乎在植物防御机制的信号传导中起作用(vander Biezen, 等，(1998)，Current Biology :CB，8 :R226_R227)。LRR 区域似乎是与病原体 AVR 产物相互 作用的区域(Michelmore，等，(1998)，Genome Res.，8 1113-1130 ；Meyers, (2003)同上)。 与NBS结构域相比，该LRR区域处于大得多的多样性选择压力下(Michelmore，(1998)同 上；Meyers, (2003)同上；Palomino,等，(2002)，Genome Research, 12 1305—1315)。LRR 结 构域也见于其它背景下；这些20-29-残基基序以串联阵列存在于具有不同功能的许多蛋 白中，所述功能例如激素-受体相互作用、酶抑制、细胞粘附和细胞运输。许多最近的研究 揭示，LRR蛋白参与早期哺乳动物发育 、神经发育、细胞极化、基因表达的调节和细胞凋亡信 号传导。实施方案的基因显然与第2类家族的NBS-LRR相关，但是不会完全拟合经典模型。 氨基端与所谓的核苷酸结合位点(NBS)具有同源性。也存在富亮氨酸的区域，如预期的， 位于NBS的下游。但是，与以前研究的NBS-LRR蛋白不同，富亮氨酸的区域缺少在更经典 的LRR结构域中发现的系统性重复性质，在一般Lxx重复模式后一致性更低，且尤其不具有 Wang 等((1999)Plant J. 19 :55_64 ；尤其参见，图 5)或Bryan 等((2000)，Plant Cell 12 2033-2045 ；尤其参见，图3)所述的共有序列的实例。除了 NBS和LRR结构域外，Rcglb含 有蛋白激酶结构域。由于LRR区域是NBS-LRR的受体部分，所以当发现新的LRR时，例如本发明公开的 那些，从该序列不能立即明显得出它的活性范围，即它会起反应的病原体的范围。在Cg抗 性表型的基础上，分离了实施方案的基因，且因此新的LRR对Cg反应。但是，不排除它们对 在此前进行的工作中没有测定的其它病原体反应。实施方案的核酸和多肽可以用于赋予或增强植物的真菌抗性的方法中。因此，本 文公开的组合物和方法可以用于保护植物免受真菌病原体。“病原体抗性”、“真菌抗性”和 “疾病抗性”意指该植物避免疾病症状，所述症状是植物-病原体相互作用的结果。也就是 说，预防病原体造成植物疾病和相关的疾病症状，或者，使病原体造成的疾病症状最小化或 减轻，例如，减少应激和相关的产量损失。本领域技术人员将明白，本文公开的组合物和方 法可以与本领域用于保护植物免受病原体攻击的其它组合物和方法一起使用。因此，实施方案的方法可以用于保护植物免受疾病，尤其由植物真菌病原体造成 的那些疾病。本文使用的“真菌抗性”指，与野生型植物相比，增强的对真菌病原体的抗性或 耐受性。作用可以从对真菌病原体作用耐受性的轻微增加(例如，部分抑制)至完全抗性， 从而使植物不受真菌病原体存在的影响。增加水平的对特定真菌病原体或对更广谱真菌病 原体的抗性，构成“增强的”或提高的真菌抗性。本发明实施方案也将增强或提高真菌植物 病原体抗性，从而使植物对真菌病原体或病原体的抗性增加。术语“增强”指提高、增加、扩 增、倍增、升高、增高等。在本文中，将本发明的植物描述成抗Cg感染，或对Cg感染具有增强的抗性'，这是本发明的Rcgl基因座的结果。因此，与因为缺少Rcgl基因座而对Cg感染易感的等价植物相比，它们通常表现出增加的对疾病的抗性。例如，使用实施例11(也参 见图20)所述的评分系统，与因为缺少Rcgl基因座而对Cg感染易感的等价植物相比时，它 们的感染评分通常表现出1点、2点、或3点或更多的降低，甚至评分减少至1或0。在具体方面，赋予或增强植物的真菌抗性的方法包含，向植物中导入至少一个表 达盒，其中所述表达盒包含编码实施方案的抗真菌多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列各 自可操作地连接到驱动在植物中的表达的启动子上。植物表达这两种多肽，从而赋予植物 真菌抗性，或提高植物的固有抗性水平。在具体实施方案中，该基因赋予对真菌病原体Cg 的抗性。如果需要，本领域技术人员能够制造两种独立的转基因植物，其各自表达这两种多 肽的一种，并然后将这两种植物杂交，选择表达这二者多肽的植物。实施方案的抗真菌多肽的表达，可以靶向其中病原体抗性是特别重要的特定植物 组织，例如，叶子、根、茎或维管组织。这样的组织-优选的表达可以通过根-优选的、叶 子_优选的、维管组织_优选的、茎_优选的、或种子_优选的启动子来实现。本文使用的“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物， 且除非另有限制，包括具有天然核苷酸的基本性质、表现为它们以与天然存在的核苷酸类 似的方式与单链核酸杂交的已知类似物(例如，肽核酸)。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换地用于指氨基酸残基的聚合物。该术 语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学 类似物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物。实施方案的多肽可以从本文公开的核酸生产， 或通过使用标准的分子生物学技术生产。例如，实施方案的截短的蛋白可以通过在适当宿 主细胞中表达实施方案的重组核酸来生产，或者通过先体外后体内方法的组合，例如蛋白 酶消化和纯化来生产。当在指定的核酸的上下文中使用时，本文使用的术语“编码”或“编码的”指，该核 酸包含指导核苷酸序列翻译成指定蛋白的必需信息。通过使用密码子，指定编码蛋白的信 息。编码蛋白的核酸可以包含在核酸的翻译区内的非翻译序列(例如，内含子)，或可以缺 少这样的间插非翻译序列(例如，象在cDNA中那样)。本发明实施方案包括分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白组合物。“分离的” 或“纯化的”多核苷酸或蛋白、或其生物活性部分，是相当大地或基本上不含有在它天然存 在的环境中发现的正常伴随该多核苷酸或蛋白或与其相互作用的组分。因而，分离的或纯 化的多核苷酸或蛋白基本上不含有其它细胞材料，或当通过重组技术(例如PCR扩增)生 产时的培养基，或当化学合成时基本上不含有化学前体或其它化学药品。最佳地，“分离的” 多核苷酸不含有在该多核苷酸所来源的生物的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的序列 (即，位于多核苷酸的5'和3'末端的序列)(例如，蛋白编码序列)。例如，在各种实施方 案中，分离的多核苷酸可以含有小于约5kb、约4kb、约3kb、约2kb、约lkb、约0. 5kb、或约 0. Ikb的在该多核苷酸所来源的细胞的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的核苷酸序列。 基本上不含有细胞材料的蛋白包括含有小于约30%、约20%、约10%、约5%、或约1 % (按 干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当重组生产实施方案的蛋白、或其生物活性部分时，培养 基最佳地代表小于约30%、约20%、约10%、约5%、或约(按干重计)的化学前体或非 目标蛋白化学药品。
实施方案也包括公开的核苷酸序列和其编码的蛋白的片段和变体。“片段”意在指 核苷酸序列的部分或氨基酸序列的部分，和由此编码的蛋白。核苷酸序列片段可以编码保 持天然蛋白的生物活性的蛋白片段，并因此具有赋予植物真菌抗性的能力。或者，用作杂交 探针的核苷酸序列片段不一定编码保持生物活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列片段可以 是至少约15个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，且最高达编码实施方案多肽的全 长核苷酸序列。编码实施方案多肽的生物活性部分的核苷酸序列片段将编码至少约15、约25、约 30、约40、或约50个邻接氨基酸，或最高达实施方案全长多肽中存在的氨基酸总数(例如， SEQ ID NO :1编码的肽的980个氨基酸)。用作杂交探针或PCR引物的核苷酸序列片段通 常不需要编码蛋白的生物活性部分。当提及指定的多核苷酸时，本文使用的“全长序列”指天然序列的整个核酸序列。 “天然序列”意在指内源序列，即见于生物基因组中的非工程改造的序列。 因而，实施方案核苷酸序列的片段可以编码多肽的生物活性部分，或它可以是用 作使用下述方法的杂交探针或PCR引物的片段。通过分离实施方案核苷酸序列之一的部 分，表达编码的蛋白部分，和评价编码的蛋白部分赋予或增强植物的真菌抗性的能力，可以 制备抗病原体多肽的生物活性部分。作为实施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至 少约15、约20、约50、约75、约100、或约150个核苷酸，或最高达本文公开的全长核苷酸序 列中存在的核苷酸数目(例如，对于SEQ ID N0:l，4212个核苷酸)。“变体”意在指基本上类似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的 一个或多个内部位点处缺失和/或添加一个或多个核苷酸，和/或在天然多核苷酸的一个 或多个位点置换一个或多个核苷酸。本文使用的“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存 在的核苷酸序列或氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，可以构建实施方案核酸的变体， 从而维持可读框。关于多核苷酸，保守变体包括这样的序列，其因为遗传密码的简并性，编 码实施方案多肽之一的氨基酸序列。天然存在的等位基因变体，例如使用众所周知的分子 生物学技术(例如，下述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)可以鉴别出的那些。变体多 核苷酸也包括合成地衍生的多核苷酸，例如使用例如定点诱变产生、但是仍然编码实施方 案蛋白的那些。通常，如通过本文别处所述的序列比对程序和参数测得的，实施方案的特定 多核苷酸的变体与该特定多核苷酸将具有至少约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、 约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95 %、约96 %、约97 %、约98 %、约99 %或更高序列同一性。通过对比变体多核苷酸编码的多肽和参照多核苷酸编码的多肽之间的百分比序 列同一性，也可以评价实施方案的特定多核苷酸(即，参照多核苷酸)的变体。因而，例如， 公开了编码与SEQ ID NO :3或246的多肽具有给定百分比序列同一性的多肽的分离的多核 苷酸。使用本文别处所述的序列比对程序和参数，可以计算任意2个多肽之间的百分比序 列同一性。当通过对比它们编码的2个多肽共有的百分比序列同一性来评价任意一对给定 的实施方案多核苷酸时，2个编码的多肽之间的百分比序列同一性是至少约40%、约45%、 约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高序列同一性。“变体”蛋白意在指，通过在天然蛋白的一个或多个内部位点处缺失或添加一个或多个氨基酸，和/或在天然蛋白的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸，从天然蛋白衍生出的蛋白。实施方案包括的变体蛋白是生物活性的，也就是说，它们继续具有需要的天 然蛋白的生物活性，即本文所述的赋予或增强植物真菌病原体抗性的能力。这样的变体可 以源自例如基因多态性或人工操作。如通过本文别处所述的序列比对程序和参数测得的， 实施方案天然蛋白的生物活性变体与天然蛋白的氨基酸序列将具有至少约40%、约45%、 约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的序列同一性。实 施方案蛋白的生物活性变体可以与该蛋白相差少至约1-15个氨基酸残基，少至约1-10个、 例如约6-10个、少至约5个、少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。可以以各种方式改变实施方案的蛋白，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。这 样的操作的方法是本领域普遍已知的。例如，通过DNA突变，可以制备出抗病原体蛋白 的氨基酸序列变体和片段。诱变和多核苷酸改变的方法是本领域众所周知的。参见，例 如，Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82 488-492 ；Kunkel 等(1987)Methods in Enzymo 1. 154 :367_382 ；美国专利号 4，873，192 ；Walker 和 Gaastra，编· (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, NewYork)禾口其中弓I用的参考文 献。关于不影响目标蛋白的生物活性的适当氨基酸置换的指南，可以参见本文引作参考的 Dayhoff 等(1978)Atlasof Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.)的模型。保守置换可能是最佳的，例如将一个氨基酸替换为具有类似性 质的另一个氨基酸。因而，实施方案的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突变体形式。类似地， 实施方案的蛋白包括天然存在的蛋白及其变体和修饰形式。这样的变体将继续具有需要的 赋予或增强植物真菌病原体抗性的能力。显然，将在编码变体的DNA中产生的突变必须不 能将该序列置于读框之外，且最佳地将不产生互补区，后者会产生二级mRNA结构。参见，欧 洲专利号0075444。预期本文包含的蛋白序列的缺失、插入和置换不产生蛋白特征的根本变化。但是， 当事先难以预测置换、缺失或插入的确切作用时，本领域技术人员将明白，将通过筛选已经 用变体蛋白转化的转基因植物，以确定对植物的抗真菌病原体攻击能力的作用，来评价该 作用。变体多核苷酸和蛋白也包括源自诱变或重组操作的序列和蛋白，包括且不限于诸 如DNA改组的操作。本领域技术人员能预见到会改变蛋白响应的病原体范围的修饰。利 用这样的操作，可以操纵一个或多个不同的蛋白编码序列，以生成具有所需的性质的新蛋 白。以此方式，从包含具有相当大序列同一性、且可以体外或体内同源重组的序列区域的 相关序列多核苷酸群体生成重组多核苷酸文库。例如，使用该方案，可以使编码目标结构 域的序列基序在实施方案的蛋白基因和其它已知蛋白基因之间改组，以得到编码具有提 高的目标性质的蛋白的新基因，例如提高的赋予或增强植物真菌病原体抗性的能力。这 样的DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 10747-10751 ；Stemmer(1994)Nature 370 :389_391 ；Crameri 等(1997)Nature Biotech. 15 :436_438 ；Moore 等(1997)J.Mol. Biol. 272 :336_347 ；Zhang 等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 4504-4509 ；Crameri 等(1998) Nature 391 :288_291 ；和美国专利号 5，605，793 和 5，837，458。实施方案的多核苷酸可以用于从其它生物、尤其其它植物分离对应的序列。以此 方式，诸如PCR、杂交等的方法等可以用于鉴别这样的序列，这基于它们与本文所述序列的 序列同源性。实施方案包括，基于它们与本文所述整个序列或其变体和片段的序列同一性 而分离的序列。这样的序列包括作为公开序列的直向同源物的序列。“直向同源物”意在指 源自共同祖先基因且由于物种形成而见于不同物种中的基因。当它们的核苷酸序列和/或 它们编码的蛋白序列共有至少约60 %、约70 %、约75 %、约80 %、约85 %、约90 %、约91 %、 约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、或更大的序列同一性 时，认为在不同物种中发现的基因是直向同源物。直向同源物的功能经常在物种间是高度 保守的。因而，实施方案包括分离的多核苷酸，其编码赋予或增强真菌植物病 原体抗性的蛋 白，且在严格条件下与本文公开的序列或其变体或片段杂交。在PCR方案中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应中，以从提取自任意目标生物 的cDNA或基因组DNA扩增对应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法，是本领域 普遍已知的，且公开在 Sambrook 等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (2d ed. , Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, New York)。也参见 Innis 等， 编· (1990) PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (AcademicPress, New York) ；Innis禾口Gelfand,编· (1995)PCR Strategies(AcademicPress,New York)；禾口Innis 禾口 Gelfand，编· (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)。已知的 PCR 方 法包括、且不限于，使用配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因-特异性引物、 载体_特异性引物、部分地错配的弓I物等的方法。在杂交技术中，使用全部或部分已知的多核苷酸作为探针，该探针选择性地与存 在于从选定的生物克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群体(即，基因组或cDNA文库)中 的其它对应多核苷酸杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡 核苷酸，且可以用可检测基团(例如32P)或任意其它可检测标记作出标记。因而，例如，通 过标记基于实施方案多核苷酸的合成寡核苷酸，可以制作杂交探针。制备杂交探针和构建 cDNA和基因组文库的方法，是本领域普遍已知的，且公开在Sambrook等(1989)同上。例如，本文公开的整个多核苷酸、或其一个或多个部分，可以用作能特异性与对应 多核苷酸和信使RNA杂交的探针。为了实现在许多条件下的特异性杂交，这样的探针包括 独特的、且最佳为至少约10个核苷酸长、至少约15个核苷酸长或至少约20个核苷酸长的 序列。这样的探针可以用于通过PCR从选定的生物扩增对应多核苷酸。该技术可以用于从 所需生物分离其它编码序列，或作为确定生物中存在编码序列的诊断测定。杂交技术包括 铺平板的DNA文库的杂交筛选(噬斑或菌落；参见，例如，Sambrook等(1989)同上)。这样的序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”意指 这样的条件，在该条件下，探针将与它的靶序列的杂交程度在检测上大于与其它序列的杂 交程度(例如，为背景的至少2-倍)。严格条件是序列-依赖性的，且在不同情况下将是不 同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴别出与探针100%互补的靶序列(同 源探测)。或者，可以调节严格性条件，以允许序列中的有些错配，从而检测更低程度的相似 性(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，最佳长度小于500个核苷酸。一般地，严格条件是这样的，其中盐浓度小于约1. 5M Na离子，通常约0. 01-1. OMNa离子浓度(或其它盐)，pH 7. 0-8. 3，且对于短探针(例如，10_50个核苷酸)，温度是至 少约30°C，而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)，温度是至少约60°C。通过加入去稳定 剂例如甲酰胺，也可以达到严格条件。示例性的低严格性条件包括，在37°C用30-35%甲酰 胺、IM NaCl、l% SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，及在50_55°C在1X-2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括，在37°C、在 40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、l% SDS中杂交，和在55-60°C、在0. 5X-1X SSC中洗涤。示例性 的高严格性条件包括，在37°C、在50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中杂交，最后在60-65 °C、在
0.IX SSC中洗涤至少30分钟。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0. -约SDS0杂交 持续时间通常小于约24小时，经常约4-约12小时。洗涤持续时间将至少是足以达到平衡 的时间长度。特异性通常随杂交后的洗涤而变化，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温 度。 对于 DNA-DNA 杂交体，可以从 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267_284 的 方程估计出热解链温度(Tm) =Tm = 81. 50C +16. 6 (log M)+0. 41 (% GC)-0. 61 (% form)-500/ L ；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，% GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，% form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，且L是按碱基对计算的杂交体长度。Tm是50%的互 补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和PH下)。对于每的错 配，Tm降低约1°C ；因而，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件，以与所需同一性的序列杂交。 例如，如果要得到具有> 90%同一性的序列，则可以使Tm降低10°C。通常，将严格性条件选 择在，在确定的离子强度和PH处，比特定序列序列和它的互补体的Tm低约5°C。但是，非常 严格的条件可以使用比1低1、2、3或4°C的杂交和/或洗涤；中等严格性条件可以使用比 Tm低6、7、8、9或10°C的杂交和/或洗涤；低严格性条件可以使用比Tm低11、12、13、14、15 或20°C的杂交和/或洗涤。使用该方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人 员将理解，内在地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所需的错配程度产生 小于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，则最佳地增加SSC浓度，从而可以使 用更高的温度。关于核酸杂交的广泛指南，参见Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes, Part
1,Chapter 2 (Elsevier, New York)；禾口 Ausubel 等，编· (1995) Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2(GreenePublishing and ffiley-Interscience,New York)。 参见Sambrook等(1989)同上。各种方法可以用于检查存在或不存在DNA、RNA、或蛋白的特定序列。它们包括，例 如，DNA印迹、RNA印迹、蛋白印迹和ELISA分析。这样的技术是本领域技术人员众所周知 的，且存在许多参考文献，它们提供了详细方案。这样的参考文献包括Sambrook等(1989) 同上，禾口 Crowther，J. R. (2001)，The ELISA Guidebook, Humana Press, Totowa, NJ, USA。下面的术语用于描述2个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系(a) “参照序 列，”(b) “对比窗，”(c) “序列同一性，”和，(d) “序列同一性百分比”。(a)本文使用的“参照序列”是用作序列对比的基础的确定序列。参照序列可以是 指定序列的子集或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或整个cDNA或基因序列。(b)本文使用的“对比窗”指多核苷酸序列的邻接的和指定的片段，其中与用于2 个多核苷酸的最佳比对的参照序列(不包含添加或缺失)相比，对比窗中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即，缺口)。通常，对比窗的长度是至少约20个邻接核苷酸，且任选 地可以是约30、约40、约50、约100、或更长。本领域技术人员理解，为了避免由于在多核苷 酸序列中包含缺口而与参照序列的高相似性，通常导入缺口罚分，并从匹配数目中减去。比对对比序列的方法是本领域众所周知的。因而，使用数学算法，可以确定任 意2个序列之间的序列同一性百分比。这样的数学算法的非限制性实例是Myers和 Miller (1988)CABI0S4 :11_17 的算法；Smith 等(1981)Adv. Appl. Math. 2 482 的局部比 对算法；Needleman 和 Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48 :443_453 的全局比对算法；Pearson 和 Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 2444-2448 的局部搜索比对方法；Karlin 禾口 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264 的算法，如在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877 中所改进的。这些数学算法的计算机实现，可以用于对比序列，以确定序列同一性。这样的实 现包括，且不限于PC/Gene 程序中的 CLUSTAL(可从 Intelligenetics，Mountain View, California 得到)；ALIGN 程序(2. 0)和 GCGWisconsin Genetics 软件包 10 版(可从 Accelrys Inc. , 9685Scranton Road, San Diego，California，USA得到)中的GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA和TFASTA。使用默认参数，可以执行使用这些程序的比对。CLUSTAL程序 详细记载在 Higgins 等(1988)Gene 73:237-244(1988) ；Higgins 等(1989)CABIOS 5 151-153 ；Corpet 等(1988)Nucleic Acid Res. 16 10881-90 ；Huang 等(1992)CABIOS 8 155-65 ；和 Pearson 等(1994) Meth. Mol. Biol. 24 :307_331。ALIGN 程序是基于上面 Myers 和Miller(1988)的算法。当对比氨基酸序列时，可以在ALIGN程序中使用PAM 120加权 残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403的 BLAST程序是基于上面Karlin和Altschul (1990)的算法。可以用BLASTN程序进行BLAST 核苷酸搜索，评分=100，字长=12，以得到与编码实施方案蛋白的核苷酸序列同源的核苷 酸序列。可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，评分=50，字长=3，以得到与实施方案 蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了得到用于对比目的的有缺口的比对，可以如Altschul 等(1997) Nucleic Acid Res. 25 :3389 所述使用有缺口的 BLAST (在 BLAST 2. O 中)。或者， PSI-BLAST (在BLAST2.0中)可以用于进行重复搜索，其检测分子之间的距离关系。参见 Altschul等(1997)同上。当使用BLAST、有缺口的BLAST、PSI_BLAST时，可以使用各程序 的默认参数(例如，对于核苷酸序列的BLASTN，对于蛋白的BLASTX)。参见网站ncbi. nlm. nih.gov。也可以通过目检，手工地进行比对。除非另有说明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP 10版、使用下述参 数得到的值使用50的缺口权重和3的长度权重和nwsgapdna. cmp评分矩阵，核苷酸序列 的％同一性和％相似性；使用8的缺口权重和2的长度权重和BL0SUM62评分矩阵，氨基酸 序列的％同一性和％相似性；或其任意等价程序。“等价程序”是指，当与GAPlO版生成的对 应比对相对比时，对于任意2个正被讨论的序列，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配 和相同百分比序列同一性的比对的任意序列对比程序。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 443-453 的算法，以发现使 匹配数最大化且使缺口数最小化的2个完整序列的比对。GAP考虑所有可能的比对和缺口 位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少缺口的比对。它允许提供以匹配碱基为单位 的缺口产生罚分和缺口延伸罚分。对于插入的每个缺口，GAP必须利用缺口产生罚分匹配数。如果选择大于O的缺口延伸罚分，则GAP对于每个插入的缺口必须另外利用缺口长度乘以缺口延伸罚分。在GCG Wisconsin Genetics软件包10版中，蛋白序列的默认缺口生 成罚分值和缺口延伸罚分值分别是8和2。对于核苷酸序列，默认缺口生成罚分是50，而 默认缺口延伸罚分是3。缺口生成和缺口延伸罚分可以表达为选自0-200的整数。因而， 例如，缺口生成和缺口延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65 或更大。GAP代表最佳比对家族的一个成员。该家族可以存在许多成员，且其它成员没有更 好的品质。GAP表现出4个比对品质因数品质、比率、同一性和相似性。品质是计量最大化 的，以比对序列。比率是品质除以更短片段中的碱基数。百分比同一性是实际上匹配的符号 的百分比。百分比相似性是相似的符号的百分比。忽略在缺口对面的符号。当一对符号的 评分矩阵值大于或等于0.50 (相似性阈值)时，评为相似性。在GCG Wisconsin Genetics 软件包10版中使用的评分矩阵是BL0SUM62 (参见Henikoff和Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915)。(c)在2个多核苷酸或多肽序列的上下文中，本文使用的“序列同一性”或“同一 性”指，当比对指定对比窗中的最大一致性时，2个序列中相同的残基。当序列同一性百分 比用于指蛋白时，公认的是，不同的残基位置的差异经常在于保守氨基酸置换，其中氨基酸 残基被置换为具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，且因此不改变 该分子的功能性质。当序列差异在于保守置换时，可以向上调节百分比序列同一性，以改正 置换的保守性质。据称差异在于这样的保守置换的序列具有“序列相似性”或“相似性”。 进行该调节的方法，是本领域技术人员众所周知的。一般地，这包含将保守置换评分为部分 的、而不是完全的错配，从而增加百分比序列同一性。因而，例如，当相同氨基酸评分为1、且 非保守置换评分为O时，保守置换评分是在0-1之间。计算保守置换的评分，例如，如在程 序 PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View, California)中所实现的。(d)本文使用的“序列同一性百分比”指，通过在对比窗中对比2个最佳比对的序 列测得的值，其中与用于2个序列的最佳比对的参照序列(不包含添加或缺失)相比，对比 窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。如下计算百分比确定2个序 列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以得到匹配位置的数目，将匹配位置 的数目除以对比窗中的位置总数，并将结果乘以100，以得到序列同一性百分比。术语“多核苷酸”的应用，无意将实施方案限制为包含DNA的多核苷酸。本领域技 术人员将认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。 这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。实施方案的多 核苷酸也包括序列的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式等。实施方案的分离的多核苷酸可以整合入能导入宿主细胞并在其中复制的重组DNA 构建体中。“载体”可以是这样的构建体，其包括复制系统和能在给定宿主细胞中转录和 翻译多肽编码序列的序列。已经描述了适用于稳定转染植物细胞或确立转基因植物的许 多载体，例如，Pouwels 等，Cloning Vectors :A Laboratory Manual，1985，supp. 1987 ； Weissbach 和 Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，1989 ; 和 Flevin 等，Plant Molecular Biology Manual,KluwerAcademic Publishers，1990。一 般地，植物表达载体包括，例如，在5'和3'调节序列和显性选择标记的转录控制下的一个或多个克隆的植物基因。这样的植物表达载体也可以含有启动子调节区(例如，控制诱 导型或组成型、环境-或发育-调节的、或细胞-或组织-特异性的表达的调节区)、转录起 始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。术语“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”、“重组DNA 构建体”和“重组DNA片段”在本文中可互换地使用，且是核酸片段。重组构建体包含核酸 片段的人工组合，包括且不限于，在自然界不一起发现的调节和编码序列。例如，重组DNA 构建体可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或源自相同来源且以与自然 界发现 的不同的方式排列的调节序列和编码序列。这样的构建体可以单独使用，或可以与载体结 合使用。如果使用载体，则载体的选择依赖于用于转化宿主细胞的方法，如本领域技术人员 众所周知的。例如，可以使用质粒载体。熟练的技术人员熟知必须存在于载体上的遗传元 件，以成功地进行转化、选择和繁殖包含实施方案的任意分离的核酸片段的宿主细胞。通过 扩增、DNA印迹分析、mRNA表达的RNA印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析、表型分析等，可 以进行筛选，以得到表现出多核苷酸或Rcgl基因座的所需表达水平和模式的系。术语“重组DNA构建体”指由从不同来源获取的核酸片段装配而成的DNA构建体。 核酸片段的类型和起源可以非常不同。在有些实施方案中，另外提供了包含可操作地连接到实施方案的异源核苷酸序列 上的启动子的表达盒。实施方案的表达盒可以用于生成转化的植物、植物细胞和微生物，及 用于实施诱导本文公开的植物真菌病原体抗性的方法。表达盒包括可操作地连接到实施方 案的多核苷酸上的5'和3'调节序列。“可操作地连接”意在指2个或更多个元件之间的 功能连接。“调节序列”指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、之内或下游(3’非编码 序列)的核苷酸，且其可以影响相关编码序列的转录、RNA加工、稳定性或翻译。调节序列可 以包括，但不限于，启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。例如，目标多核 苷酸和调节序列(启动子，例如)之间的可操作连接是允许表达目标多核苷酸的功能连接。 可操作地连接的元件可以是邻接的或非邻接的。当用于指2个蛋白编码区的连接时，可操 作地连接的意指编码区是在相同读框中。表达盒可以另外含有至少一个要共转化进生物中 的其它基因。或者，可以在多个表达盒上提供其它基因。这样的表达盒提供有多个限制位 点和/或重组位点，用于插入在调节区的转录调节下的编码抗病原体多肽的多核苷酸。表 达盒可以另外含有选择标记基因。表达盒将在5' -3'转录方向包含转录起始区(即，启动子)、翻译起始区、实施 方案的多核苷酸、翻译终止区和在宿主生物中起功能的任选的转录终止区。调节区(即，启 动子、转录调节区和翻译终止区)和/或实施方案的多核苷酸对于宿主细胞而言或相互可 以是天然的/类似的。或者，调节区和/或实施方案的多核苷酸可以是宿主细胞异源的或 彼此异源的。本文使用的“异源的”序列是源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种， 则通过故意的人工干预，从它在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行相当大的修 饰。例如，可操作地连接到异源多核苷酸上的启动子来自与多核苷酸所来源的物种不同的 物种，或者如果来自相同/类似物种，则从它们的原始形式和/或基因组基因座相当大地修 饰其中之一或二者，或者启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。任选地包含的终止区可以是对于转录起始区天然的，可以是对于可操作地连接 的目标多核苷酸天然的，可以是对于植物宿主天然的，或可以源自启动子、目标多核苷酸、宿主或其任意组合的另一个来源(即，外来的或异源的)。方便的终止区可以从根癌土壤 杆菌(A. tumefaciens)的Ti-质粒得到，例如，章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见 Guerineau 等(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ;Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon 等(1991)Genes Dev. 5 141-149 ；Mogen 等(1990)Plant Cell 2:1261-1272; Munroe 等(1990)Gene 91 :151_158 ；Ballas 等(1989)Nucleic Acid Res. 17 :7891_7903 ； 和Joshi等(1987)Nucleic AcidRes. 15 :9627_9639。在具体实施方案中，使用马铃薯蛋 白酶抑制剂II基因(PinII)终止子。参见，例如，Keil等(1986)Nucl. Acids Res. 14 5641-5650 ；和An等(1989) Plant Cell 1 :115_122，它们在本文中整体引作参考。许多启动子可以用于实践实施方案，包括目标多核苷酸序列的天然启动子。可以 基于所需的结果来选择启动子。在本文引作参考的Potenza等(2004) In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40 :1_22的最近的综述中，讨论了许多种植物启动子。例如，核酸可以与组成 型、组织-优选的、病原体-诱导型或其它启动子相组合，以在植物中表达。这样的组成型启 动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子，和在WO 99/43838和美国专利号6，072，050中 公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313 :810_812)； 稻肌动蛋白(McElroy 等(1990)PlantCell 2:163-171)；遍在蛋白(Christensen 等 (1989)Plant Mol. Biol. 12 619-632 和 Christensen 等(1992)Plant Mol. Biol. 18 675-689) ；pEMU(Last 等(1991)Theor. Appl. Genet. 81 581-588) ；MAS(Velten 等(1984) EMBO J. 3 =2723-2730) ；ALS启动子(美国专利号5，659，026)，等。其它组成型启动子包括， 例如，美国专利号 5，608，149 ；5，608，144 ；5，604，121 ；5，569，597 ；5，466，785 ；5，399，680 ； 5，268，463 ；5，608，142 ；和 6，177，611。有时，从诱导型启动子、尤其从病原体-诱导型启动子表达基因有时是有益的。这 样的启动子包括，来自致病相关蛋白(I3R蛋白)的那些，它们在病原体感染后被诱导；例 如，I3R蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如，Redolfi等(1983) Neth. J. Plant Pathol. 89 245-254 ；Uknes 等(1992)Plant Cell 4:645-656;和 Van Loon(1985)Plant Mol. Virol. 4 :111_116。也参见本文引作参考的 W099/43819。令人感兴趣的是导致在病原体感染部位处或附近局部地表达蛋白的启动子。参 见，例如，Marineau 等(1987)Plant Mol. Biol. 9 335-342 ；Matton 等(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2 325-331 ；Somsisch 等(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 2427-2430 ；Somsisch 等(1988)Mol. Gen. Genet. 2 :93_98 ；和 Yang(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 14972-14977。也参见，Chen 等(1996)Plant J. 10 :955_966 ；Zhang 等 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 2507-2511 ；Warner 等(1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz 等(1989) Plant Cell 1 :961_968 ；美国专利号 5，750，386 (线虫-诱导型)；和其 中引用的参考文献。特别令人感兴趣的是玉米PRms基因的诱导型启动子，它的表达由病原 体串珠镰孢(Fusarium moniliforme)诱导(参见，例如，Cordero 等(1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41 189-200)。另外，随着病原体通过伤口或昆虫损伤进入植物，伤口 _诱导型启动子可以用 于实施方案的构建。这样的伤口-诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(Pin II)基 因(Ryan (1990)Ann. Rev. Phytopath. 28 :425-449 ;Duan 等(1996)Nature Biotechnology 14 494-498) ；wunl 和 wun2,美国专利号 5，428，148 ；winl 和 win2 (Stanford 等(1989)Mol. Gen. Genet. 215 200-208)；系统素(McGurl 等(1992) Science 225 1570-1573)； WIPl (Rohmeier 等(1993)Plant Mol. Biol. 22 783-792 ；Eckelkamp 等(1993)FEBS Letters 323:73-76) ；MPI 基因(Corderok 等(1994)Plant J. 6 (2) :141_150)；等，本文引
作参考。通过应用外源化学调节剂，可以将化学药品调节的启动子用于调节基因在植物中 的表达。根据目的，启动子可以是化学药品_诱导型启动子(这时使用化学药品诱导基因表 达)或化学药品_抑制型启动子(这时使用化学试剂阻抑基因表达)。化学药品_诱导型 启动子是本领域已知的，并包括且不限于，玉米In2-2启动子，它由苯磺酰胺除草剂安全剂 激活，玉米GST启动子，它由用作突出前(pre-emergent)除草剂的疏水亲电子化合物激活， 和烟草PR-Ia启动子，它由水杨酸激活。其它化学药品调节的目标启动子包括类固醇-响 应型启动子(参见，例如，Schena 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 10421-10425 和 McNellis等(1998)Plant J. 14(2) :247_257中的糖皮质激素-诱导型启动子)和四环 素-诱导型和四环素-阻抑型启动子(参见，例如，Gatz等(1991)Mol.Gen. Genet. 227 229-237，和美国专利号5，814，618和5，789，156)，本文引作参考。组织-优选的启动子可以用于在特定植物组织内靶定增强的实施方案的多肽的 表达。例如，组织-优选的启动子可以用于在疾病抗性特别重要的植物组织(例如，根、 茎或叶子)中表达多肽。组织-优选的启动子包括Yamamoto等(1997)Plant J. 12(2) 255-265 ；Kawamata 等(1997)Plant Cell Physiol. 38(7) 792-803 ；Hansen 等(1997) Mol.Gen Genet. 254(3) 337-343 ；Russell 等(1997)Transgenic Res. 6(2) 157-168 ； Rinehart 等(1996)Plant Physiol. 112(3) 1331-1341 ；Van Camp 等(1996)Plant Physiol.112(2) 525-535 ；Canevascini 等(1996)PlantPhysiol.112 (2) :513_524 ； Yamamoto 等(1994)Plant Cell Physiol. 35(5) 773-778 ；Lam(1994)Results Probl. Cell Differ. 20 181-196 ；Orozco 等(1993)Plant Mol Biol.23(6) 1129-1138 ；Matsuoka 等 (1993)Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20) :9586_9590 ；和 Guevara-Garcia 等(1993)Plant J. 4(3) :495-505。如果需要，可以修饰这样的启动子，进行弱表达。维管组织-优选的启动子是本领域已知的，且包括选择性地驱动在例如木质部 和韧皮部组织中的蛋白表达的那些启动子。维管组织-优选的启动子包括且不限于， 野黑樱(Primus serotina)的野黑樱苷水解酶基因启动子(参见，例如，国际
发明者K·E·布罗利, K·H·巴特勒 申请人:纳幕尔杜邦公司