用于扩增核酸的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于扩增核酸的方法和组合物的制作方法
用于扩增核酸的方法和组合物
相关申请的交叉参考本申请依据35U.S.C. § 119(e)要求2007年6月18日申请的美国专利申请号 60/944，708的优先权，该专利申请通过引用结合到本文中。发明领域W001]本发明的公开 内容涉及用于核酸序列扩增的方法和组合物。
导言来自犯罪现场或其它非无菌环境的DNA样品的聚合酶链式反应(PCR)扩增可被样 品自身中存在的抑制因子影响。例如，户外犯罪可能留下体液，例如沉积在土壤、沙地或林 木上的血液和精液，其可以含有可与样品的DNA共提取并阻止PCR扩增的物质。来自室内 犯罪现场的纺织染料、皮革和木制品也可能含有DNA聚合酶抑制因子。扩增含有抑制因子 的DNA样品的最终结果可能是在短串联重复序列(STR)复合体中部分乃至完全缺失等位基 因。
发明概述在某些方面，本发明提供一种用于扩增人类法医样品中的靶核酸序列的方法。所 述方法包括提供含有靶核酸序列的人类法医样品；将至少一种高稳定性引物和靶核酸序列 混合，其中所述高稳定性引物包含至少一种高稳定性核酸类似物；并对样品实施扩增反应， 由此通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。在某些方面，本发明提供一种扩增样品中的核酸序列的方法。所述方法包括提供 含有靶核酸序列的样品，其中所述靶核酸序列包含短串联重复序列；将至少一种高稳定性 引物和靶核酸序列混合，其中所述高稳定性引物包含至少一种高稳定性核酸类似物，其中 所述高稳定性引物以允许短串联重复序列扩增的方式与靶核酸序列特异性杂交；并对样品 实施扩增反应，由此通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。在某些方面，本发明提供一种用于PCR反应的试剂盒。所述试剂盒包括三磷酸 脱氧核苷酸；荧光标记引物；非标记引物，其中至少一种引物是高稳定性引物，其中所述高 稳定性引物包含至少一种高稳定性核酸类似物；装有等位基因分型标准物(an allelic ladder)的容器，所述等位基因分型标准物对应于适于同短串联重复序列分析比较的大小； 和DNA聚合酶。在某些方面，本文提供用于PCR反应的试剂盒。所述试剂盒包括三磷酸脱氧核苷 酸、荧光标记引物、含有至少一种高稳定性核酸类似物的高稳定性引物和DNA聚合酶。在某些方面，本发明提供一种用于人类鉴定的引物。所述引物具有与选自以下 的至少一个基因座的序列互补的序列:CSF1P0、FGA、THOU TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、 D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433 和 D2S1338，其中所述引物中 的至少一个核酸为高稳定性核酸类似物。在某些方面，本发明提供一种鉴别某个体的靶核酸序列的方法。所述方法包括提 供一种样品，其中所述样品处于被认为被可以抑制核酸扩增的组分污染的位置，其中所述
6样品包含来自个体的靶核酸序列。所述方法进一步包括使用至少一种高稳定性引物扩增 个体的靶核酸序列，其中所述高稳定性引物包含至少一种高稳定性核酸类似物，其中所述 引物可以扩增选自以下的至少一个基因座的序列CSFlP0、FGA、TH01、TP0X、vWA、D3S1358、 D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433、D2S1338 或其某些 组合，其中所述引物进一步包含迁移率调节物。所述方法进一步包括表征扩增的靶核酸序 列，由此鉴定扩增的靶核酸序列。在某些方面，本发明提供一种扩增样品中的核酸序列的方法。所述方法包括提供 包含靶核酸序列和PCR抑制因子的样品；混合至少一种高稳定性引物和靶核酸序列，其中 所述高稳定性引物包含至少一种高稳定性核酸类似物；并对所述样品实施扩增反应，由此 通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。
附图简述

图1显示了扩增靶核酸序列的某些示例性实施方案。图2显示了扩增靶核酸序列的某些示例性实施方案。图3A显示了扩增靶核酸序列的某些示例性实施方案。图3B显示了扩增靶核酸序列的某些示例性实施方案。图4显示了有或没有腐殖酸的珐琅蛋白(Amel)-LNA寡聚物的性能。技术人员应当明白，提供附图仅是为了阐述目的。所述附图无意以任何方式限制 本发明教导的范围。
多个实施方案的描述本发明教导的某些实施方案提供有利于核酸扩增的组合物和方法。在某些实施 方案中，本发明教导提供用于克服或降低扩增抑制的方法和组合物，尤其用于在某些时候 位于非无菌环境中并可以包含污染物如PCR抑制因子的组分或组成物。在某些实施方 案中，本发明教导提供即便在存在这样的PCR抑制因子时也增强现有扩增方案的稳定性 (robustness)的方法和组合物。本领域技术人员将认识到，尽管实验室的一般性核酸扩增对本领域技术人员可能 是常规的，但扩增来自非实验室条件的核酸样品(例如取自犯罪现场的样品)的能力可包 括核酸扩增抑制因子。一种降低PCR抑制因子影响的方法是在同一基因或基因座选择另一 个引发序列。然而，本发明人已认识到，这种方案具有许多潜在的不利方面(例如某些引物 已被确定为可接受的和需要大量工作来引入新引物的情况)。在本文公开内容中公开的某 些实施方案表明了可如何解决这种潜在的不利。与选择新引物相反，已经发现，保持相同的 基础引物序列但是用高稳定性核酸类似物修饰该序列，以使引物在杂交时表现出更高稳定 性(例如其熔点高于对等引物)，具有显著的益处。由于高稳定性核酸类似物的取代是对等 的，所以提供了大量关于应如何修饰每种引物以实现预期结果的指引。另外，该方案可容易 地应用于具有表征引物的试剂盒、组合物和技术(例如，其可用于扩增STR标记，包括CODIS 基因座)。本领域技术人员将认识到，按照本发明的公开内容，保持修饰的高稳定性引物中 的原始引物序列可能是重要的，因为其确保与原始的未修饰引物的基因型一致性。保持相同引物序列的优势是防止由于引物结合位点突变或多态化而引起的等位基因脱落。由样品中的靶核酸序列扩增获得的信息可用于各种用途。例如，所述信息可用于 遗传作图、连锁分析、临床诊断或身分鉴定试验。在某些实施方案中，所述信息可用于鉴别 核酸的来源(例如目标个体)或缩窄核酸的可能来源。在某些这样的实施方案中，所述信 息可用于例如法医学鉴定、生父鉴定试验、DNA谱分析和相关应用。
某些定义
本文使用的术语“核苷酸碱基”是指一个或多个取代的或未取代的芳香族环。在某 些实施方案中，一个或多个芳香族环包含至少一个氮原子。在某些实施方案中，核苷酸碱基 能够与适当互补的核苷酸碱基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氢键。示例性的核苷 酸碱基及其类似物包括但不限于天然核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、6甲基-胞嘧啶、 尿嘧啶、胸腺嘧啶，以及天然核苷酸碱基的类似物，例如7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌 呤、7-脱氮杂-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂腺嘌呤、N6- Δ 2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、 Ν6-Δ2-异戊烯基-2-甲基硫代腺嘌呤(2ms6i Δ)、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7_甲基鸟嘌呤 (7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿 苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、2-硫 代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、 O4-甲基胸腺嘧啶、5，6_ 二氢胸腺嘧啶、5，6_ 二氢尿嘧啶、吡唑并[3，4-D]嘧啶(参见例如 美国专利号6，143，877和6，127，121和PCT公布申请号WO 01/38584)、乙烯基腺嘌呤、吲哚 (如硝基吲哚和4-甲基吲哚)和吡咯(如硝基吡咯)。某些示例性的核苷酸碱基可见于例 如Fasman,1989,Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology,385-394 页，CRC Press, Boca Raton, Fla.，以及其中提及的参考文献。“核苷酸”是指作为单体单元或在核酸中的核苷的磷酸酯。“核苷酸5'-三磷 酸”是指在5 ‘位具有三磷酸酯基团的核苷酸，有时表示为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”， 以具体指出核糖的结构特征。三磷酸酯基团可以包括多个氧的硫取代，例如α-硫代-核 苷酸5'-三磷酸。关于核酸化学的综述参见Shabarova，Ζ.和Bogdanov，A. Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,VCH,New York，1994。术语核苷酸还包括核苷酸类 似物。所述糖可为取代的或未取代的。示例性的核糖包括但不限于2' -(C1-C6)烷氧基核 糖、2' -(C5-C14)芳氧基核糖、2'，3' - 二脱氢核糖、2'-脱氧-3'-卤代核糖、2'-脱 氧-3'-氟代核糖、2'-脱氧-3'-氯代核糖、2'-脱氧-3'-氨基核糖、2'-脱 氧-3' -(C1-C6)烷基核糖、2'-脱氧-3' -(C1-C6)烷氧基核糖和2'-脱氧-3' -(C5-C14) 芳氧基核糖、核糖、2'-脱氧核糖、2' ,3'-双脱氧核糖、2'-卤代核糖、2'-氟代核糖、 2'-氯代核糖和2'-烷基核糖，例如2' -0-甲基、4' -α-异构核苷酸、1' -α-异构 核苷酸、‘-4'-和3' -4'-连接的和其它“已锁的”或“LNA”、双环糖修饰(参见例如 PCT公布申请号WO 98/22489, WO 98/39352 ；和W099/14226)。在多核苷酸中的示例性LNA糖类似物包括但不限于以下结构
其中B为
任何核苷酸碱基。LNA是一类可按照标准Watson-Crick碱基配对规则形成碱基对的核酸类似物。掺 入LNA的寡核苷酸已增加了热稳定性，并改善了相对于它们的核酸靶的区分能力。用于寡 核苷酸合成的LNA可由多个公司商购，例如丹麦的Exiqon (参见国际站点誦exiqon. com 和美国专利号6，670，461，其通过引用整体结合到本文中)。本文使用的术语“核苷酸类似物”是指任何非腺嘌呤、非胸腺嘧啶、非鸟嘌呤、非胞 嘧啶、非尿嘧啶核酸(其中“腺嘌呤”、“胸腺嘧啶”、“鸟嘌呤”、“胞嘧啶”和“尿嘧啶”中的每 一个都仅是指天然核酸)。本领域技术人员将认识到，核苷酸类似物仍将与以上的一种碱基 配对。核苷酸类似物包括高稳定性核苷酸，并因此至少包含PNA (肽核酸)、LNA(锁核酸)、 2' -0-甲基核酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、含硫代磷酸酯键的核酸或其任意组 合。在某些实施方案中，核苷酸类似物是指其中戊糖和/或核苷酸碱基和/或核苷酸的一个 或多个磷酸酯可被其相应类似物置换的实施方案。在某些实施方案中，示例性的戊糖类似 物是上述的那些物质。在某些实施方案中，核苷酸类似物具有如上所述的核苷酸碱基类似 物。在某些实施方案中，示例性的磷酸酯类似物包括但不限于膦酸烷基酯、膦酸甲酯、氨基 磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸 酯、苯胺磷酸酯、磷酸酰胺、硼烷磷酸酯等，并可以包括结合的反离子。可聚合为多核苷酸类 似物的核苷酸类似物单体也包括在“核苷酸类似物”的定义中，在所述多核苷酸类似物中， DNA/RNA磷酸酯和/或糖磷酸酯主链被不同类型的核苷酸间键取代。示例性的多核苷酸类 似物包括但不限于肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸酯主链被肽主链置换。示例性的修饰戊 糖部分包括但不限于2'-修饰或3'-修饰，其中2'-位或3' _位为氢、羟基、烷氧基，例 如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基和苯氧基、叠氮基、氨基或烷基氨 基、氟代、氯代、溴代等。修饰的核苷酸间键包括磷酸类似物、具有非手性的不带电荷的亚单 位间键的类似物(例如Sterchak，E.P.等人，Organic Chem, 52 =4202(1987))以及不带电荷 的基于吗啉代的、具有非手性的亚单位间键的聚合物(例如美国专利号5，034，506)。其中 常规的糖和核苷酸间键已被2-氨基乙基甘氨酸酰胺主链聚合物置换的另一类示例性多核苷酸类似物是肽核酸(PNA)(例如 Nielsen 等人，Science, 254 1497-1500 (1991) ；Egholm 等人，J. Am. Chem. Soc. , 114 1895-1897 (1992))。本文使用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指单链和双链的核苷酸单体聚合物，包括通过核苷酸间磷酸二酯键或者核苷酸间类似物以及结合的反离 子(例如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等)连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷 酸(RNA)。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸组成，完全由核糖核苷酸组成，或由其嵌合混合 物组成。核苷酸单体单元可以包括本文描述的任一种核苷酸，包括但不限于天然核苷酸和 核苷酸类似物。核酸的大小通常在数个单体单元(例如5-40个，此时它们在本领域有时 被称为寡核苷酸)至数千个单体核苷酸单元的范围内。除非另有说明，否则无论何时提出 核酸序列，其都被理解为由左至右核苷酸处于5' -3'的顺序，“A”代表脱氧腺苷或其类似 物，“C”代表脱氧胞苷或其类似物，“G”代表脱氧鸟苷或其类似物，“T”代表胸苷或其类似 物，而“U”代表尿苷或其类似物，除非另有说明。核酸还包括但不限于基因组DNA、eDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化核酸、得 自亚细胞器如线粒体或叶绿体的核酸，以及得自可存在于生物样品之上或当中的微生物或 DNA病毒或RNA病毒的核酸。核酸包括但不限于合成产物或体外转录产物。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”还可以包括核酸类似物、多核苷酸类似物 和寡核苷酸类似物。术语“核酸类似物”、“多核苷酸类似物”和“寡核苷酸类似物”可以互换 使用，在本文是指含有至少一个核苷酸类似物和/或至少一个磷酸酯类似物和/或至少一 个戊糖类似物的核酸。以下的核酸也包括在核酸类似物的定义中其中磷酸酯键和/或糖 磷酸酯键被其它类型的键置换，例如N- (2-氨基乙基)-甘氨酸酰胺和其它酰胺(参见例如 Nielsen 等人，1991，Science 254 1497-1500 ；WO 92/20702 ；美国专利号 5，719，262 ；美国 专利号5，698，685)；吗啉代(参见例如美国专利号5，698，685 ；美国专利号5，378，841 ；美 国专利号 5，185，144)；氨基甲酸酯(参见例如 Stirchak&Summerton，1987，J. Org. Chem. 52 4202)；亚甲基(甲基亚氨基)(参见例如 Vasseur 等人，I"2，J.Am· Chem. Soc. 114 4006)； 3 ‘-硫甲缩酸(thioformacetals)(参见例如 Jones 等人，1993，J. Org. Chem. 58 2983)； 磺酸酯(参见例如美国专利号5，470，967) ；2-氨基乙基甘氨酸，通常称为PNA(参见例如 Buchardt, WO 92/20702 ；Nielsen (1991) Science254 1497-1500)；以及其它键(参见例如 美国专利号 5，817，781 ；Frier&Altman, 1997，Nucl. Acids Res. 25 4429 和其中提及的参考 文献)。磷酸酯类似物包括但不限于(Dc1-C4烷基膦酸酯，例如膦酸甲酯；(ii)氨基磷酸 酯；(Iii)C1-C6烷基磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯；和(V) 二硫代磷酸酯。“STR基因座”是指含重复单元的染色体区，所述重复单元的数量在给定物种如人 的某些个体中是可变的。重复序列不一定完美重复，可以含有中断。术语“STR基因座” 包含例如通过扩增反应产生的这类染色体区的拷贝。STR基因座的实例可以包括但不限 于=THOU TPOX, CSF1P0、vWA、FGA, D3S1358、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、D8S1179、 D18S51、D21S11、D2S1338、D3S1539、D4S2368、D9S930、D10S1239、D14S118、D14S548、 D14S562、D16S490、D16S753、D17S1298、D17S1299、D19S253、D19S433、D20S481、D22S683、 HUMCSF1P0、HUMTP0X, HUMTHO1、HUMF13A01、HUMBFXIII、HUMLIP0L、HUMvWFA31。STR 标记的 多重PCR的实例可见于美国专利号7008771、6767703、6479235、6221598，每个专利均通过 引用整体结合到本文中。本领域技术人员将认识到，被配置为扩增或允许扩增以上基因座之一的序列的引物可以具有在基因座内或在基因座的任一侧杂交的序列。

本文使用的术语“C0DIS基因座”是指以FBI的“组合的DNA索引系统(Combined DNA Index System) ”命名的 STR 基因座。13 个核心 STR 基因座为 THO1、TPOX、CSFlPO、vWA、 FGA、D3S1358、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、D8S1179、D18S51 和 D21S11。(参见例如 Butler, Forensic DNA Typing, Academic Press (2001)，H 63 M ) 。 FBI ^TU 歹ijdj 白勺 13个基因座的组中添加其它的基因座。术语“扩增产物”是指扩增反应的产物，所述扩增反应包括但不限于引物延伸、聚 合酶链式反应、RNA转录等。因此，示例性的扩增产物可以包括一种或多种选自以下的产物 引物延伸产物、PCR扩增子、RNA转录产物等。本文使用的术语“扩增”是指通常以模板依赖性方式再生产至少一部分靶多核苷 酸、靶多核苷酸替代品或其组合的任何方法，包括但不限于以线性或指数方式扩增核酸序 列的广泛技术。实施扩增步骤的示例性方法包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应 (LDR)、连接继之以Q-复制酶扩增、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支链置换扩增、多 重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多重扩增、滚环扩增(RCA)等，包括多 重形式或其组合，例如但不限于 OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/ PCR、PCR/LCR(也称为组合链式反应-CCR)等。这些技术的描述除了其它地方以外还可见 于 Sambrook 等人，Molecular Cloning,第 3 版；Ausbel 等人；PCR Primer :A Laboratory Manual，Diffenbach 编辑，Cold Spring Harbor Press (1995) ；The Electronic Protocol Book, ChangBioscience (2002)，Msuih 等人，J. Clin. Micro, 34 :501_07 (1996) ；TheNucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley 编辑，Humana Press, Totowa, N. J. (2002) ；Abramson 等人，Curr Opin Biotechnol. 1993 年 2 月，4(1) :41_7 ；美国专利号 6，027，998 ；美 国专利号6，605, 451 ；Barany等人，PCT公布号WO 97/31256 ；Wenz等人，PCT公布号 W001/92579 ；Day 等人，Genomics,29(1) 152-162(1995) ；Ehrlich 等人，Science 252 1643-50(1991) ；Innis 等人，PCR Protocols :A Guide toMethods and Applications, Academic Press(1990) ；Favis φ 人，NatureBiotechnology 18:561—64(2000);禾口 Rabenau 等人，Infection 28:97-102(2000) ；LCR 试剂盒说明书(LCR Kit Instruction Manual)，目录号 #200520,修订号 #050002, Stratagene, 2002 ；Barany, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88:188-93(1991) ；Bi 和 Sambrook，Nucl. Acids Res. 25 2924-2951 (1997)； Zirvi 等人，Nucl. Acid Res. 27 :e40i_viii (1999) ；Dean 等人，Proc Natl Acad Sci USA 99 5261-66 (2002) ；Barany 禾口 Gelfand，Gene 109 1-11(1991) ；Walker 等人，Nucl. Acid Res. 20 1691-96 (1992) ；Polstra 等人，BMC Inf. Dis. 2 18-(2002) ；Lage 等人， GenomeRes. 2003 年 2 月，13 (2) 294-307 ；和 Landegren 等人，Science241 1077-80 (1988)， Demidov, V.，Expert Rev Mol. Diagn. 2002 年 11 月，2 (6) · 542-8 ；Cook 等人，J Microbiol Methods. 2003 年 5 月，53(2) 165-74 ;Schweitzer 等人，Curr Opin Biotechnol. 2001 年 2 月，12(1) 21-7 ；美国专利号5，830，711 ；美国专利号6，027，889 ；美国专利号5，686，243 ； 公开的P. C. T.申请WO 0056927A3，以及公开的P. C. T.申请WO 9803673A1。在某些实施方 案中，新形成的核酸双链体最初未被变性，但以其双链形式用于一个或多个随后步骤。在 本发明教导的某些实施方案中，可以将非常规的核苷酸碱基导入到扩增反应产物中，并通 过酶促(例如糖基化酶)和/或物理_化学方法处理产物，以便使产物不能用作随后扩增的模板。在某些实施方案中，可以将尿嘧啶作为核碱基包含在反应混合物中，由此允许随 后的反应，以通过使用尿嘧啶-N-糖基化酶清除先前含尿嘧啶的产物的遗留物(参见例如 公开的P. C. T.申请WO 9201814A2、美国专利号5，536，649和授予Andersen等人的美国临 时申请60/584，682，其中UNG清除和磷酸化在同一反应混合物中进行，所述反应混合物还 含有可热活化的连接酶)。在本发明教导的某些实施方案中，可以在扩增之前使用多种技 术中的任一种，以便促使扩增成功，例如在Radstrom等人，Mol Biotechnol. 2004年2月， 26(2) :133-46中所述。在某些实施方案中，可以整装集成的方案实现扩增，所述方案包括 样品制备和检测，例如在美国专利号6，153，425和6，649，378中所述。反向修饰酶，例如 但不限于在美国专利号5，773，258中描述的那些，也在所公开的教导的范围内。本领域 的人员将理解，可以在公开的方法和试剂盒中使用具有预期酶活性的任何蛋白。DNA聚合 酶(包括逆转录酶、尿嘧啶N-糖基化酶等)的描述除了其它地方以外还可见于Twyman， Advanced Molecular Biology, BIOSScientific Publishers, 1999 ；Enzyme Resource Guide,rev. 092298,Promega, 1998 ；Sambrook 禾口 Russell ；Sambrook 等人；Lehninger ；PCR The Basics ；和 Ausbel 等人。 “引物核酸”或“引物”是指这样的核酸其可以与靶核酸或模板核酸杂交，并允许 使用例如掺入核苷酸的生物催化剂(例如在适宜的反应条件下的聚合酶)进行链延伸或延 长。这样的条件可以包括在适宜的缓冲液(“缓冲液”包括为辅因子或影响PH、离子强度等 的替代物)中并在适宜的温度下，存在一种或多种三磷酸脱氧核糖核苷酸和掺入核苷酸的 生物催化剂。引物核酸例如可以为天然的或合成的寡核苷酸(例如单链寡脱氧核糖核苷酸
寸乂 O术语“引物组”是指在适合的条件下特异性杂交并扩增靶序列的至少一种引物。在 某些实施方案中，引物组包含至少两种引物。术语“STR特异性引物组”是指用于分析STR基因座的至少两种引物。本文使用的术语“或其组合”是指在该术语之前所列条目的所有排列和组合。例 如，“A、B、C或其组合”意在包括以下的至少一种A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且如果顺序在 特定背景下是重要的，则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。接续该实例，明确 包括含有一个或多个条目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA, CABABB，诸如此类。技术人员将理解，关于任一组合中的条目或术语的数目通常没有限制， 除非由上下文显而易见。本文使用的术语“迁移率调节物”是指在筛分或非筛分基质中赋予寡核苷酸电泳 迁移率的聚合物链，所述电泳迁移率相对于混合物中的其它聚合物链的电泳迁移率明显不 同。典型地，迁移率调节物在与所述成分杂交或结合时改变电荷/移动摩擦阻力；或者赋 予与众不同的迁移率，例如但不限于在层析分离介质中与众不同的洗脱特征或在与对应成 分杂交或结合时在筛分基质或非筛分基质中与众不同的电泳迁移率；或者二者兼有(参见 例如美国专利号5，470，705和5，514，543)。关于迁移率调节物的多个实例，参见例如美国 专利号 6，395，486,6, 358，385,6, 355，709,5, 916，426,5, 807，682,5, 777，096,5, 703，222、 5，556，7292、5，567，292、5，552，028、5，470，705，和 Barbier 等人，Current Opinion in Biotechnology, 2003,14 1 :51_57。在某些实施方案中，至少一种迁移率调节物包含至少 一条核苷酸聚合物链，包括但不限于至少一条寡核苷酸聚合物链、至少一条多核苷酸聚合物链，或者至少一条寡核苷酸聚合物链和至少一条多核苷酸聚合物链(参见例如公开的 P. C. T.申请WO 9615271A1，以及Keygene SNPWave 关于使用已知数量的核苷酸来赋予连 接产物迁移率的某些实例的产品文献)。在某些实施方案中，至少一种迁移率调节物包含至 少一条非核苷酸聚合物链。示例性的非核苷酸聚合物链包括但不限于肽、多肽、聚环氧乙烷 (PEO)等。在某些实施方案中，至少一条聚合物链包含至少一条基本不带电的水溶性链，例 如由PEO单元组成的链；多肽链；或其组合。聚合物链可以包含均聚物、随机共聚物、嵌段 共聚物或其组合。而且，聚合物链可以具有线性结构、组合结构、分支结构、树状结构(例如 含有聚酰胺胺树状聚合物的聚合物，Polysciences，Inc. Warrington，Pa.)或其组合。在某 些实施方案中，至少一条聚合物链在杂交或结合某种成分时为亲水的，或者至少足够亲水， 以确保所述成分-迁移率调节物在水性介质中易于溶解。在迁移率依赖性分析技术为电泳 时，在某些实施方案中，聚合物链是不带电的，或者所具有的电荷/亚单位密度显著低于其 对应成分。可用作迁移率调节物的聚合物链的合成至少部分取决于聚合物的性质。制备适 宜的聚合物的方法一般依据众所周知的聚合物亚单位合成方法。这些方法涉及使限定大小 的多亚单位聚合物单元彼此直接或通过带电或不带电的连接基团偶联，这些方法一般适用 于广泛的聚合物，例如聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚乳酸、聚氨酯聚合物、多肽、寡糖和核苷酸 聚合物。这些聚合物单元偶联的方法还适于合成选定长度的共聚物，例如聚环氧乙烷单元 和聚丙烯单元交替的共聚物。可以通过标准固相方法(例如Int. J. PeptideProtein Res.， 35 161-214(1990))合成选定长度和氨基酸组成的多肽，其或者为均聚物，或者为混合的 聚合物。一种方法用于制备PEO聚合物链，其具有选定数量的六环氧乙烷(HEO)单元，在一 个末端用二甲氧基三苯甲基(DMT)保护HEO单元，并在其另一个末端用甲磺酸酯活化。然 后使活化的HEO与第二个DMT保护的HEO基团反应，以形成DMT保护的HEO 二聚体。然后 连续进行此单元添加，直至获得预期的PEO链长(例如美国专利号4，914，210 ；另参见美国 专利号 5，777，096)。
三磷酸脱氧核苷酸(“dNTP”)是扩增核酸分子的结构单元，通常在标准PCR反应 中以各40-200 μ M浓度的三磷酸脱氧腺苷(“dATP”)、三磷酸脱氧鸟苷(“dGTP”)、三磷酸 脱氧胞苷(“dCTP”)和三磷酸脱氧胸苷(“dTTP”)提供。还可以使用其它dNTP(例如三磷 酸脱氧尿苷(“dUTP”))以及dNTP类似物和缀合的dNTP，其包含在本文使用的术语“dNTP” 中。尽管以这样的浓度使用dNTP符合本发明的方法，但高于200 μ M的dNTP浓度可能是有 利的。因此，在本发明方法的某些实施方案中，每种dNTP的浓度一般为至少500 μ M，并可以 达到2mM的范围。在某些进一步的实施方案中，每种dNTP的浓度可以在0. 5mM-lmM的范围 内。本文使用的术语“提供”在广义上是指提供、获得或具有某物(例如样品)，或者使 某物可获得，且不以任何方式被所提供物品的来源或供应商限制。本文使用的“样品”是指包含或推测包含目标核酸(靶核酸序列)或自身为含有 或推测含有目标靶核酸序列的核酸的任何物质。术语“样品”因此包括核酸(基因组DNA、 cDNA、RNA)、细胞、生物体、组织、体液或包括但不限于例如以下的物质的样品血浆、血清、 脑髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、粪便，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物，唾 液、血细胞、肿瘤、器官、组织、体外细胞培养成分的样品、天然分离物(例如饮用水、海水、 固体材料)、微生物标本以及已用核酸示踪分子“标记”的对象或标本。术语样品可以包括取出用于随后测试的实际样品(例如用于测试的土壤、血液或一片衣服)。尽管样品在多个 处理阶段当中可以改变(例如其取自衣服并被转移至在无菌容器中的溶液)，但样品始终 包含靶核酸序列。术语“位置(location) ”表示样品在某些时间点所定位的区域。例如，样品可以位于钝器上、转移至一片衣服、转移至土壤，然后转移至无菌管。这些当中的每一处均应当是 样品的位置。本领域技术人员将认识到，许多位置，实际上大部分非实验室相关位置，含污 染物如PCR抑制因子的可能性都很高。术语“PCR抑制因子”表示所述化合物的存在一般降低PCR扩增或核酸扩增的效 率或有效性。本领域技术人员将认识到，PCR抑制因子不需要所述化合物完全抑制所有的 扩增(这样的化合物将被表示为“完全抑制因子”)。相反地，任何量的抑制都可能是足够 的，例如 0-1 %、1-10 %、10-2020-3030-4040-50 50-6060-7070-80%、 80-90%、90-95%、95-98%、98-99%或99-100%抑制。在某些实施方案中，推测由非实验室 条件(或位置)收集的样品包含PCR抑制因子。在某些实施方案中，可以测试样品，以确定 是否存在PCR抑制因子(例如通过运行对照PCR)。在某些实施方案中，当样品的位置提示 可能存在PCR抑制因子时推定存在PCR抑制因子。在某些实施方案中，PCR抑制因子选自 以下的至少一种腐殖酸、胆盐、其它盐、复合多糖、胶原、亚铁血红素、黑色素、真黑素、肌红 蛋白、多糖、蛋白酶、钙离子、尿素、血色素、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、靛青染料、血色素、棕黄 酸、二价阳离子、螯合分子、酶，以及蛋白、腐殖酸、复合多糖、EDTA、EGTA、DNA酶和胶原。术语“标准稳定性引物”表示引物是标准核酸序列引物。所述引物可以包含核酸， 例如A、T、G、C或U。该术语在本文一般用于和对等的高稳定性引物相比较。在提及标准稳定性引物和高稳定性引物时使用的术语“对等(的)(comparable)，， 表示除了所指出的一个或多个差异以外，所述序列是相同的(例如高稳定性引物包含一个 或多个核酸类似物，所述类似物是对标准稳定性引物中的核酸的对等置换)。当第一个和第 二个核酸具有相同的或相似的碱基配对选择特性时(例如二者的碱基配对均为A碱基配对 T、G和C，或者二者的碱基配对均为C碱基配对A、T或G)，核酸置换是“对等的”。术语“高稳定性引物”表示引物包含至少一种高稳定性核酸类似物。本领域技术 人员将认识到，在某些实施方案中，高稳定性引物可退火，以便允许STR(例如CODIS序列之 一)扩增。术语“高稳定性核酸类似物”表示所述核酸是一种核酸类似物，所述核酸在与第一 个天然核酸碱基配对时比在相同的环境条件下应结合同样的第一种核酸的对等的第二种 天然核酸更强烈地结合。在某些实施方案中，这意味着在相同环境条件(例如PCR条件) 下高稳定性核酸类似物具有比天然核酸高的Tm。在某些实施方案中，高稳定性核酸类似物 可以为PNA、LNA、2' -0-甲基核酸、2' _0_烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯键 的核酸或其任意组合。当高稳定性核酸类似物与第二种天然核酸均具有相同或相似的碱基 配对选择特性时(例如它们两个对A的碱基配对超过T、G和C，或者它们两个对C的碱基 配对超过A、T或G)，它们是对等的。碱基配对作用的相对强度可以多种方式确定，例如计 算机建模、本领域技术人员的标准知识或通过碱基配对分子的熔点分析。在某些实施方案 中，这可以通过制备两种引物来检验，第一种引物具有可能的高稳定性核酸类似物(例如 ATC (LNA G)GC)和对等的标准稳定性引物(例如ATCGGC)，并将两种引物的熔点与同一互补序列对比(例如TAGCCG)。本文使用的“靶核酸序列”是指被复制、扩增和/或检测的核酸区域。在某些实施方案中，“靶核酸序列”或“模板核酸序列”处于用于扩增的两个引物序列之间。本领域技术 人员会认识到，靶核酸可以来自通过表征靶核酸序列被鉴定或匹配的个体或小组。这样的 个体可被称为“目标个体”。在某些实施方案中，目标个体是已知的。在某些实施方案中，目 标个体是未知的。在本申请中，一个序列与另一个序列相同或互补的陈述包括以下情况其中两个 序列彼此完全相同或互补，以及其中一个序列的仅一部分与另一个序列的一部分或完全相 同或互补。在此情况下，术语“序列”包括但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探针、弓丨 物、引物特异性部分和靶特异性部分。在本申请中，一个序列与另一个序列互补的陈述包括以下情况其中两个序列具 有错配。在此情况下，术语“序列”包括但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探针、引物、 引物特异性部分和靶特异性部分。尽管存在这些错配，但两个序列在适宜的条件下彼此应 选择性杂交。在本申请中，一个序列与另一个序列杂交或结合的陈述包括以下实施方案其中 两个序列的全部彼此杂交或结合，以及其中一个或两个序列的仅一部分与完整的另一个序 列或与另一个序列的一部分杂交或结合。
示例性的实施方案现在将提到多个非限制性的示例实施方案。要理解的是，这些实施方案无意限制 本发明的教导。相反，本发明的教导意在涵盖替代、修改和等同方案，本领域技术人员将意 识到这一点。图1是用于扩增样品的靶核酸序列的方法的一个实施方案的流程图，所述样品含 有(或怀疑含有)至少一种核酸扩增抑制因子。在某些实施方案中，这涉及提供包含至少 一种靶核酸序列和核酸扩增抑制因子的样品10。接着，将至少一种高稳定性引物与靶核酸 序列混合20。高稳定性引物可以包含至少一种高稳定性核酸类似物。在此之后，对样品实 施扩增反应30。本领域技术人员将认识到，人们不需要添加或肯定地知晓扩增抑制因子存 在于样品中。如上所示，样品可以为包含或推测包含目标核酸(靶核酸序列)或其自身为包含 或推测包含目标靶核酸序列的核酸的任何物质。在某些实施方案中，所述样品包含核酸 (基因组DNA、cDNA、RNA)、细胞、生物体、组织、流体或包括但不限于以下的物质例如血浆、 血清、脑髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、粪便，皮肤呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物， 唾液、血细胞、肿瘤、器官、组织、体外细胞培养成分的样品、天然分离物(例如饮用水、海 水、固体材料)、微生物标本以及已用核酸示踪分子“标记”的对象或标本，或其任意组合。包含靶核酸序列的样品可以包含来自任何来源的生物材料。所述样品可以由广泛 来源中的任一种提供，且不需要直接由核酸的原始生物来源提供。在某些实施方案中，样品 可以来自据信或推定被抑制核酸扩增的组分污染的位置。在某些实施方案中，包含靶核酸 序列的样品可以为得自例如犯罪现场或含有人或动物残留物的位置(例如考古场所或事 故地点)的生物材料。在某些实施方案中，由样品提取核酸。参见例如Butler，ForensicDNA Typing,在28-32页。在某些实施方案中，包括核酸在内的样品可被降解或以少量存在。 在某些实施方案中，所述样品可以包含至少来自个体的靶核酸序列。在某些实施方案中，样品的位置可以为(或在一个点可能已经为)室内环境。室内 环境例如可以在居民住地、房屋、公寓、住宅单元、旅馆、汽车旅馆、政府办公室、杂货店、便 利店、办公室、办公楼、医院、诊所、教堂、饭馆、大型购物中心、学校、学院、大学、宿舍、监狱、 拘留所、车库或图书馆之内。在某些实施方案中，样品可以来自交通工具之内，例如小汽车、 飞机、火车、公共汽车、运货车、救护车、警车、消防车或出租车。在其它实施方案中，样品可 以来自户外环境。户外环境可以为例如公园、庭院、森林、树林、街道、高速公路、校园、大学 校园、办公室复合地面、营地、跑道、登山道、广场或停车场。在某些实施方案中，样品可以来 自一片水域，例如湖、池塘、海洋、河流、小溪、湿地、水池或浴盆。本领域技术人员将认识到， 样品可以直接接触任一种以上位置以及其它位置的多个表面。 在某些实施方案中，样品可包括至少一部分衣服，例如牛仔裤、裤子、毛线衫、衬 衫、内衣、裙子、女外套、围巾、运动鞋、鞋、靴子、制服、手套、连指手套、短袜、长袜、夹克或外 套。在某些实施方案中，样品可包括至少一部分附属物，例如眼镜、珠宝、手袋、假发或钱包。 在某些实施方案中，样品可包括至少一部分家具。所述家具可以为例如桌子、椅子、车辆座 椅、床、婴儿床、床头板、凳子、计算器、厨房用具或灯。在某些实施方案中，样品可包括纤维。 纤维可包括例如粗斜纹棉布、帆布、丝绸、棉布、人造纤维、毛织品、毛皮、皮革、绒面革、塑料 或合成纤维。在某些实施方案中，样品可包括纸、家具、木材、竹子、塑料、金属、玻璃、陶瓷、 石膏或涂料。在某些实施方案中，样品可包括至少一部分室内装饰品、浴帘、窗帘、遮光物 (shade)、百叶窗(blind)、地毡、地毯、床单、枕套、床罩或毛毯。本领域技术人员将认识到， 样品可以包括的以上物质还可以被表征为靶核酸序列或样品在其上存留一定时间的位置。 本领域技术人员将认识到，样品或靶核酸序列可以直接接触以上物质。在某些实施方案中，样品包含(或推定包含)核酸和核酸扩增抑制因子。核酸包 含靶核酸序列。在某些实施方案中，靶核酸序列可以包含核酸、核酸类似物、多核苷酸类似 物和寡核苷酸类似物。在某些实施方案中，靶核酸序列可以包含天然DNA。在某些实施方案 中，靶核酸序列可以包含至少一个短串联重复序列(STR)。用于本发明的靶核酸序列可来源于任何活的或曾经是活的生物体，包括但不限于 原核生物、真核生物、植物、动物和病毒。靶核酸序列可以起源于细胞核，例如基因组DNA，或 者可以为核外核酸，例如质粒、线粒体核酸、多种RNA等。如果靶核酸为RNA，则靶核酸序列 可以首先被逆转录为cDNA。此外，靶核酸序列可以双链形式或单链形式存在。核酸扩增抑制因子可以为例如PCR抑制因子或能够损伤核酸的化合物或材料。实 例包括但不限于腐殖酸、胆盐、其它盐、复合多糖、胶原、亚铁血红素、黑色素、真黑素、肌红 蛋白、多糖、蛋白酶、钙离子、尿素、血色素、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、靛青染料、血色素、棕黄 酸、二价阳离子、螯合分子、酶、蛋白、复合多糖、EDTA、EGTA、DNA酶和胶原。在某些实施方案中，核酸扩增抑制因子可以为样品中的污染物。在某些实施方案 中，核酸扩增抑制因子可以处于环境中。样品中可以存在一种或多种核酸扩增抑制因子。在 某些实施方案中，样品包含至少一种核酸扩增抑制因子。在某些实施方案中，样品包含至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 种核酸扩增抑制因子。在某些实施方案中，核酸扩增抑制因子可以为可能并不总是用作抑制因子但能够在某些情况下(例如于某些浓度)抑制核酸扩增的物质。例如，诸如MgCl2的盐在某些浓 度不能抑制核酸扩增，但其于较高浓度可以用作抑制因子。本领域技术人员将认识到，在这 些情况下，所述物质在实际核酸扩增条件下如果以足以至少部分抑制扩增的水平存在，则 将仅被认为是“核酸抑制因子”。在以下的实施例章节提供测定样品中的核酸扩增抑制因子 的存在情况的方法。在某些实施方案中，可以鉴定样品中的核酸抑制因子。在其它实施方 案中，不需要鉴定样品中的核酸抑制因子。在某些实施方案中，核酸抑制因子仅用作抑制因 子或者根本不具有功能(由此排除以上讨论的组分，如MgCl2)。在某些实施方案中，核酸扩 增抑制因子是环境条件，例如温度。在某些实施方案中，条件(例如温度)被排除了作为核 酸扩增抑制因子的可能性。
在某些实施方案中，实施目前公开的一些技术的人士决定样品所处的其中一个位 置提示扩增抑制因子的可能性。在作出此决定后，他们随后应用所公开方法的其余部分，该 部分涉及高稳定性引物。在某些实施方案中，所述方法可以包含至少一种高稳定性引物。在其它实施方案 中，所述方法可以包含至少两种高稳定性引物。在某些实施方案中，所述方法可以包含至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 种或更多种以上的高稳定性引物，每 种高稳定性引物均具有不同的序列，并扩增不同的基因座。在某些实施方案中，高稳定性引物包含至少一种高稳定性核酸类似物。在某些实 施方案中，高稳定性引物包含至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个或更多的高稳定性核酸类似物。在某些实施方案中，高稳定性核酸类似物为PNA、LNA、 2' -0-甲基核酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯键的核酸或其任意 组合。在某些实施方案中，高稳定性引物中至少的核酸为核酸类似物，例如高稳定性 引物中 1-5 %,5-10 %、10-15 %、15-20 20-25 25-30 30-35 35-40 40-50 %、 50-60%,60-70%,70-80%,80-90%,90-100%的核酸为核酸类似物。在某些实施方案中， 核酸类似物位于引物的5'末端。在某些实施方案中，核酸类似物位于引物的3'末端。在 某些实施方案中，核酸类似物位于引物的中心。在某些实施方案中，核酸类似物均勻地分布 于整个引物中。在某些实施方案中，核酸类似物在序列中彼此相邻。在某些实施方案中，核 酸类似物被天然核酸分隔。在某些实施方案中，在单个引物中使用不同类型的核酸类似物 (例如LNA和PNA)。在某些实施方案中，所有的核酸类似物都是相同类型，但不必是相同核 酸(例如A与G类似物形式)。在某些实施方案中，多种高稳定性引物使用不同的核酸类似 物。在某些实施方案中，在单个反应中使用多个高稳定性引物，多个高稳定性引物尽管结合 相同的靶核酸序列，但包含不同的核酸类似物。在某些实施方案中，结合能力的这种重叠可 以抵消多种不同PCR抑制因子的存在。在某些实施方案中，高稳定性引物可以具有比第二种引物(例如标准稳定性引 物)高的熔点温度，所述第二种引物与高稳定性引物几乎相同，只是第二种引物由天然核 酸组成，由此没有高稳定性核酸类似物。在某些实施方案中，高稳定性引物可以具有比第二 种引物高的熔点温度，所述第二种引物与高稳定性引物几乎相同，只是第二种引物在不同 的位置包含至少一种高稳定性核酸类似物。本领域技术人员将认识到，以上“高稳定性引物”和“标准稳定性引物”的比较常常 将高稳定性引物表征为具有至少一个被核酸类似物“置换的”核酸。这仅是为了简化描述，不需要为了使引物被叫做“高稳定性引物”而在其首次使用前实际地物理“置换”核酸。也 就是说，如何设计或实际产生引物不改变其是否为高稳定性引物。本文描述的方法不需要 用核酸类似物置换标准稳定性引物的实际步骤。换句话说，可以在不涉及标准稳定性引物 的任何中间步骤的情况下制备高稳定性引物。本文使用的“置换”或“取代”表述仅是为了 便利以及与标准稳定性引物比较的目的。在某些实施方案中，高稳定性弓I物还包含迁移率调节物。迁移率调节物是本领域 已知的，在上文更详细地描述。在某些实施方案中，迁移率调节物可以为聚环氧乙烷、聚乙 醇酸、聚乳酸、多肽、寡糖、聚氨酯、聚酰胺、聚磺酰胺、聚亚砜、聚膦酸酯或其嵌段共聚物。如 上所述，迁移率调节物允许每种引物的迁移率被任意确定，与寡核苷酸的长度或序列无关。高稳定性引物可以与靶核酸序列特异性杂交。在某些实施方案中，高稳定性引物 以允许短串联重复序列扩增的方式与靶核酸序列杂交。在某些实施方案中，标准稳定性引 物(高稳定性引物基于其或与其对等)可以来自STR特异性引物组(例如将结合或允许 STR扩增的引物或引物组)。在某些实施方案中，引物可以得自CODIS特异性引物组。在某 些实施方案中，所述引物可以为含珐琅蛋白LNATM的寡核苷酸。 在某些实施方案中，可以用高稳定性引物扩增广泛的核酸序列。在某些实施方案 中，可以扩增来自至少一个基因座的核酸序列。在某些实施方案中，可以扩增来自至少一个 STR基因座的核酸序列。在某些实施方案中，所述扩增可以扩增例如以下的基因座的核酸序 列珐琅蛋白、THOU TPOX, CSF1P0、vWA、FGA、D3S1358、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、 D8S1179、D18S51、D21S11、D2S1338、D3S1539、D4S2368、D9S930、D10S1239、D14S118、 D14S548、D14S562、D16S490、D16S753、D17S1298、D17S1299、D19S253、D19S433、D20S481、 D22S683、HUMCSF1P0、HUMTPOX、HUMTHO1、HUMF13A01、HUMBFXI11、HUMLIPOL、HUMvffFA31 或其 任意组合。在某些实施方案中，扩增珐琅蛋白序列。在某些实施方案中，以一个反应扩增1个以上的基因座。在某些实施方案中，共扩 增 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 个或更多的基因座。在使用多 重共扩增的某些实施方案中，不是所有的引物对都包含高稳定性引物。在扩增后，可以通过本领域已知的众多方法中的任一种分析、解析和/或表征PCR 反应的产物。例如，可以通过变性样品并使用凝胶电泳或毛细管电泳方案分离来分析PCR 反应。该分析的结果随后可使人们确定存在的STR序列的重复数。核酸扩增和杂交程序是本领域已知的。在某些实施方案中，扩增可以经PCR实现。 例如，在Applied Biosystems AmpF/STR SEfiler PCR扩增试剂盒用户说明书中提 供了 PCR扩增方案，该说明书通过引用整体结合到本文中。图2是用于扩增样品中的靶核酸序列的方法的一些实施方案的流程图，所述样品 包含至少一种核酸扩增抑制因子。在某些实施方案中，这包括提供一种样品，其中所述样品 处于被认为被可抑制核酸扩增的组分污染的位置，其中所述样品至少包含个体的靶核酸序 列 100。接着，使用至少一种高稳定性引物扩增个体的靶核酸序列，其中所述高稳定性引 物包含至少一种高稳定性核酸类似物，其中所述引物可以由至少一个基因座扩增序列，所 述基因座选自以下的至少一个CSF1P0、FGA、THOl、TPOX, vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、 D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433、D2S1338 或其某些组合，其中所述引物还包含迁移率调节物110。在此之后，表征扩增的靶核酸序列，由此鉴定扩增的靶核酸序列120。在某些实施方案中，通过确定在至少一个且优选一个以上的针对扩增产物的以上基因座中存在的STR 数量实现表征。图3A是用于扩增样品中的靶核酸序列的方法的一些实施方案的流程图，所述样 品包含至少一种核酸扩增抑制因子。在某些实施方案中，这包括提供含有靶核酸序列的样 品，其中所述靶核酸序列包含可用于鉴定靶核酸序列来源(例如目标个体)的短串联重复 序列200。接着，将至少一种高稳定性引物与靶核酸序列混合210。高稳定性引物包含至 少一种高稳定性核酸类似物，并以允许短串联重复序列扩增的方式与靶核酸序列特异性杂 交。在此之后，对样品实施扩增反应，由此通过高稳定性引物扩增靶核酸序列220。在某些 实施方案中，高稳定性核酸类似物的位置不在高稳定性引物的3'末端。在某些实施方案 中，高稳定性核酸类似物在高稳定性引物的3'末端不是最后一个核酸。在某些实施方案中，不需要存在乃至怀疑存在PCR抑制因子。在某些实施方案中， 无论何时要扩增法医样品使用高稳定性引物都可能是有用的。一个这样的实施方案示于图 3B。人们可以首先提供怀疑含有靶核酸序列的法医样品300。法医样品不需要由实施本发 明技术的人收集。在某些实施方案中，将所述样品清洁至一定程度。在某些实施方案中，处 理法医样品，以便将靶核酸置于用于随后扩增的溶液或缓冲液中。在某些实施方案中，处理 样品，以便由样品中可能存在的细胞或细胞组分中释放靶核酸。本领域技术人员将认识到， 尽管可能需要某些收集和/或纯化，但样品不一定是100%没有污染物或PCR抑制因子。在 某些实施方案中，留下PCR抑制因子与靶核酸序列混合。在此之后，人们接着可以将至少一种高稳定性引物与靶核酸序列混合，其中高稳 定性引物以允许靶核酸序列扩增的方式与靶核酸序列特异性杂交，如在步骤310中所示。 在此之后，人们可以实施扩增步骤，以通过高稳定性引物扩增靶核酸序列，如在步骤320 中所示。本领域技术人员将认识到，有多种可以使用的扩增技术，例如PCR、定量PCR或 TAQMAN PCR。最后任选地，人们可以表征扩增的靶核酸序列，然后将该特征与个体 的(例如嫌疑犯)谱系比较，如步骤330所示。在其中短串联重复序列(STR)被扩增和表 征的实施方案中，可以将样品中的STR的多个特征与个体的多个STR比较，以确定是否存在 匹配。本领域技术人员将认识到，在某些实施方案中，本文描述的关于其它实施方案的其它 选择也可应用于该方法。本领域技术人员将认识到，法医样品可以包含众多的不同物质，例如唾液、血液、 阴道液体、精液、血浆、血清、脑髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液和粪便。在某些实施方案中， 法医样品包含选自以下器官的外分泌物皮肤、嘴、肺、鼻、眼、耳、脐、消化道、泌尿生殖道及 其任意组合。在某些实施方案中，样品包括来自动物的靶核酸序列。在某些实施方案中，所 述动物为人。在某些实施方案中，法医样品是可用于解决法制体系感兴趣的问题的样品；但是， 其不一定在所有的实施方案中都被限于此。例如，在某些实施方案中，法医样品是某些人期 望鉴定或表征的样品。鉴定或表征可针对已知或未知的来源(例如候选目标个体)。在某 些实施方案中，法医样品是人们期望鉴定来源的样品。在某些实施方案中，STR可以包含在靶核酸序列中；然而，不需要在所有的实施方案中都存在STR。例如，在某些实施方案中，可用于法医分析的任何核酸序列都可以是靶核 酸序列。在某些实施方案中，靶核酸序列允许人们确定在一个位置和个体发现的物质(例 如组织样品、血液等)的来源。在某些实施方案中，其允许人们对作为所述物质的可能来源 中排除某一个体。在某些实施方案中，靶核酸序列允许人们确定靶核酸序列的初始来源是男性还是女性(例如其为性别特异性标记)。这可以多种方式实现，例如通过确定所述个体是具有两 个X染色体还是具有X和Y染色体。在某些实施方案中，这种区别可通过观察与X或Y染 色体相关的特异性序列差异来确定。在某些实施方案中，这可通过检验靶核酸序列在一个 染色体上比在另一个染色体上长来实现。例如，通过分析(和初始扩增)珐琅蛋白(对于 X染色体，其在内含子1中具有6个碱基的缺失)，人们可以确定所述样品是仅包含X染色 体还是包含X和Y染色体这二者。因此，在某些实施方案中，所述方法可用于扩增性别特异 性标记。在某些实施方案中，基因座的初始序列、标准稳定性引物的初始序列(其可容 易地如本文所述修饰)及其扩增方法和随后的结果分析可见于美国专利号7，008，771、 6，767，703,6, 479，235和6，221，598，所述专利通过引用整体结合到本文中。在某些实施方案中，由扩增和分析或表征样品中的靶核酸序列获得的信息可用于 多种用途，例如遗传作图、连锁分析、临床诊断或鉴定试验。在某些实施方案中，所述信息可 用于鉴别核酸的来源或缩窄核酸的可能来源。在某些这样的实施方案中，所述信息可用于 例如法医学鉴定、生父鉴定试验、DNA谱分析和相关应用。可以对含有核酸的任何样品，例如骨、毛发、血液、组织等，实施个人身分鉴别测 试。可以由样品提取DNA，然后用包含扩增一组微卫星的高稳定性引物的引物组在抑制因子 存在下扩增DNA，从而产生一组扩增的片段。在法医检验中，例如，可以将样品的微卫星扩 增模式与推定受害者的已知样品(推测的匹配来源)比较，或者可以与来源于推定受害者 的家族成员(例如母亲和父亲)的扩增微卫星的模式比较，其中使用高稳定性引物扩增同 一组微卫星。微卫星扩增模式可用于证实或排除受害者的身份。在生父鉴定试验中，例如， 样品一般来源于儿童，与推定父亲的微卫星模式进行比较，并可以包含与儿童母亲的微卫 星模式匹配。微卫星扩增模式可用于证实或排除父亲的身份。以下名单可以包含G+C含量 为 50%或以下的微卫星例如 D3S1358 ；vffA ；D16S539 ；D8S1179 ；D21S11 ；D18S51 ；D19S433 ； THOl ；FGA ；D7S820 ；D13S317 ；D5S818 ；CSFlPO ；TPOX ；次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶；肠脂肪 酸结合蛋白；识别抗原/表面抗原；CFS-I受体的c-fms原癌基因；酪氨酸羟化酶；胰腺磷脂 酶A-2 ；凝血因子XIII ；细胞色素芳香化酶P-450 ；脂蛋白脂肪酶；c-fes/fps原癌基因；和 未知的片段。所述产物可通过例如毛细管电泳配合GeneScan 310分析检验。在某些实施方案中，提供用于PCR反应的试剂盒。所述试剂盒包括三磷酸脱氧核 苷酸；含有至少一种高稳定性核酸类似物的高稳定性引物；和DNA聚合酶。上文详细描述了适于所述试剂盒的高稳定性引物。在某些实施方案中，所述试剂 盒可以包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 种或更多的高稳定 性引物。在某些实施方案中，可以存在至少两种引物作为引物混合物。在某些实施方案中， 引物混合物包含约δρπιο /μ L至50ρπιΟ1/μ 1的每种引物。在某些实施方案中，引物混合 物包含约10、15、20、25或30pmol/yL的每种引物。在某些实施方案中，所述试剂盒包含STR-特异性引物组的至少一种引物。在某些实施方案中，所述试剂盒包含STR-特异性引物组。在某些实施方案中，所述试剂盒还含有荧光标记的引物。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含装有等位基因分型标准物的容器，所 述等位基因分型标准物对应于适于同短串联重复序列分析比较的大小。等位基因分型标准 物可用于分析STR。在某些实施方案中，所述试剂盒可以包含等位基因分型标准物混合物。 在某些实施方案中，等位基因分型标准物混合物可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16个或更多个以上的STR基因座的等位基因分型标准物。在某些实施方案中，所 述等位基因分型标准物可以为荧光标记的等位基因分型标准物。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含DNA聚合酶。DNA聚合酶可以为 热稳定的。在本发明方法的某些实施方案中，扩增包括使所述靶核酸与具有聚合酶活 性的酶接触。例如，具有聚合酶活性的酶可以选自以下的至少一种来自水生栖热菌 (Thermusaquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、其它栖热菌(Thermus)属、芽 ？包杆菌属、热球菌(Thermococcus)属、栖热袍菌(Thermotoga)属和火球菌(Pyrococcus) 属的DNA聚合酶。例如，合适的聚合酶包括AmpliTaqGold DNA聚合酶；AmpliTaq DNA 聚合酶；AmpliTaq DNA聚合酶；Stoffel片段；rTth DNA聚合酶；rTth DNA聚合酶XL ； 来自脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的Bst DNA聚合酶大片段；来自 Thermococcus litoralis 的 Vent 禾口 Vent Exo ；来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima) 的Tma ；来自火球菌(Pyrococcus)的DeepVent禾口 De印Vent Exo-以及Pfu ；及其突变体、 变体和衍生物。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含MgCl2。在某些实施方案中，试剂盒所 提供的MgCl2可以10mM、15mM、20mM或25mM的浓度存在。在某些实施方案中，所述试剂盒 包含叠氮化钠。在某些实施方案中，所述试剂盒包含含有MgCl2& 10X缓冲溶液。在某些 实施方案中，所述试剂盒包含BSA。在某些实施方案中，所述试剂盒包含dNTP混合物。在某 些实施方案中，dNTP混合物可以包含25mM的每种核苷酸。在本发明的某些实施方案中，使 用至少0. 5mM的每种dNTP。在其它实施方案中，使用至少ImM dNTP。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一种对照样品。在某些实施方案 中，所述试剂盒可以包含阳性对照、阴性对照、提取空白对照或其任意组合。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含迁移率调节物。所述迁移率调节物可 以为聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚乳酸、多肽、寡糖、聚氨酯、聚酰胺、聚磺酰胺、聚亚砜、聚膦酸 酯及其嵌段共聚物。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含说明书。在某些实施方案中，所述说明 书可以描述如何鉴定样品中一种或多种靶核酸的存在情况。在某些实施方案中，所述说明 书可以描述如何鉴别样品中STR基因座的存在情况。在某些实施方案中，所述说明书可以 描述如何鉴别样品中C0DIS基因座的存在情况。标准稳定件引物和高稳定件弓I物的诜择本领域技术人员将认识到，一种确定本文所述的高稳定性引物的可能序列的方法 是以允许扩增目标基因座(例如包含STR的基因座)的标准稳定性引物开始，并如本文所 述对其置换(permutation)。在许多实施方案中，这可容易地如下实现采用在STR分析、 更具体地说是C0DIS分析中使用的已知的或公开的引物序列，并使用它们作为初始启动模
21板。或者，可以通过采用来自任一种目前公开的基因座(或其它STR相关的目标基因座) 的引物大小的核酸序列，并测试每个引物大小的部分，确定其它的高稳定性引物序列。可将 多种不同的核酸类似物插入候选的高稳定性引物的每个位置中，并测试所产生引物的Tm。 那些Tm增加的候选高稳定性引物将是高稳定性引物。围绕着每个基因座的每个序列都可 用于产生众多高稳定性引物。用于目前公开的STR和C0DIS基因座的所有可能的标准稳定 性引物均可以容易地由本领域技术人员确定(例如以基因座中的第一个核酸开始，包含适 宜长度的引物的一部分核酸(例如5-30个核酸)，以产生第一个标准稳定性引物。人们可 以将一个核酸位置沿着序列向下移动到一个新的核酸位置(其可以与先前的引物序列重 叠)，人们希望得到多少种引物就重复该过程多少次。在某些实施方案中，应小心选择在多重反应中使用的引物序列。不适宜的引物选 择可能产生几种不需要的作用，例如没有扩增、在多个位点扩增、引物二聚体形成、来自不 同基因座的引物序列的不需要的相互作用、产生与另一个基因座的等位基因重叠的一个基 因座的等位基因，或者不同的基因座需要在多重反应中不相容的扩增条件或方案。可以按 照以下的选择方法选择标准稳定性引物。在某些实施方案中，如下开发和选择用于多重系统的引物使用反复的选择引物 序列的过程，将用于共扩增选定基因座的引物混合，共扩增基因座，然后分离和检测扩增产 物。最初，该过程经常以不平衡的方式产生扩增的等位基因(即某些基因座的产率高于其 它基因座)，且还可以产生不代表等位基因自身的扩增产物。为由多重系统消除这样的额外片段，将全部组的各个引物与相同或其它基因座的 引物一起使用，以鉴定哪种引物有助于额外片段的扩增。一旦鉴定出产生一种或多种片段 的两种引物，就以单独的一对或以多重系统(或多重系统的亚组)修饰和再检验一种或两 种引物。重复该过程，直至产物评价在多重系统中产生扩增的等位基因，且无或具有可接受 水平的额外扩增产物。有时候，可通过标记引物对中的相反引物消除额外的扩增产物。这种改变揭示了 检测步骤中相反引物的产物。这种新标记的引物可以比先前标记的引物高的保真度扩增真 正的等位基因，产生的真正的等位基因在总扩增产物中的比例更大。引物浓度的测定可以在最终的引物序列选择之前或之后进行，但优选在该选择之 后进行。一般来说，增加任何具体基因座的引物浓度增加了针对该基因座产生的产物量。但 是，这也是一个重复过程，因为针对一个基因座增加得率可能降低一个或多个其它基因座 的得率。而且，引物可以相互作用，直接影响其它基因座的得率。引物浓度的线性增加不一 定使对应基因座的产物得率产生线性增加。基因座对基因座的平衡也可能受到扩增方案的众多参数的影响，例如使用的模板 量、扩增循环次数、热循环方案的退火温度以及在循环过程结束时包含或排除额外的延伸 步骤。一般不能在所有等位基因和基因座之间实现绝对均衡的平衡，也不需要产生有用的 等位基因信息。多重系统开发的过程在另一个意义上也可能是重复过程。也就是说，首先有可能 针对少量基因座开发多重系统，该系统没有或几乎没有来自扩增的额外片段。该系统的引 物可以与一个或多个其它基因座的引物组合。这种扩增的引物组合可以由扩增产生或不产 生额外的片段。从而可以导入和评价新的引物。
重复上述的一次或多次反复选择操作，直至鉴定出完整的引物组，其可用于共扩 增本文所述的对于共扩增选定的基因座。要理解的是，可开发许多不同的引物组，以扩增特 定的基因座组。可以使用本领域技术人员已知的用于寡核苷酸合成的任何标准程序进行标准杂 交引物的合成。本领域技术人员将认识到，可以修改以上用于测定标准稳定性引物的方法，以通 过使用包含高稳定性核酸类似物的引物，并以相似的方式在它们之间选择，确定高稳定性 引物。当然，也可以检验候选的高稳定性引物的最终Tm。DNA样品的制备可以使用与DNA扩增相适的任何DNA制备方法，制备本发明方法使用的样品。许 多这样的方法是本领域技术人员已知的。实例包括但不限于通过苯酚提取(Sambrook， J.等人(1989)MolecularCloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y.，9. 14-9. 19 页)进行 DNA 纯化，以及通过盐 沉淀(Miller, S.等人(1988)Nucl. Acids Res. 16 1215)或 chelex(Walsh 等人，(1991) BioTechniques 10:506 513，Comey 等人，(1994) Forensic Sci. 39 1254)进行部分纯 化，以及使用未处理的血液释放未纯化的物质(Burckhardt，J. (1994)PCR Methods and Applications 3 =239243,McCabe,Edward R. B. ， (1991)PCR Methods and Applications 1 99106, Nordvag,Bjorn-Yngvar (1992)BioTechniques 12 =4490-492 M)。当要使用本发明的方法分析的至少一种样品包含人基因组DNA时，所述DNA可以 由选自以下的组织制备血液、精液、阴道细胞、毛发、唾液、尿液、骨、口腔样品、含有胎盘细 胞或胎儿细胞的羊水、绒膜绒毛及以上列出的任何组织的混合物。任选地，可以在用于本发明方法之前使用本领域技术人员已知的任何标准DNA定 量检测DNA浓度。在这样的情况下，可以通过如Sambrook，J.等人(1989)，出处同上，附 录E. 5所述的分光光度检测法，或使用检测技术如Brunk C. F.等人(1979)，Anal Biochem 92 :497500所述的用荧光法测定DNA浓度。可以如Waye，J. S.等人(1991)“Sensitive and specific quantification of human genomic deoxyribonucleicacid(DNA)in forensic science specimens :casework examples, ”J. Forensic Sci. , 36 :11981203 所述，通过比较 DNA标准品与人特异性探针的杂交量，检测DNA浓度。在扩增反应中使用太多的模板DNA可 以产生假象，其表现为不代表真正等位基因的额外条带。在某些实施方案中，可以使用定量 技术如TA0MAN pCR。在某些实施方案中，可以使用任一种上文讨论的扩增技术。在 某些实施方案中，使用实时PCR分析。在某些实施方案中，使用SYBR Green染料。在某些 实施方案中，使用5'核酸酶方法。本领域技术人员将认识到，在某些实施方案中，使用高稳定性引物可以允许去除 以上的一些步骤，因为样品的纯化可能不太关键。在多重扩增中的DNA扩增制备出样品后，就以多重扩增步骤共扩增目标基因座。可以使用众多不同的扩 增方法中的任一种扩增基因座，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR) (Saiki, R.K.等人 (1985)，Science 230 13501354)、基于转录的扩增(Kwoh, D. Y.和 Kwoh，T.J. (1990)， AmericanBiotechnology Laboratory, October,1990)禾口 链置换扩 ±曾(SDA)(Walker, G.T.等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. A. 89 =392396) 在某些实施方案中，使用对所 述组中的每个基因座特异性的高稳定性引物对对DNA样品进行PCR扩增。
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在某些实施方案中，针对每个基因座的至少一种高稳定性引物可以共价连接染料 标记，更优选地连接荧光染料标记。可以针对多重扩增反应选择高稳定性引物和与其连接 的染料，使得在优选通过凝胶电泳或毛细管电泳分离等位基因时，用一种颜色标记的每个 基因座的引物扩增的等位基因与其中使用相同颜色标记的高稳定性引物共扩增的组中的 另一基因座的等位基因不重叠。在某些实施方案中，针对在多重反应中共扩增的每个基因座的至少一种高稳定性 引物在用于所述反应前用荧光标记来标记。适于连接用于本发明的引物的荧光标记可商 购。参见例如PEBiosystems和Molecular Probes的荧光素和羧基-四甲基罗丹明标记以 及它们的化学衍生物。在某些实施方案中，使用至少3个不同标记来标记在多重扩增反应 中使用的不同高稳定性引物。当包含大小标记来评价多重反应时，用于制备大小标记的引 物可以用与用于扩增反应中的目标基因座的引物不同的标记来标记。在某些实施方案中，所用的基因座特异性高稳定性引物的序列包括众多核苷酸， 其在用于杂交的条件下，足以与要扩增的基因座的等位基因杂交，并基本上没有其它基因 座的等位基因的扩增。参考授予Simons的美国专利号5，192，659，该专利关于基因座特异 性引物的更详细描述的教导通过引用结合到本文中。DNA片段的分离和检测一旦由多重扩增步骤产生一组扩增的等位基因，就评价扩增的等位基因。该方法 的评价步骤可以通过众多不同方法中的任一种来完成，其中一些方法在下文描述。电泳可用于分离多重扩增反应的产物，毛细管电泳(参见例如Buel，Eric等人 (1998), Journal of Forensic Sciences ;43 (1) 164-170 页)或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (参见例如 Sambrook，J.等人(1989)，载于 Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Press，13. 45-13. 57 页)也可以。适用于所述方法 的评价步骤的凝胶制备以及电泳步骤和条件在以下的实施例中阐述。以变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳和毛细管电泳分离DNA片段主要基于片段大小进行，但可以通过使用迁移率调节物 来调节。一旦分离出扩增的等位基因，随后就可以显现和分析在凝胶或毛细管中的等位基 因和任何其它DNA (例如DNA大小标记或等位基因分型标准物)。在凝胶中显现DNA可以使 用众多技术中的任一种来完成，包括银染或报告体，如放射性同位素、荧光剂、化学发光剂 和与可检测物质组合的酶。在某些实施方案中，检测含有13个或13个以上的基因座的多 重体的方法包括荧光(参见例如Schumm，J. ff.等人，载于Proceedings from the Eighth International Symposium onHuman Identification,(由 Promega Corporation ^ 1998 年出版)，78-84页；Buel，Eric等人(1998)，出处同上)，其中在多重反应中针对每个基因 座的高稳定性引物后接使用荧光检测器检测标记产物。上文提及的描述显现等位基因的先 有技术方法的参考文献通过引用结合到本文中。可以通过比较大小标准如DNA标记或基因座特异性等位基因分型标准物测定存 在于DNA样品中的等位基因，以确定在样品中的每个基因座存在的等位基因。在某些实 施方案中，用于评价含有两个或多个多态性STR基因座的多重扩增的标记的大小包括针对 所评价的每个基因座的等位基因分型标准物的组合。参见例如Puers，Christoph等人， (1993) Am J. Hum Genet. 53 :953958，Puers，Christoph，等人，(1994) Genomics 23 :260264。 另参见美国专利号5，599，666 ；5，674，686 ；和5，783，406关于适用于检测STR基因座的等位基因分型标准物的描述，以及其中公开的分型标准物构建方法。在构建针对各个基因座的等位基因分型标准物之后，可以混合这些等位基因分型 标准物，并加载进行凝胶电泳，同时进行扩增样品的加载。每种等位基因分型标准物与样品 中对应基因座的等位基因共迁移。可以使用内部泳道标准品评价本发明的多重反应产物，所述标准品是特化类型的 大小标记，配置用于在聚丙烯酰胺凝胶的相同泳道中或相同的毛细管中运行。内部泳道标 准品可以包括一系列已知长度的片段。更优选地用荧光染料标记内部泳道标准品，所述染 料与扩增反应中的其它染料可区分。在构建内部泳道标准品之后，该标准品还可以与扩增的样品或等位基因分型标准 物混合，并加载进行电泳，用于比较在凝胶电泳的不同泳道或毛细管电泳的不同毛细管中 的迁移。内部泳道标准品的迁移变化表明分离介质性能的变化。这种差异的定量和与等位 基因分型标准物的关联允许修正未知样品中的等位基因的大小测定值。仵诜的检测抟术 荧光检测在某些实施方案中，荧光检测用于评价混合物中的扩增的等位基因，其使用一种 或多种高稳定性引物通过多重扩增反应产生。以下是该检测方法可如何实施的简要概述。随着自动化荧光成像的出现，可以实现更快地检测和分析多重扩增产物。对于荧 光分析，可以在每个基因座的扩增中包含一种荧光标记的高稳定性引物。适用的荧光标 记的高稳定性引物可以包括荧光素标记的(FL-)、羧基-四甲基罗丹明标记的(TMR-)和 5，6_羧基罗丹明6G-标记的(R6G)高稳定性引物。优选通过平板凝胶电泳或毛细管电泳 实现对使用这类标记的高稳定性引物产生的扩增片段的分离。产生的分离片段可以使用 荧光检测设备如ABI PRISM 310遗传分析仪、ABI PRISM 377DNA测序仪(Applied Biosystems Division, PerkinElmer, Foster City, Calif.)或 Hitachi FMBIO II 焚光 扫描仪(HitachiSoftware Engineering America, Ltd. South San Francisco, Calif.)来 分析。在某些实施方案中，用于多重扩增反应的每对高稳定性引物中的一个或两个具有 与其连接的荧光标记，结果，由扩增反应产生的扩增等位基因被荧光标记。在该实施方案 中，扩增的等位基因随后通过毛细管电泳分离，分离的等位基因使用荧光成像分析仪显现 和分析。荧光检测相对于放射性标记及检测方法可能是有利的，因为荧光检测不需要使用 放射性材料，且没有与使用这些材料伴随的所有法规性和安全性问题。相对于其它非放射性检测方法如银染，也可以使用采用标记的高稳定性引物的荧 光检测，因为荧光检测方法一般显现出少于银染的扩增假象。较少量的假象部分归因于以 下事实荧光检测仅检测到连接标记的DNA的扩增条带，而由多重扩增反应产生的DNA的每 个扩增等位基因的两条链均使用银染检测方法来染色和检测。
实施例依据以下实施例可进一步理解本发明教导的一些方面，所述实施例不应被解释为 以任何方式限制本发明教导的范围。实施例1本实施例示例了一种测试样品中的PCR抑制因子的存在情况(或确定某种物质是
25否为抑制因子)的测定。如上所示，鉴定样品中的抑制因子的存在情况是任选步骤。
在本实施例中，提供包含靶核酸序列和可能的PCR抑制因子的样品。将其与用于 扩增靶核酸序列的一组标准稳定性引物混合。在单独的容器中配制包含与样品反应相同量 的靶核酸序列和引物组的对照溶液。对样品和对照实施扩增反应。分析并比较样品反应和 对照反应的扩增结果。在样品反应中没有PCR产物表明在样品中存在抑制因子。备选地， 与对照反应中的PCR产物量相比在样品反应中存在较少量的PCR产物表明样品中存在抑制 因子。实施例2本实施例示例了测试含有高稳定性核酸类似物的高稳定性引物的测定。在本实施例中，提供仅包含天然核酸的引物(例如标准稳定性引物)。产生候选高 稳定性引物，其与标准稳定性引物具有相同序列，但使用对等的(例如其以相同选择性碱 基配对)高稳定性核酸类似物代替至少一个天然核酸。检验测试引物的熔点温度，并与标 准稳定性引物的熔点温度相比较。较高的熔点指示更稳定的引物。如果候选高稳定性引物 的熔点高于标准稳定性引物的熔点，则这是候选高稳定性引物比标准稳定性引物更稳定的 指示。备选地，产生候选高稳定性引物，其与标准稳定性引物具有相同序列，但使用两个 高稳定性核酸类似物代替两个核酸。检验候选高稳定性引物的熔点温度，并与标准稳定性 引物的熔点温度相比较。如果候选高稳定性引物的熔点高于标准稳定性引物的熔点，则这 是候选高稳定性引物比标准稳定性引物更稳定的指示。备选地，产生候选高稳定性引物，其与标准稳定性引物具有相同序列，但使用三种 高稳定性核酸类似物代替三种核酸。检验候选高稳定性引物的熔点温度，并与标准稳定性 引物的熔点温度相比较。较高的熔点指示更稳定的引物。如果候选高稳定性引物的熔点高 于标准稳定性引物的熔点，则这是候选高稳定性引物比标准稳定性引物更稳定的指示。实 施例3 本实施例示例了含有PCR抑制因子的样品中的靶核酸序列的扩增。提供包含靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。将靶核酸序列与含有高稳定性引物 的引物组混合。高稳定性引物包含高稳定性核酸类似物。对样品(或至少包含靶核酸序 列)实施扩增反应，通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。即便在PCR抑制因子存在下，靶核 酸序列也以较高度的效率被扩增。备选地，提供包含靶核酸序列和2种或3种PCR抑制因子的样品。将靶核酸序列 与含有高稳定性引物的引物组混合。高稳定性引物包含高稳定性核酸类似物。对样品实施 扩增反应，通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。即便在PCR抑制因子存在下，靶核酸序列也 以较高度的效率被扩增。备选地，提供来自犯罪现场的样品。所述样品包含靶核酸序列和PCR抑制因子。将 靶核酸序列与含有高稳定性引物的引物组混合，所述高稳定性引物包含高稳定性核酸类似 物。对样品实施扩增反应，通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。即便在PCR抑制因子存在 下，靶核酸序列也以较高度的效率被扩增。实施例4本实施例示例了含有PCR抑制因子的样品中的靶核酸序列的扩增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。靶核酸序列与包含高稳定性引物的 引物组混合。所述引物组能够扩增CODIS核酸序列或另一个含STR的基因座。高稳定性引物包含两种或三种高稳定性核酸类似物。对样品实施扩增反应，并通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。实施例5本实施例示例了含有PCR抑制因子的样品中的靶核酸序列的扩增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。靶核酸序列与包含两种(或三种) 高稳定性引物的引物组混合。每种引物包含高稳定性核酸类似物。对样品实施扩增反应， 并通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。靶核酸序列将以比仅使用对等的标准稳定性引物的 情况高的程度扩增。实施例6本实施例示例了含有核酸和PCR抑制因子的样品中的STR基因座的扩增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。将包含核酸和PCR抑制因子的样品 与包含高稳定性引物的STR特异性引物组混合。对样品实施扩增反应，并通过高稳定性引 物扩增STR基因座。实施例7本实施例示例了含有PCR抑制因子的样品中的CODIS基因座的扩增。提供含有靶核酸序列和怀疑具有PCR抑制因子的样品。将靶核酸序列与包含至少 一种高稳定性引物的CODIS特异性引物组混合。对样品实施扩增反应，并通过高稳定性引 物扩增CODIS基因座。实施例8本实施例示例了在PCR 抑制因子存在下 D8S1179、D18S51、D21Sll、FGA、TH01、vWA
和珐琅蛋白中的一个或多个基因座的扩增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。将包含靶核酸序列和PCR抑制因子 的样品与包含对0851179、018551、021511、？6々、^01^14和珐琅蛋白基因座中的每一种特 异性的至少一种高稳定性引物的引物组混合。对样品实施扩增反应，并通过高稳定性引物 扩增目标基因座。实施例9本实施例示例了在PCR 抑制因子存在下 D8S1179、D18S51、D21Sll、FGA、TH01、vWA、 D2S1338、D3S1358、D16S539、D19S433、SE33和珐琅蛋白中的一个或多个基因座的扩增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。将包含靶核酸序列和PCR抑制因 子的样品与包含对 D8S1179、D18S51、D21Sll、FGA、TH01、vWA、D2S1338、D3S1358、D16S539、 D19S433、SE33和珐琅蛋白基因座中的每一种特异性的至少一种高稳定性引物的引物组混 合。对样品实施扩增反应，并通过高稳定性引物扩增目标基因座。实施例10本实施例示例7 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P0、D3S1358、THOU D13S317、 D16S539、D2S1338、D19S433、vWA，TP0X、D18S51、D5S818 和 FGA 中的一个或多个基因座的扩
增ο提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。将包含靶核酸序列和PCR抑制因 子的样品与包含对 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P0、D3S1358、THOU D13S317、D16S539、 D2S1338、D19S433、vffA, TPOX, D18S51、D5S818和FGA基因座中的每一种特异性的至少一种 高稳定性引物的引物组混合。对样品实施扩增反应，并通过高稳定性引物扩增目标基因座。 实施例11本实施例示例了Penta E、D18S51、D21S11、THOU D3S1358、FGA、TPOX, D8S1179、 vWA、珐琅蛋白以及 Penta D、CSF1P0、D16S539、D7S820、D13S317 和 D5S818 中的一个或多个
基因座的扩增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。将包含靶核酸序列和PCR抑制因子的样品与包含对 Penta E、D18S51、D21S11、TH01、D3S1358、FGA、TP0X、D8S1179、vWA、珐琅蛋 白以及PentaD、CSF1P0、D16S539、D7S820、D13S317和D5S818基因座中的每一种特异性的
至少一种高稳定性引物的引物组混合。对样品实施扩增反应，并通过高稳定性引物扩增目 标基因座。实施例12本实施例阐述了DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、 DYS437、DYS438和DYS439中的一个或多个基因座的扩增。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。将包含靶核酸序列和PCR抑制因子 的样品与包含对 DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、 DYS438和DYS439中的每一种特异性的至少一种高稳定性引物的引物组混合。对样品实施 扩增反应，并通过高稳定性引物扩增目标基因座。实施例13本实施例阐述了人们可如何制备高稳定性引物的多个不同实施方案。本领域技术 人员将认识到，与以下的基因座相关的核酸序列是已知的TH01、TPOX、CSF1P0、vWA、FGA、 D3S1358、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、D8S1179、D18S51、D21S11、D2S1338、D3S1539、 D4S2368、D9S930、D10S1239、D14S118、D14S548、D14S562、D16S490、D16S753、D17S1298、 D17S1299、D19S253、D19S433、D20S481、D22S683、HUMCSF1P0、HUMTP0X、HUMTH01、HUMF13A01、 HUMBFXIII、HUMLIP0L、HUMvWFA31。人们选择一个或多个核酸序列(来自以上的基因座)中 的一部分作为扩增引物的结合位点(任何序列均可满足，只要其允许扩增相关STR)。核酸 部分将长得足以允许引物根据需要与其结合(例如为起引物作用，长5-30个核酸)。该部 分将用于产生标准稳定性引物(其将与以上选择的初始序列杂交)。标准稳定性引物将是 选定部分的互补序列。然后产生与标准稳定性引物对等的候选高稳定性引物。除了在候选高稳定性引物 中存在一个或多个高稳定性核酸取代之外，候选的高稳定性引物与标准稳定性引物相同。 选择高稳定性核酸取代，使得它们具有被置换核酸所具有的相同碱基配对选择特性。这种 对等的置换可以继续所期望的次数(以产生所期望数量的引物序列)。“置换”实际上不一 定是用一个核酸类似物物理置换一个天然核酸，而是可以合成新的引物，其除了核酸类似 物之外，与标准稳定性引物相同。一旦产生了一种或多种候选高稳定性引物，就可以测试其在扩增抑制因子存在下 的扩增能力。这可以如下实现加入已知量的初始靶核酸序列(一个上述基因座)，加入 已知量的抑制因子(例如腐殖酸、胆盐、其它盐、复合多糖、胶原、亚铁血红素、黑色素、真黑 素、肌红蛋白、多糖、蛋白酶、钙离子、尿素、血色素、乳铁蛋白、免疫球蛋白G、靛青染料、血色 素、棕黄酸、二价阳离子、螯合分子、酶、蛋白、复合多糖、EDTA、EGTA、DNA酶和胶原)，并加入 每种候选高稳定性引物。使用候选高稳定性引物的扩增量可以与使用标准稳定性引物时出 现的扩增量相比较。相比于标准稳定性引物表现出较高程度的扩增能力的那些候选引物是 高稳定性引物。在备选的实施方案中，高稳定性核酸类似物选自下列之一PNA、LNA、2' _0_甲基 核酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯键的核酸或其任意组合。已知此实施例、本领域技术人员的知识和本文公开的教导，本领域技术人员能够 制备针对任一种上述基因座的任何部分的高稳定性引物。实施例14本实施例阐述了本领 域技术人员可如何鉴定扩增抑制因子。首先，技术人员获得已知的靶核酸序列和针对该靶核酸序列的标准稳定性引物。技术人员将它们混合在用于标 准PCR反应的缓冲溶液中。技术人员将该溶液分为两部分。对于第一部分，技术人员将候 选PCR抑制因子加入PCR反应。对第二部分没有加入抑制因子。两部分平行进行PCR扩增， 比较在每个部分中产生的产物量。如果第一部分产生的扩增产物较少，则候选PCR抑制因 子是PCR抑制因子。实施例15 本实施例阐述了人们可如何使用高稳定性引物鉴定目标个体。提供含有靶核酸序 列和PCR抑制因子的样品。将样品与包含对以下基因座中的至少5个特异性的至少一种高 稳定性引物的引物组混合D8S1179、D18S51、D21S11、FGA、THOl、vWA、D2S1338、D3S1358、 D16S539、D19S433、SE33和珐琅蛋白。对样品实施扩增反应，并通过高稳定性引物扩增目标
基因座。然后检验扩增的序列，使得可以表征以上基因座的短串联重复序列(例如鉴定每 个基因座存在多少短串联重复序列)。然后将这些结果与目标个体的STR特征对比。如果 STR相同，则目标个体被认为与靶核酸序列匹配。实施例16本实施例阐述了一种通过使用高稳定性引物扩增靶核酸序列的方法。人们首先提 供怀疑含有靶核酸序列的法医样品。处理法医样品，以便将靶核酸置于用于随后的扩增的 缓冲液中，并使得可以由可在样品中存在的细胞或细胞组分释放靶核酸。在此之后，人们接着将至少一种高稳定性引物与靶核酸序列混合。高稳定性 引物以允许靶核酸序列扩增的方式与靶核酸序列特异性杂交。在此之后，人们通过 TAQMAN PCR扩增靶核酸序列，由此扩增靶核酸序列。任选地，人们可以表征扩增的靶核酸序列，然后将该特征与个体谱系对比，以确定 所述个体一般而言与靶核酸序列和样品是否匹配。实施例17本实施例通过用含LNA的寡核苷酸置换既有的寡核苷酸示例了高稳定性引物的 增强性能。本实施例还提供关于以下情况的一般性指引本领域技术人员可如何检验针对 多种CODIS相关序列的多种引物，并确定在多种引物中高稳定性核酸类似物应处于何处和 有多少。制备多种含珐琅蛋白-LNA的寡核苷酸。每种引物包含至少1个LNA，有些包含2 个 LNA。在有和没有腐殖酸(PCR抑制因子)的受控条件下以40ng/ μ L测试珐琅蛋白-LNA 引物的扩增能力。结果与不包含LNA的对照序列的扩增能力对比。在用对照引物扩增Ing 男性DNA的过程中，以40ng/ μ L获得对PCR的部分抑制。相反，含有一些LNA的引物表现 出显著较少的抑制。而且，一些珐琅蛋白LNA-寡核苷酸于eOng/μ L克服了腐殖酸抑制(图4)。相比 之下，对照寡核苷酸在相同条件下不能扩增。实施例18本实施例示例了可如何扩增性特异性标记来确定靶核酸序列的来源是男性还是 女性。提供含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品。将包含靶核酸序列和PCR抑制因子 的样品与包含对珐琅蛋白基因座特异性的至少一种高稳定性引物的引物组混合。对样品实 施扩增反应，并通过高稳定性引物扩增目标基因座。然后检验扩增产物。如果扩增产物仅包含在内含子1中具有6个碱基缺失的核酸 序列，则受试者是女性。如果扩增产物包含在内含子1中具有6个碱基缺失和在内含子1中不具有6个碱基缺失的测序混合物，则受试者是男性。要理解的是，先前的一般性描述和详述都仅是示例性的和解释性的，不限制权利 要求所保护的本发明。在本申请中，单数的应用包括复数，除非另有具体说明。在本申请中， 单词“一个”或“一种”是指“至少一个”或“至少一种”，除非另有具体说明。在本申请中， “或”的应用是指“和/或”，除非另有说明。此外，术语“包括”以及其它形式如“包含”、“含 有”的应用不是限制性的。另外，诸如“元件”或“组分”的术语既包括含有一个单元的元件 或组分，也包括含有一个以上的单元的元件或组分，除非另有具体说明。
本文使用的章节标题仅是为了组织目的，不能被解释为以任何方式限制所述主 题。要认识到的是，在本发明教导中讨论的温度、浓度、时间或次数等之前有隐含的 “约”，使得轻微的和不显著的偏差在本文的本发明教导的范围内。例如，“一种引物”是指可 以但不是必须存在一种以上的引物；例如但不限于特定引物种类的一个或多个拷贝，以及 特定引物类型的一种或多种形式，例如但不限于许多不同的正向引物。另外，所应用的“包 括”、“包含”和“含有”无限制意义。要理解的是，先前的一般性描述和详述都仅是示例性的 和解释性的，不限制本发明。参考文献的引用结合本文提及的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及它们中引用 的参考文献均通过引用整体结合到本文中。对于一个或多个引用结合的文献和类似材料与 本申请不同或相抵触的情况，包括但不限于限定的术语、术语应用、所述技术等，以本申请 为准。等同方案先前的描述和实施例详述了本发明的某些优选的实施方案，并描述了本发明人设 想的最佳模式。但是，要认识到的是，不管前述可以在上下文中出现得如何详细，本发明都 可以多种方式实施，应按照随附的权利要求及其任何等同方案解释本发明。
权利要求
一种扩增样品中的核酸序列的方法，所述方法包括提供一种包含靶核酸序列和PCR抑制因子的样品；将至少一种高稳定性引物和靶核酸序列混合，其中所述高稳定性引物包含至少一种高稳定性核酸类似物；和对所述样品实施扩增反应，由此通过所述高稳定性引物扩增所述靶核酸序列。
2.权利要求1的方法，其中所述靶核酸序列包括DNA。
3.权利要求1的方法，其中通过PCR实现扩增。
4.权利要求1的方法，其中所述高稳定性核酸类似物选自PNA、LNA、2'-0-甲基核 酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯键的核酸及其任意组合。
5.权利要求4的方法，其中所述高稳定性核酸类似物包括LNA。
6.权利要求1的方法，其中所述高稳定性引物包括至少2种高稳定性核酸类似物。
7.权利要求1的方法，其中所述方法包括提供至少2种高稳定性引物。
8.权利要求1的方法，其中所述方法包括提供至少5种高稳定性引物。
9.权利要求1的方法，其中所述高稳定性引物具有比第二种引物高的熔点温度，所述 第二种引物除了以下两点之外与所述高稳定性引物相同a)所述第二种引物由天然核酸 组成，和b)包括代替高稳定性核酸类似物的对等天然核酸。
10.权利要求1的方法，其中所述PCR抑制因子选自腐殖酸、胆盐、复合多糖、胶原、亚 铁血红素、黑色素、真黑素、肌红蛋白、多糖、蛋白酶、钙离子、尿素、血色素、乳铁蛋白、免疫 球蛋白G和靛青染料。
11.权利要求1的方法，其中用高稳定性引物的所述扩增扩增至少一个基因座的核酸 序列，所述基因座选自CSF1P0、FGA、TH01、TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、 D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433和 D2S1338。
12.权利要求1的方法，其中用高稳定性引物的所述扩增扩增至少一个基因座的核酸 序列，所述基因座选自CSF1P0、FGA、THOU TPOX, vWA、D3S1358、D5S818 和 D7S820。
13.一种鉴定个体的靶核酸序列的方法，所述方法包括提供一种样品，其中所述样品处于据信被可抑制核酸扩增的组分污染的位置，其中所 述样品包含来自个体的靶核酸序列；使用至少一种高稳定性引物扩增所述个体的靶核酸序列，其中所述高稳定性引物包 含至少一种高稳定性核酸类似物，其中所述引物可以扩增至少一个基因座的序列，所述基 因座选自CSF1P0、FGA、THOU TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、 D16S539、D18S51、D21S11、D19S433、D2S1338或其组合，其中所述引物进一步包含迁移率调 节物；和表征扩增的靶核酸序列，由此鉴定扩增的靶核酸序列。
14.权利要求14的方法，其中所述高稳定性核酸类似物包含LNA。
15.一种用于人类鉴定的引物，所述引物具有与至少一个基因座的序列互补的序列，所 述基因座选自CSFlP0、FGA、TH01、TP0X、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、 D16S539、D18S51、D21S11、D19S433和D2S1338，其中所述引物中的至少一种核酸为高稳定 性核酸类似物。
16.权利要求15的引物，其中所述引物进一步包含迁移率调节物。
17.权利要求16的引物，其中所述迁移率调节物选自聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚乳酸、 多肽、寡糖、聚氨酯、聚酰胺、聚磺酰胺、聚亚砜、聚膦酸酯及其嵌段共聚物。
18.一种用于PCR反应的试剂盒，所述试剂盒包括 三磷酸脱氧核苷酸；荧光标记的引物；包含至少一种高稳定性核酸类似物的高稳定性引物；和 DNA聚合酶。
19.权利要求18的试剂盒，所述试剂盒还包括装有等位基因分型标准物的容器，所述 等位基因分型标准物对应于适于同短串联重复序列分析比较的大小。
20.权利要求18的试剂盒，所述试剂盒还包括荧光标记的引物。
21.权利要求18的试剂盒，所述试剂盒还包括MgCl2。
22.权利要求18的试剂盒，所述试剂盒还包括BSA。
23.权利要求18的试剂盒，所述试剂盒还包括叠氮化钠。
24.权利要求18的试剂盒，所述试剂盒还包括对照样品。
25.权利要求18的试剂盒，所述试剂盒还包括迁移率调节物。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述迁移率调节物选自聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚乳 酸、多肽、寡糖、聚氨酯、聚酰胺、聚磺酰胺、聚亚砜、聚膦酸酯及其嵌段共聚物。
27.一种用于PCR反应的试剂盒，所述试剂盒包括 三磷酸脱氧核苷酸；荧光标记的引物；非标记引物，其中至少一种引物为高稳定性引物，其中所述高稳定性引物包含至少一 种高稳定性核酸类似物；装有等位基因分型标准物的容器，所述等位基因分型标准物对应于适于同短串联重复 序列分析比较的大小；和 DNA聚合酶。
28.权利要求18或27的试剂盒，其中所述高稳定性引物包含允许短串联重复序列扩增 的序列。
29.—种扩增样品中的核酸序列的方法，所述方法包括提供包含靶核酸序列的样品，其中所述靶核酸序列包含短串联重复序列； 将至少一种高稳定性引物和靶核酸序列混合，其中所述高稳定性引物包含至少一种高 稳定性核酸类似物，其中所述高稳定性引物以允许短串联重复序列扩增的方式与靶核酸序 列特异性杂交；和对样品实施扩增反应，由此通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。
30.权利要求1、13或29的方法，其中所述高稳定性核酸类似物不在所述高稳定性引物 的3'末端。
31.权利要求30的方法，其中所述高稳定性核酸类似物不是所述高稳定性引物的最后一个核酸。
32.—种扩增人类法医样品中的靶核酸序列的方法，所述方法包括 提供含有靶核酸序列的人类法医样品；将至少一种高稳定性引物和靶核酸序列混合，其中所述高稳定性引物包含至少一种高 稳定性核酸类似物；和对所述样品实施扩增反应，由此通过高稳定性引物扩增靶核酸序列。
33.权利要求32的方法，其中所述人类法医样品包括至少一种选自以下的物质唾液、 血液、阴道液体、精液、血浆、血清、脑髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液和粪便。
34.权利要求32的方法，其中所述人类法医样品包括选自以下器官的外分泌物皮肤、 嘴、肺、鼻、眼、耳、脐、消化道、泌尿生殖道及其任意组合。
35.权利要求32的方法，其中所述靶核酸序列包含DNA。
36.权利要求32的方法，其中扩增通过PCR实现。
37.权利要求32的方法，其中所述高稳定性核酸类似物选自PNA、LNA、2'-0-甲基核 酸、2' -0-烷基核酸、2'-氟代核酸、包含硫代磷酸酯键的核酸及其任意组合。
38.权利要求37的方法，其中所述高稳定性核酸类似物包含LNA。
39.权利要求32的方法，其中所述高稳定性引物包括至少2种高稳定性核酸类似物。
40.权利要求32的方法，其中所述方法包括提供至少2种高稳定性引物。
41.权利要求32的方法，其中所述方法包括提供至少5种高稳定性引物。
42.权利要求32的方法，其中所述高稳定性引物具有比第二种引物高的熔点温度，所 述第二种引物除了以下两点之外与所述高稳定性引物相同a)所述第二种引物由天然核 酸组成，和b)包括代替高稳定性核酸类似物的对等天然核酸。
43.权利要求32的方法，其中用高稳定性引物的所述扩增扩增至少一个基因座的核酸 序列，所述基因座选自CSF1P0、FGA、TH01、TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、DSS1179、 D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D19S433和 D2S1338。
44.权利要求32的方法，其中所述法医样品在提供步骤之前处于非无菌环境中。
45.权利要求32的方法，其中所述法医样品位于选自以下的至少一个位置室内环境、 居住地、房屋、公寓、住宅单元、旅馆、汽车旅馆、政府办公室、杂货店、便利店、办公室、办公 楼、医院、诊所、教堂、饭馆、大型购物中心、学校、学院、大学、宿舍、监狱、拘留所、车库、图书 馆、交通工具、小汽车、飞机、火车、公共汽车、运货车、救护车、警车、消防车、出租车、户外环 境、公园、庭院、森林、树林、街道、高速公路、校园、大学校园、办公室复合地面、营地、跑道、 登山道、广场、停车场、一片水域、湖、池塘、海洋、河流、小溪、湿地、水池和浴盆，其中所述法 医样品在提供步骤之前位于所述位置。
46.权利要求32的方法，其中所述法医样品在提供步骤之前包含至少一部分衣服。
47.权利要求46的方法，其中所述衣服选自以下的至少一种牛仔裤、裤子、毛线衫、衬 衫、内衣、裙子、女外套、围巾、运动鞋、鞋、靴子、制服、手套、连指手套、短袜、长袜、夹克和外 套。
48.权利要求32的方法，其中所述法医样品直接接触选自以下的至少一种环境家具、 桌子、椅子、车辆座椅、床、婴儿床、床头板、凳子、计算器、厨房用具、灯、织物、粗斜纹棉布、 帆布、丝绸、棉布、人造纤维、毛织品、毛皮、皮革、绒面革、塑料、合成纤维、纸、木材、竹子、塑 料、金属、玻璃、陶瓷、石膏、涂料、装饰品、眼镜、珠宝、手袋、假发、钱包、室内装饰品、浴帘、 窗帘、遮光物、百叶窗、地毡、地毯、床单、枕套、床罩和毛毯。
49.权利要求1、13、29和32之一的方法，其中所述高稳定性引物包含允许短串联重复序列扩增的序列。 全文摘要
本发明的教导提供了用于核酸扩增的方法、组合物和试剂盒。在本发明教导的某些实施方案中，以至少一种高稳定性引物进行扩增反应。在某些实施方案中，本发明的教导提供了一种包含高稳定性引物的方法，所述高稳定性引物用于扩增含有靶核酸序列和PCR抑制因子的样品中的核酸序列。
文档编号C12P19/34GK101861396SQ200880103496
公开日2010年10月13日 申请日期2008年6月18日 优先权日2007年6月18日
发明者J·J·穆勒罗, L·K·亨尼西 申请人:应用生物系统有限责任公司