利用酶促反应合成样品中的cDNA的方法

专利名称：：利用酶促反应合成样品中的cDNA的方法
技术领域：
：这两个连续酶促反应的实施很复杂，有许多可能出错的地方，例如引入核酶、物质丧失或移液误差。微小RNA(miRNA)的大小约20_25个核苷酸不等，其代表了一类新的非编码RNA。它们由所谓的“发夹前体”加工，可在基因表达中作为负调节物而起作用。因此，它们下调大量基因(Ambros,V.，2001，MicroRNAs=Tinyregulatorswithgreatpotential(微小RNA极具潜力的微小调节物)，Cell107，823-826)。miRNA首先转录为长的“初级转录物”(它们也称为初级miRNA)(Lee,Y.，Jeon,K等，2002，MicroRNAmaturationstepwiseprocessinginsubcellularlocalization(微小RNA成熟亚细胞定位中的分步加工)，EmboJ.21,4663-4670)。然后缩短这些“初始转录物”，得到长度约为70个核苷酸。形成所谓的“茎环结构”，也称为“前-miRNA”。前-miRNA输出进入细胞质。输出酶称为输出蛋白(eXp0rtin)-5。它们在细胞质中进一步加工，从而形成长约22个核苷酸的成熟miRNA分子(Lee,Y.等，2003，ThenuclearRNA'sIIIDroshainitiatesmicroRNAprocessing(核RNA的IIIDrosha启动微小RNA力口工)，Nature425,415—419)。最近的研究提示miRNA在发育和分化中起着重要作用。微小RNA基本上以两种方式施加调节作用。在植物中，miRNA通过精确的互补性与它们相应的mRNA互补。这通过涉及RNA干扰(RNAi)的机制破坏了靶mRNA。在动物中，miRNA通过涉及Lin_4和Let_7的机制阻止基因表达。在这点上，miRNA不与它们相应的mRNA精确互补，而是阻止蛋白质的合成和功能(Ambros,V.，2004，ThefunctionsofanimalmicroRNAs(动物微小RNA的功能)，Nature,431,350-355)。由于只是最近才发现miRNA起到决定性作用，它们的检测和/或分析也具有决定性作用。在真核生物中，18S、5.8S和25/28SrRNA的合成包括在核仁中加工修饰所谓的前体rRNA(前-rRNA)。该复杂的rRNA生物产生过程包括在核仁中累积的许多小的所谓的“核仁小RNA”(sn0RNA)。它们以所谓的核仁小核糖核蛋白颗粒(snoRNP)的形式进行该过程(Maxwell，E.S.等，1995，ThesmallnucleolarRNAs(核仁小RNA)，AnnualReviewBiochem.，35，897—934)。除了RNA酶MRP外，迄今为止表征的所有snoRNA可以分成两个家族。它们是可由它们共同的序列基序区分的盒c/D和盒h/ACA缓慢RNA(Ballakin，A.D.等，1996，TheRNAworldofthenucleolus:twomajorfamiliesofsmallnucleolarRNAsdefinedbydifferentboxelementswithrelatedfunctions(核仁的RNA世界具有相关功能的不同盒元件限定的核仁小RNA的两类主要家族)，Cell，86，823-834)。不同真核生物中，snoRNA基因的基因组构成显示极大的多样性。在脊椎动物中，大多数snoRNA通过“宿主基因”插入内含子中。如U3等例外是独立转录的。在酵母中，snoRNA插入内含子，但大多数snoRNA转录成含其自身启动子的各自基因。成簇的snoRNA基因通过上游共同的启动子转录。由于尺寸小且缺乏聚腺苷酸化，snoRNA的检测和/或分析代表了分子生物学的难点。PCR是研究微生物常用的工具，有时也可用于分析16SrRNA基因。然而，因为合成引物的程度可能有限，在微生物样品中发现新基因受限制。因此，16SRNA基因的引物衍生自培养的微生物中早已知晓的序列(Olson，D.J.，1986，Microbialecologyandevolution:AribosomalRNAapproach(微生物生态学和进化核糖体RNA方法)，Annu.Rev.Microbial.40:337_365)。由于在从生物中提取迄今为止未知的16SrRNA基因的系统方法中我们依靠早已知晓的序列，很可能微生物多样性被极大低估并未得到分离。就如同16SRNA分子难以分离一样，由于缺乏对序列的了解，特别是缺乏聚腺苷酸尾，原核生物mRNA分子也难以分离。现有技术已知两-步的方法。在该方法中，RNA分子在聚腺苷酸聚合酶和底物三磷酸腺苷的帮助下转化，因而形成聚腺苷酸化的核糖核酸。在另一步骤中纯化得到的聚腺苷酸化核糖核酸分子，然后在第三步骤中进行反转录。反转录掺入聚腺苷酸化尾，其中均质聚寡核苷酸通常加在与聚腺苷酸化RNA尾互补的聚(T)寡核苷酸上。这样，聚合酶利用聚(T)寡核苷酸的3’-端制备与现有核糖核酸链互补的脱氧核糖核酸链。得到的链称为“第一链cDNA”。该cDNA可用于利用随机引物或特异性引物的PCR反应中，从而产生扩增物。Shi等特别指导了在PCR中利用适体-特异性引物，通过寡聚-dT适体-引物检测miRNA(Shi，R.禾口Chiang,V.L.(Shi,R.等，FacilemeansforquantifyingmicroRNAexpressionbyreal-timePCR(通过实时PCR定量测定微小RNA表达的简便方法)，Biotechniques,2005，39，519-25)。对于上述特定的核糖核酸分子，最近公布的该方法具有决定性的缺点。因此，两-步方法通常可能引入污染物。纯化步骤会损失罕见RNA。两-步方法需要灭活第一种酶，并且于第一和第二种酶需要温育时间，从而共同导致极其费时。此外，该两-步方法的缺点在于当同时加工两种或更多种样品时有混淆样品的风险。如本领域已知的，核糖核酸对于核酸酶攻击较敏感。该两-步方法，尤其是第一步骤后的纯化步骤有引入核酸酶的风险。最后，两个或更多个步骤总意味着移液误差的风险升高。本发明的目的因此，本发明要解决的问题是提供一种方法，该方法能合成cDNA、在很大程度上防止污染、更省时、使样品混淆的风险降至最低、使引入核酸酶的风险降至最低、最后在很大程度上排除移液误差的风险。该问题通过在酶促反应中合成样品的cDNA的方法得到解决，其中所述方法包括以下步骤(a)同时提供具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、缓冲液、至少一种核糖核苷酸、至少一种脱氧核糖核苷酸和锚定寡核苷酸，(b)加入包含核糖核酸的样品和(C)在一个或多个温度步骤中温育步骤(a)和(b)的物质，所述温度的选择应使所述第一种酶和所述第二种酶显示活性。迄今为止，对于酶促聚腺苷酸化和反转录的组合在技术上是否可能有保留。从即使最近，即，发现微小RNA和snoRNA后(对于分析和检测而言，代表了特别的分子生物学难点)，酶促反应依然连续进行的事实可以看出这点(Want，J.F.等，Identificationof20microRNAsfromOryzasativa(鉴定稻的20种微小RNA)，NucleicAcidRes，2004，32，1688-95；Shi,R.禾口Chiang,V.L.,FacilemeansforquantifyingmicroRNAexpressionbyreal-timePCR(通过实时PCR定量测定微小RNA表达的简便方法)，Biotechniques，2005,39,519-25；FuH.等，IdentificationofhumanfetallivermiRNAsbyanovelmethod(通过新型方法鉴定人胎儿肝miRNA)，FEBSLett，2005，579，3849-54；Chen,C.L.等，ThehighdiversityofsnoRNAsinplants:identificationandcomparativestudyof120snoRNAgenesfromOryzasativa(植物中snoRNA的高度多样性稻的120种snoRNA基因的鉴定和比较研究)，NucleicAcidsRes,2003,31,2601-13；Botero,L.Μ.等，Poly(A)polymerasemodificationandreversetranscriptasePCRamplificationofenvironmentalRNA(环境RNA的聚腺苷酸聚合酶修饰和反转录酶PCT扩增)，Appl.EnvironMicrobiol，2005，71，1267-75)。出乎意料的是，两种方法，即聚腺苷酸化和反转录均是本领域技术人员早已知晓的(Sano,H.禾口Feix,G.,TerminalriboadenylatetransferasefromEscherichiacoli.Characterizationandapplication(白勺亥—的表征和应用)，Eur.J.Biochem.，1976，71，577-83)。本领域技术人员通常在聚腺苷酸加尾步骤后纯化反应产物(Shi,R.等,FacilemeansforquantifyingmicroRNAexpresssionbyreal-timePCR(通过实时PCR定量测定微小RNA表达的简便方法)，Biotechniques，2005，39，519-25)。其原因在于反应缓冲液的组成和反应所需的底物显著不同。本发明的另一目的是提供一种简单的方法，该方法能合成cDNA，任选将该反应与第三酶促反应结合，从而能在同一反应容器中特异性检测产生的cDNA。由于其极易操作，该“三合一”方法尤其有利于分析大量样品中的一种或几种分析物。其原因在于，例如与实时PCR结合，其代表了非常简单而快速的方法以便分析大量样品。因此，极大程度上避免了其它操作和污染，因而更省时、使样品混淆的风险降至最低、使引入核酸酶的风险降至最低、最后在很大程度上排除移液误差的风险。这些优点在诊断学中至关重要。“三合一”反应的问题通过以下方法解决，即，在酶促反应中合成样品的cDNA，然后进行另一酶促反应(任选扩增反应)，任选在扩增期间实时或在随后与检测结合，其中所述方法包括以下步骤(a)同时制备具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、缓冲液、至少一种核糖核苷酸、至少一种脱氧核糖核苷酸、锚定寡核苷酸、具有核酸合成活性的至少一种第三种酶、至少一种引物、任选的探针，(b)加入包含核糖核酸的样品和(C)在一个或多个温度步骤中温育步骤(a)和(b)的物质，所述温度的选择应使所述第一种酶和所述第二种酶显示活性并任选使得所述第三种酶具有活性或无活性。任选地，随后进行一个或多个温度步骤，其中所述第一种酶和所述第二种酶具有很低的活性或无活性而所述第三种酶有活性。体内所用聚腺苷酸聚合酶的底物是腺苷酸三磷酸(ATP)。一些聚腺苷酸聚合酶已显示也能用其它NTP作为底物来连接短尾(Martin，G.和Keller，W.，Tailingand3'-endlabelingofRNAwithyeastpoly(A)polymeraseandvariousnucleotides(用酵母聚腺苷酸聚合酶和各种核苷酸进行RNA的加尾和3’-端标记)，RNA，1998，4，226-30)。本发明的发明人出乎意料地发现，在某些先决条件下，可能在一个反应容器中同时进行截然不同的两种酶促反应。在本发明的优选实施方式中，样品是核糖核酸，其选自下组原核生物核糖核酸、真核生物核糖核酸、病毒核糖核酸、源自太古细菌(Archaeon)的核糖核酸、微小-核糖核酸(miRNA)、核仁小核糖核酸(snoRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、通常非聚腺苷酸化的核糖核酸和核糖体核糖核酸(rRNA)；还可以是两种或更多种上述核糖核酸的混合物。样品当然还可已经含有聚腺苷酸RNA。在本发明特别优选的实施方式中，样品是核糖核酸，其选自下组原核生物核糖核酸、miRNA、snoRNA和rRNA。在本发明最优选的实施方式中，样品包含选自miRNA或snoRNA的核糖核酸。此外，不同含量的不同种类核糖核酸的混合样品优选伴有其它物质。此外，本发明的发明人发现，在某些先决条件下，可能在一个反应容器中同时进行截然不同的两种酶促反应，此外，可将该两种酶促反应与第三种酶促反应结合以便特异性检测产生的cDNA，优选核酸合成活性。在本发明的优选实施方式中，样品是核糖核酸，其选自下组原核生物核糖核酸、真核生物核糖核酸、病毒核糖核酸、源自太古细菌的核糖核酸、微小-核糖核酸(miRNA)、核仁小核糖核酸(snoRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、通常非聚磷酸化的核糖核酸和核糖体核糖核酸(rRNA)；还可以是两种或更多种上述核糖核酸的混合物。样品当然还可已经含有聚腺苷酸RNA。在本发明特别优选的实施方式中，样品是核糖核酸，其选自下组原核生物核糖核酸、miRNA、snoRNA和rRNA。在本发明的最优选实施方式中，样品包含核糖核酸，其选自miRNA或snoRNA。此外，不同含量的不同种类核糖核酸的混合样品优选伴有其它物质。依据本发明方法的这些优点，本发明人证明能有效制备和表征miRNA，而没有污^feo在本发明的一个实施方式中，锚定寡核苷酸是均质多聚寡核苷酸，其选自下组聚腺苷酸寡核苷酸、聚(C)寡核苷酸、聚(T)寡核苷酸、聚(G)寡核苷酸、聚(U)寡核苷酸、额外包含5'-尾的聚腺苷酸寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚(C)寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚(T)寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚(G)和额外包含5'-尾的聚(U)寡核苷酸。如上所述，任选额外包含5'-尾的聚(T)寡核苷酸是优选的。本发明的锚定寡核苷酸的长度通常介于6-75个核苷酸之间。然而，其最长可以约150个核苷酸。如果锚定寡核苷酸是合成的，最大长度要根据DNA合成的技术局限性。锚定寡核苷酸任选包含5'-尾和/或锚定序列。5'_尾是寡核苷酸5’-端的额外核苷酸序列，其用于，例如引入克隆序列、引物和/或探针结合位点或任何其它序列。本领域技术人员可根据具体应用的要求鉴定5'-尾的合适序列。锚定寡核苷酸的3’-端可含有额外的锚定序列，长度通常是再加1-5个核苷酸。该锚定序列的长度可以是至少一个碱基，在一优选实施方式中，该第一部分是简并碱基，其含有除锚定寡核苷酸的均质多聚部分所用碱基以外的所有碱基。其后可以是其它碱基。这些碱基也可以是简并碱基。在优选的实施方式中，利用N变量是明智的，其中N=A、C、G、T或相应的类似物。锚定寡核苷酸通常是脱氧核糖核酸(DNA)。然而，锚定寡核苷酸还可以是肽核酸(PNA)。还可能是锁定核酸(LNA)、硫代磷酸-脱氧核糖核酸、环己烯-核酸(CeNA)、N3'-P5'-亚磷酰胺(phosphoroamidite)(NP)、三环-脱氧核糖核酸(tcDNA)。然而，锚定寡核苷酸优选脱氧核糖核酸(DNA)。也可能是RNA和DNA或一种或多种修饰核酸或类似物的混合物以及其它修饰物，例如在所选条件下能与RNA或DNA杂交的相应碱基类似物。在特别优选的实施方式中，锚定寡核苷酸是具有以下特征的聚(T)寡核苷酸额外包含5’-尾、是脱氧核糖核酸、长15-150个核苷酸以及是混合物的形式。锚定寡核苷酸的3’-端可含有长度通常为再加1-5个核苷酸的额外锚定序列。该锚定序列的长度可以是至少一个碱基，在一优选实施方式中，该第一部分是简并碱基，其含有除锚定寡核苷酸的均质多聚部分所用碱基以外的所有碱基。其后可以是其它碱基。这些碱基也可以是简并碱基。在优选的实施方式中，利用N变量是明智的，其中N=A、C、G、T或相应的类似物。例如，我们可能述及本发明的以下锚定寡核苷酸实施例1(SEQIDNO:10)5'TGGAACGAGACGACGACAGACCAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(T)xWN3'实施例2(SEQIDNO11)5'AACGAGACGACGACAGAC(T)XVN3'实施例3(SEQIDNO12)5'AACGAGACGACGACAGAC(T)XV3'实施例4(SEQIDNO13)5'AACGAGACGACGACAGAC(T)XN3'实施例5(SEQIDNO14)5'AACGAGACGACGACAGAC(T)XNN3'实施例6(SEQIDNO15)5'AACGAGACGACGACAGAC(T)XVNN3'实施例7(SEQIDNO16)5'AACGAGACGACGACAGAC(T)XVNNN3‘实施例8(SEQIDNO17)5'AACGAGACGACGACAGAC(T)XNNN3'实施例9(SEQIDNO:18)5'TGGAACGAGACGACGACAGACCAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(T)xVN3'实施例10(SEQIDNO19)5'TGGAACGAGACGACGACAGACCAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(T)xVNN3'X优选10-30碱基。V和N是简并碱基的单字母码，V=A、C、G;N=A、C、G、T。本领域技术人员能鉴定其它合适的5’-尾序列。任选的5’-尾包含额外的1-100个核苷酸，其可应用于后续分析。因此，在优选的实施方式中，5’-尾可含有寡核苷酸，例如一种或多种DNA探针和/或一种或多种PCR引物的结合序列。用于5’-尾的序列宜选择与本发明方法相容。这包括，例如选择不会在本发明方法和后续分析中导致任何不良副反应的序列。本发明的锚定寡核苷酸如图12所示。本发明的酶促反应基本上可在运载体上或容器中进行，即，该反应可在反应容器中进行。所述反应容器可以是反应器试管或，例如微量滴定板。反应可以在芯片上进行。如果反应在芯片上进行，可固定一种或多种组分。反应可在测试带上或微流体系统中进行。本领域技术人员知道关于运载体或容器的各种不同实施方式。在优选的实施方式中，核糖核苷酸是腺苷_5‘-三磷酸、胸苷_5‘-三磷酸、胞嘧啶-5'-三磷酸、鸟嘌呤-5'-三磷酸和/或尿嘧啶-5'-三磷酸。核糖核苷酸还可以是碱基类似物。核糖核苷酸可经修饰或作标记。基本上，重要的是核糖核苷酸可作为底物被酶的聚腺苷酸化活性所转化。本发明的脱氧核糖核苷酸可选自下组脱氧腺苷-5'_三磷酸(dATP)、脱氧胸苷-5'-三磷酸(dTTP)、脱氧胞嘧啶-5'-三磷酸(dCTP)、脱氧鸟嘌呤-5'-三磷酸(dGTP)、脱氧尿嘧啶-5'-三磷酸(dUTP)和修饰的脱氧核糖核苷酸及标记的脱氧核糖核苷酸。本申请还设想了可利用一个或多个含有通用碱基或碱基类似物的脱氧核糖核苷酸。实施本发明重要的是所用的脱氧核糖核苷酸应能合成cDNA。按照本发明，dATP、dCTP、dTTP和dGTP优选作为混合物一起存在。按照本发明，脱氧尿嘧啶-5'_三磷酸也可用于混合物中。这可与实际反应后进行的酶促反应组合，利用尿嘧啶-DNA-糖基化酶，从而能降解不再使用的酶促产生的反应产物。如果对脱氧核糖核苷酸作标记，标记物可选自下组32P、33P、35S、3H、荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、6_羧基荧光素(FAM)、咕吨、罗丹明、6-羧基-2'，4'，V，4，7_六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4'，5'-二氯_2'，7'-二甲基荧光素(dimethodyfluorescein)(JOE),N,N,N'，N'-四甲基_6_羧基罗丹明(TAMRA)、6_羧基-X-罗丹明00、5-羧基罗丹明-66(!665)、6-羧基罗丹明-6606)、罗丹明110；香豆素，例如伞形酮，苯甲亚胺，例如Hoechst33258；菲啶，例如德克萨斯红、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、P卜啉染料、聚甲炔染料、花青苷染料，例如Cy3、Cy5、Cy7,BODIPY染料、喹啉染料和Alexa染料。插入其它标记物，例如生物素或一种或多种半抗原，例如洋地黄毒苷可直接或间接检测核酸。间接检测(例如通过抗体检测)仍是，例如通过与抗体偶连的酶的酶促检测。通过引入与，例如抗体或亲和配体偶连的纳米颗粒也可能进行间接检测。脱氧核糖核苷酸还可通过5’-磷酸修饰，从而能更简单地克隆。通过插入反应活性基团，例如氨基接头(还有生物素)，可将脱氧核糖核苷酸，例如固定或能够直接或间接检测。尤其优选的修饰选自下组荧光染料、半抗原、5'-磷酸、5'-生物素、5'-氨基接头。按照本发明，反应中脱氧核糖核苷酸的浓度是至少0.OlmM和最多10mM。给予的浓度数值是各脱氧核糖核苷酸的浓度。在一个优选的实施方式中，脱氧核糖核苷酸(各自为dATP、dCTP、dGTP和dTTP)存在的浓度为0.2mM-2mM。给予的浓度数值是混合物中各脱氧核糖核苷酸的浓度。在本发明特别优选的实施方式中，脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)存在的浓度为0.5mM。本发明人出乎意料地发现作为本发明目的的一步酶促反应可在有镁离子(Mg2+)存在下，在6-10的狭窄缓冲液-pH范围内进行。因此，在优选的实施方式中，pH是6-10。在尤其优选的实施方式中，本发明缓冲液的pH为6.8-9。在本发明的另一实施方式中，本发明缓冲液还包含选自下组的离子Μη2+、K+、NH4+和Na+。本发明缓冲液包含，例如MgCl2、MgS04、乙酸镁、MnCl2、KCl、(NH4)2S04、NH4Cl、NaCl。以下试剂可视作缓冲物质Tris、两性离子缓冲剂(Tricine)、N，N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)、羟乙基哌嗪乙磺酸Ofepes)和具有本发明pH范围的其它缓冲物质或者两种或更多种合适缓冲物质的混合物。本领域技术人员已知许多具有聚腺苷酸化活性的酶。按照本发明，这些酶选自下组原核生物来源、真核生物来源、病毒来源和太古细菌来源的酶以及植物来源的酶。就本发明而言，聚腺苷酸化活性是利用核糖核苷酸的3’_端作为底物的酶活性，其在合适的缓冲液中能将核糖核苷酸酶促加入该3’-端，优选至少10-20个核苷酸。在优选的实施方式中，酶是能利用腺苷-5’_三磷酸作为底物的酶。就本发明而言，当利用单链和双链RNA，例如发夹RNA，如前-miRNA时，这包括具有聚腺苷酸化活性的酶和反应条件。本领域技术人员可根据待分析的RNA选择酶和反应条件，因此单链RNA(例如，成熟的miRNA)或双链RNA(例如，前-miRNA)或二者可用于分析。就本发明而言，聚腺苷酸化活性通常是转录酶活性。在优选的实施方式中，具有聚腺苷酸化活性的酶是选自下组的酶大肠杆菌的聚腺苷酸聚合酶、酵母菌的聚腺苷酸聚合酶、牛的聚腺苷酸聚合酶、蛙类的聚腺苷酸聚合酶、人的聚腺苷酸聚合酶和植物的聚腺苷酸聚合酶。其它酶是本领域技术人员已知，或者通过与已知聚腺苷酸聚合酶的同源性分析而最新鉴定的。在一特别优选的实施方式中，具有聚腺苷酸化活性的酶是大肠杆菌的聚腺苷酸聚合酶。本发明的具有反转录酶活性的酶选自下组病毒、细菌太古细菌和真核生物的酶，特别是耐热生物的酶。这还包括，例如内含子、反转座子或反转录病毒的酶。按照本发明，具有反转录酶活性的酶是能在合适缓冲条件下在核糖核酸上将互补脱氧核糖核苷酸掺入与核糖核酸杂交的寡聚脱氧核苷酸或寡聚核糖核苷酸3’-端的酶。这包括天然具有该功能的酶以及只有通过改变它们的基因序列，例如通过诱变或相应的缓冲液条件才能获得这种功能的酶。具有反转录酶活性的酶宜选自下组HIV反转录酶、M-MLV反转录酶、EAIV反转录酶、AMV反转录酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶I、M-MLVRNA酶H、Superscript、SuperscriptII、SuperscriptIII、Monsterscript(埃皮森特公司(Epicentre))、Omniscript、Sensiscript反转录酶(恰根公司(Qiagen))、ThermoScript和Thermo_X(均来自英杰公司(Invitrogen))0按照本发明，还可能利用只有在修饰酶的基因序列后才具有反转录酶活性的酶。还可利用误差精确性增加的反转录酶活性。例如，我们可提及，如斯特拉塔基因公司(Stratagene)的AccuScript反转录酶。本领域技术人员明显知道还可能利用两种或更多种具有反转录酶活性的酶的混合物。本领域技术人员知道具有反转录酶活性的大多数酶需要二价离子。因此，对于需要二价离子的酶，上述优选的实施方式中存在二价离子，优选Mg2+和Mn2+。酶的优选组合是HIV反转录酶或M-MLV反转录酶或EAIV反转录酶或AMV反转录酶或嗜热栖热菌DNA聚合酶I或M-MLVRNA酶H、Superscript、SuperscriptII、SuperscriptIII或Monsterscript(±矣皮森特公司)或Omniscript反转录酶(恰根公司)或Sensiscript反转录酶(恰根公司)、ThermoScript、Thermo-X(均来自英杰公司)或具有反转录酶活性的两种或更多种酶与大肠杆菌的聚腺苷酸聚合酶的混合物。此外，还可以是HIV反转录酶或M-MLV反转录酶或EAIV反转录酶或AMV反转录酶或嗜热栖热菌DNA聚合酶I或M-MLVRNA酶H、Superscript、SuperscriptII、SuperscriptIII或Monsterscript(埃皮森特公司)或Omniscript反转录酶(恰根公司)或Sensiscript反转录酶(恰根公司)、ThermoScript,Thermo-X(均来自英杰公司)或具有反转录酶活性的两种或更多种酶与酵母菌的聚腺苷酸聚合酶的混合物。本领域技术人员知道反转录期间的高温意味着二级结构的问题不具有决定性的作用。此外，对于某些酶，高温意味着反转录的特异性增加，因为阻止了错配和不正确的引发。因此，本发明的一个实施方式利用嗜热的反转录酶。优选在45°C-85°C，优选550C-80°C，最优选在60°C_75°C具有最佳核酸合成活性的酶。优选嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶I。如果具有聚腺苷酸化活性的酶是非嗜热酶，具有反转录酶活性的酶是嗜热酶，那么本发明方法可在几个温度步骤中进行，其中第一温度步骤提供对于具有聚腺苷酸化活性的酶最佳的温度，第二温度步骤提供对于具有反转录酶活性的酶最佳的温度。如果利用，例如AMV反转录酶，则第二温度步骤在42°C进行，而主要适合于具有聚腺苷酸化活性的酶活性的第一温度步骤在37°C进行。然而，还可在恒定温度下进行反应。本领域技术人员能选择温度，从而产生各酶活性。如果利用，例如大肠杆菌的聚腺苷酸聚合酶与嗜热栖热菌的DNA聚合酶的组合，则温度顺序如下所示首先在37°C，然后在55-70°C温育。因此，按照本发明，热不稳定的酶可与热稳定的酶组合。在该情况中，温度步骤取决于两种酶中哪一种具有聚腺苷酸化活性。按照本发明，优选具有反转录酶活性的酶是热稳定的。此外，本领域技术人员明白，聚腺苷酸化步骤中的高温温育可导致反转录酶部分或完全灭活。因此，如果两种酶均热稳定也是优选的。此外，本领域技术人员已知这些酶具有极为不同的持续合成能力，因此，本领域技术人员可组合具有不同持续合成能力的酶，从而能以不同效率将不同长度的模板转化成cDNA。采用适当量的各酶，一种或多种温育温度和温育时间，本领域技术人员可能获得满意的结果。本发明方法优选还包含聚(C)多核苷酸。本发明方法尤其优选还包含聚(C)聚核糖核苷酸。每20μ1优选利用lng-300ng聚(C)聚核糖核苷酸，每20μ1反应优选利用10ng-150ng聚(C)聚核糖核苷酸，每次反应尤其优选利用25ng-100ng聚(C)聚核糖核苷酸，每20μ1反应最优选利用50ng-75ng聚(C)聚核糖核苷酸。本发明反应还可包含其它试剂，例如体积排除剂(volumeexcluder)、单链结合蛋白、DTT和/或竞争性核酸。如果利用体积排除剂，其选自下组葡聚糖、聚乙二醇，本发明的体积排除剂见EP1411133A1。在优选的实施方式中，竞争性核酸是均质多聚核糖核酸，最优选聚腺苷核糖核酸。例子描述于US6，300，069。本发明方法优选还包含聚(C)多核苷酸。本发明方法尤其优选还包含聚(C)多聚核糖核苷酸。每20μ1优选利用lng-300ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每20μ1反应优选利用10ng-150ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每次反应尤其优选利用25ng-100ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每20μ1反应最优选利用50ng-75ng聚(C)多聚核糖核苷酸。本领域技术人员明白优选防止竞争性核酸本身用作聚腺苷酸聚合酶活性的底物。可能的解决办法是封闭竞争性核酸的3’0H基团。本领域技术人员知道合适的解决办法，例如，利用3’磷酸酯基，掺入二脱氧核苷酸或反向碱基(inversebase)。本领域技术人员明白优选防止竞争性核酸本身用作反转录酶活性的底物。可通过选择在给定反应条件下不能转录成cDNA的竞争性核酸来确保这点，例如因为所用引物不能与那些核酸杂交。另一可能的解决办法是封闭竞争性核酸的3’0H基团。本领域技术人员知道合适的解决办法，例如，利用3’磷酸酯基，掺入二脱氧核苷酸或反向碱基。本发明还涉及一种反应混合物，其包含具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、任选的缓冲液、任选的至少一种核糖核苷酸、任选的至少一种脱氧核糖核苷酸和任选的锚定寡核苷酸。所述锚定寡核苷酸优选包含均质多聚部分、锚定序列和/或尾。所述反应混合物优选还包含随机引物。额外应用随机引物的优点在于长转录物的5’端也有效转录，在对于定量测定分析至关重要。反应混合物可包含与本发明方法所用相同的试剂。在本发明的一个实施方式中，锚定寡核苷酸是均质多聚寡核苷酸，其选自下组聚腺苷酸寡核苷酸、聚(C)寡核苷酸、聚(T)寡核苷酸、聚(G)寡核苷酸、聚(U)寡核苷酸、额外包含5'-尾的聚腺苷酸寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚(C)寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚(T)寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚(G)和额外包含5'-尾的聚(U)寡核苷酸。如上所述，任选额外包含5'-尾的聚(T)寡核苷酸是优选的。本发明的锚定寡核苷酸的长度通常介于6-75个核苷酸之间。然而，其最长可以约150个核苷酸。如果锚定寡核苷酸是合成的，最大长度要根据DNA合成的技术局限性。锚定寡核苷酸任选包含5'-尾和/或锚定序列。5'_尾是寡核苷酸5’-端的额外核苷酸序列，其用于，例如插入克隆序列、引物和/或探针结合位点或任何其它序列。本领域技术人员可根据具体应用的要求鉴定5'-尾的合适序列。锚定寡核苷酸的3’-端可含有额外的锚定序列，长度通常是再加1-5个核苷酸。该锚定序列的长度可以是至少一个碱基，在一优选实施方式中，该第一部分是简并碱基，其含有除锚定寡核苷酸的均质多聚部分所用碱基以外的所有碱基。其后可以是其它碱基。这些碱基也可以是简并碱基。在优选的实施方式中，利用N变量是明智的，其中N=A、C、G、T或相应的类似物。任选的5’_尾包含额外的1-100个核苷酸，其可应用于后续分析。因此，在优选的实施方式中，5’-尾可含有寡核苷酸，例如一种或多种DNA探针和/或一种或多种PCR引物的结合序列。用于5’-尾的序列宜选择与本发明方法相容。这包括，例如选择不会在本发明方法和后续分析中导致任何不良副反应的序列。本发明反应混合物还包含长度介于10-150个核苷酸之间的本发明锚定寡核苷酸，其3’-端任选具有长度为1-5个核苷酸的本发明锚定序列。本发明反应混合物包含锚定寡核苷酸，如上所述，其是例如脱氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)。在优选的实施方式中，本发明反应混合物包含本发明的锚定寡核苷酸，其是聚(T)寡核苷酸并额外具有5’-尾，该寡核苷酸是10-75个核苷酸长的脱氧核糖核酸并且是混合形式，在3’-端存在锚定序列，在由选自A、G或C的核苷酸构成的各情况中，任选其后再有包含所有四种碱基A、C、G和T或相应类似物的1-5个核苷酸。本发明反应混合物的锚定寡核苷酸如图12所示。本发明反应混合物还包含至少一个核糖核苷酸，如上文本发明方法所述。具体地说，本发明反应混合物包含至少一个选自ATP、TTP、CTP、GTP、UTP或相应碱基类似物的核糖核苷酸。如上所述，核糖核苷酸可以任选经修饰或作标记。如本发明方法所述，本发明反应混合物包含脱氧核糖核苷酸。具体地说，本发明反应混合物可包含一个或多个脱氧核糖核苷酸，例如dATP、dCTP、dGTP、dUTP和/或dTTP。一个优选的实施方式利用脱氧核糖核苷酸的混合物来合成cDNA。这些脱氧核糖核苷酸可任选经修饰或作标记。如果对本发明反应混合物的脱氧核糖核苷酸作标记，标记物可选自下组32P、33P、35S、3H、荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)、咕吨、罗丹明、6-羧基-2',4',7'，4，7-六氯荧光素(HEX)、6_羧基-4',5'-二氯,7'-二甲基荧光素(dimethodyfluorescein)(JOE)、N,N,N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6_羧基-X-罗丹明(1()、5-羧基罗丹明-660665)、6-羧基罗丹明-6606)、罗丹明110；Cy3、Cy5、Cy7，香豆素，例如伞形酮，苯甲亚胺，例如Hoechst33258；菲啶，例如德克萨斯红、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、吓啉染料、聚甲炔染料、花青苷染料，例如Cy3、Cy5、Cy7,B0DIPY染料、喹啉染料和Alexa染料。插入其它标记物，例如生物素或一种或多种半抗原，例如洋地黄毒苷可直接或间接检测核酸。间接检测(例如通过抗体检测)仍是，例如通过与抗体偶连的酶的酶促检测。通过引入与，例如抗体或亲和配体偶连的纳米颗粒也可能进行间接检测。在各情况中，本发明反应混合物包含脱氧核糖核苷酸的浓度是O.OlmM-lOmM。在各情况中，各脱氧核糖核苷酸A、C、G和T存在的浓度为0.2mM-2mM。如果脱氧核糖核苷酸A、C、G和T同时存在，这尤其优选。在该特别优选的实施方式中，各脱氧核糖核苷酸存在的浓度为0.5mM。此外，本发明反应混合物包含缓冲液。该缓冲液的pH是6-10。本发明反应混合物还包含Mg2+离子。在尤其优选的实施方式中，本发明反应混合物具有pH为6.8-9的缓冲液。该反应混合物还包含选自下组的离子Mn2+、K+、NH4+和Na+。存在两种不同的酶活性对于本发明反应混合物至关重要。本发明反应混合物包含具有聚腺苷酸化活性的至少一种第一酶活性和具有反转录酶活性的至少一种第二酶活性。这些活性的优选实施方式如上文本发明方法所述。与上文本发明方法相似，反应混合物还可包含其它物质，例如体积排除剂、单链结合蛋白、DTT和/或一种或多种竞争性核酸。如果利用体积排除剂，其选自下组葡聚糖、聚乙二醇。本发明的其它体积排除剂见EP1411133A1。如果反应混合物任选包含竞争性核酸，其选自均质多聚核糖核酸和聚腺苷核糖核酸。本发明的其它竞争性核酸描述于us6，300，069。本发明反应混合物优选还包含聚(C)多核苷酸。本发明反应混合物尤其优选还包含聚(C)多聚核糖核苷酸。每20yl优选利用lng-300ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每20yl反应优选利用10ng-150ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每次反应尤其优选利用25ng-100ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每20yl反应最优选利用50ng-75ng聚(C)多聚核糖核苷酸。本发明还涉及包含上述反应混合物的试剂盒。在优选的实施方式中，所述反应混合物装在单一反应容器中。就本发明而言，在另一实施方式中，所述试剂盒装有反应容器，该容器装有具有聚腺苷酸化活性的酶、具有反转录酶活性的酶、任选的脱氧核糖核苷酸、任选的至少一种核糖核苷酸、任选的含Mg2+的缓冲液和任选的一种或多种寡聚脱氧核糖核苷酸本发明试剂盒的反应容器中任选可装有如本发明反应混合物所述的其它组分。此外，所述试剂盒可装有本发明锚定寡核苷酸的5’-尾的探针。另外，所述试剂盒可装有一种或多种其它脱氧核糖核苷酸，例如通用引物以便检测反转录所引入的尾序列。反应混合物可以是“团块形式”，例如冻干的。本领域技术人员已知，例如不包含液体形式的其它制备方法。此外，所述试剂盒可任选与PCR反应或实时PCR反应所需的试剂组合。这些试剂优选是至少一种PCR反应的试剂，从而能检测本发明方法产生的至少一种cDNA。此外，所述试剂盒任选装有随机引物，还任选装有一种或多种引物或引物/探针以便在单一或多重PCR-反应和/或实时单一或多重PCR反应中检测其它靶基因。本发明的反应混合物、方法或试剂盒还可包含靶标特异性引物。靶标特异性引物的长度选择应能在PCR反应中作特异性检测，靶标引物的序列应具有足够特异性从而能只与所产生cDNA序列中的一个位点结合。所述引物的长度通常为15-30个核苷酸，优选17-25个核苷酸。在特别优选的实施方式中，反应混合物包含具有聚腺苷酸化活性的酶和具有反转录酶活性的酶，作为双-酶预混合物。在这种特别优选的实施方式中，所述试剂盒在一个反应容器中装有双-酶预混合反应混合物，在不同的容器中装有缓冲液、Mg2+、rNTP、dNTP、任选的本发明锚定寡核苷酸和任选的随机引物，还装有任选的体积排除剂和/或竞争性核酸。如上所述，本发明方法可在一个或多个温度步骤中实施。在优选的实施方式中，本发明方法在用于温育的一个温度步骤和用于酶灭活的另一温度步骤中进行。因此，在优选的实施方式中，酶显示活性的温育步骤是约37°c。温育时间是约1-120分钟，优选5-90分钟，更优选10-75分钟，甚至更优选15-60分钟，甚至更优选20-60分钟，最优选50-70分钟。超过该温育时间通常也无害。使酶变性的另一步骤采用至少65°C和最多100°C的温度。优选的温度是约80-95°C。变性期是至少1分钟和最多30分钟。在优选的实施方式中，变性进行5分钟。随后，产生cDNA的本发明方法可包括聚合酶链式反应。如果是这种情况，优选将cDNA合成期间引入的尾的特异性引物和/或特异性引物加入本发明的反应混合物。那么，该反应混合物还应含有热稳定的DNA聚合酶。在优选的实施方式中，在第一步反应开始前，所有反应组分即已存在于试管中(参见实施例9)。为达到，例如由实时PCR中无模板反应(所谓的“无模板对照”)的高Ct值所显示的最佳信噪比，可优选以无活性形式或物理上分开地提供对于第三反应至关重要的一种或多种组分。在实施例8中，例如引物“固定”在盖子上。如果第三反应是PCR，其优选实时PCR。本领域技术人员已知可逆地灭活所用的热稳定DNA聚合酶的许多方法。称为热-启动PCR的方法提供了许多技术方案。PCR酶的已知热启动(hotstart)方法是化学方法(参见DE69928169T)、抗体、适体、DNA寡聚物、Affybodies、微囊法(还参见DE6"30765T)。此外，采用PCR作为第三反应时，如果进行PCR时才需要的寡核苷酸，即一种或多种靶标特异性引物、尾_特异性引物和任选的一种或多种荧光标记的探针只在第三反应开始时才可用则是最理想的。作为首先制备无活性形式寡核苷酸，然后活化或再活化这些PCR反应相关引物的技术转化形式，可以设想各种技术转化形式。最可能的是暂时隔开各试剂。然后这些试剂视需要释放。尤其优选将扩增酶或扩增引物隔开。这包括化学修饰PCR反应的相关引物，例如通过在主链上插入侧基团，或碱基或它们的组合或包装在能降低或完全抑制与靶核酸和/或一个或多个参与酶的相互作用的复合物(还参见专利族DE69930765T、US6274353、EP0866071)和/或物理屏障中。为除去这些侧基因或复合物以有助于提供用于第三反应(优选PCR或实时PCR)的相关寡核苷酸，许多方法是可以设想的，或是本领域技术人员已知的。可借助许多物理参数，例如温度、PH、离子强度、机械效应或这些参数中两种或更多种的组合，通过化学或酶学方法实施该活化。例如，实施例提供了热启动引物可能的实施方式。现有技术描述了引物热启动的各种实施方式(参见，DE69930765T、US6274353、EP0866071)。在酶促活化的情况中，还可以无活性形式提供活化所用的酶。合适的热启动方法是本领域技术人员已知并已在上文描述的(EP0962526等)。在这点上，本领域技术人员应明白通过利用，从例如嗜热或超嗜热生物分离的热稳定酶与合适的热启动方法，例如EP0962526组合，可能改进酶促活化以符合第三反应的要求。还可借助许多物理参数，例如温度、PH、离子强度、机械效应或这些参数中两种或更多种的组合，通过化学或酶学方法实施该活化。作为进一步优选的实施方式，可以设想上述反应的分隔方法。首先，提供进行二合一PAP-RT反应的条件。然后无需实验人员的操作步骤，优选无需打开容器，例如通过升起物理屏障(例如，热的，机械的)来制备第三反应的反应物。在可能的实施方式中，利用热不稳定屏障。优选利用透明的聚合物，例如具有明确融点的蜡。在合适条件下将该反应物与用于第三反应的相关寡核苷酸混合，从而产生在第一和第二反应条件下是固体的相。可通过许多不同的方法获得该固相。例如，其可以是容器底部的固体滴状物、一个或多个颗粒、反应隔室表面的涂层或一些其它形式。通过改变第三反应的温度，相关寡核苷酸释放并且可为该第三反应所用。反应的另一种分隔形式是限制或至少尽可能减少不必要的反应物接触的物理屏障。这可以是隔膜，例如蜡或聚合物制成，然后可借助许多物理参数，例如温度、PH、离子强度、机械效应，通过化学或酶学方法影响其透过性。在一个可能的实施方式中，由蜡屏障将第三反应的一个或多个组分与二合一PAP-RT反应的组分隔开。为此，在用于PCR或实时PCR的常规反应容器的特定实施方式中，第三反应的一个或多个组分存在于反应容器的底部，用至少一个隔膜覆盖(就本发明而言)，其上是二合一PAP-RT反应的组分。本领域技术人员应明白第三反应的组分可以是液体形式或干燥的或以其它方式稳定的，或是多种浓度，或一种或多种形式的组合。在一个也是优选的实施方式中，所述引物以修饰形式使用，作为所谓的“热-启动”引物。这些是所谓的“CleanAmp”引物，得自Trilinkbiotech.com。“CleanAmp”引物的特性在于只有通过PCR开始时的初始加热步骤才变得有功能，因此直至PCR时才能获得有功能的形式。在优选的实施方式中，引物是无活性的，如W02007/139723(申请人Trilink)，特别是权利要求1和随后的权利要求中所述。15利用以下引物进行引物最初无活性的方法SEQIDNO.3HumUni5'-AACGAGACGACGACAGAC-3'SEQIDNO.4Let7short5'-GAGGTAGTAGGTTGTATAG_3'SEQIDNO.5hsa-miR-245'-TGGCTCAGTTCAGCAGGA-3'SEQIDNO.6hsa_miR-15a5'-TAGCAGCACATAATGGTTT_3'SEQIDNO.7hsa-miR-165'-TAGCAGCACGTAAATATTG_3'随后进行的PCR反应还可以是定量PCR反应。该反应可在阵列上进行，在微流体系统中进行，在毛细管中进行或者其可以是实时PCR。PCR的其它变体是本领域技术人员已知的，并包括在本发明方法内。DNA聚合酶优选热稳定的。其可选自衍生自嗜热细菌或嗜热太古细菌的酶。其最好选自来自以下微生物的聚合酶栖热水生菌(Thermusaquaticus)、太平洋栖热菌(Thermuspacificus)、口誉热栖热菌、激雾、U、热球菌(Pyrococcusfuriosus)、Thermusbrockianus、超B誉热菌(Aquifexaeolicus)和其它热稳定的DNA聚合酶。还可采用其它扩增方法，这些方法可选自下组“滚环扩增”(如Liu等，“RollingcircleDNAsynthesisSmallcircularoligonucleotidesasefficienttemplatesforDNApolymerases(滚环DNA合成小的环形寡核苷酸作为DNA聚合酶的有效模板)“J.Am.Chem.Soc.1181587-1594(1996)所述)、“等温扩增”(如Walker等，〃Stranddisplacementamplification-anisothermal,invitroDNAamplificationtechnique(链置换扩增-等温，体外DNA扩增技术)〃NucleicAcidsRes.20(7)1691-6(1992)所述)、“连接酶链式反应”(如Landegren等，“ALigase-MediatedGeneDetectionTechnique(连接酶-介导的基因检测技术)"Science2411077-1080，1988所述，或Wiedmann等，“LigaseChainReaction(LCR)-OverviewandApplications(连接酶链式反应)"PCRMethodsandApplications(PCR方法和应用)(冷泉港实验室出版社，冷泉港实验室，纽约1994)第S51-S64页所述))。然而，优选聚合酶链式反应。本发明还涉及将RNA反转录成DNA的方法，所述方法包括以下步骤制备包含RNA的样品，加入具有反转录酶环形的第一酶、缓冲液、至少一种脱氧核糖核苷酸、寡核苷酸，在一个或多个温度步骤温育这些物质，其中这些温度步骤的选择使得酶显示活性，其中反应体系还包含聚(C)多核苷酸。具有反转录酶活性的酶优选HIV反转录酶、M-MLV反转录酶、EAIV反转录酶、AMV反转录酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶I、M-MLVRNA酶H(Superscript、SuperscriptII、SuperscriptIII)>Monsterscript().Omniscript()、Sensiscript反转录酶(恰根公司)、ThermoScript、Thermo_X(均来自英杰公司)或具有反转录酶活性的两种或更多种酶与大肠杆菌的聚腺苷酸聚合酶的混合物。尤其优选HIV反转录酶。反应优选包含聚(C)多核苷酸。每20μ1优选利用lng-300ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每20μ1反应优选利用10ng-150ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每次反应尤其优选利用25ng-100ng聚(C)多聚核糖核苷酸，每20μ1反应最优选利用50ng-75ng聚(C)多聚核糖核苷酸。均质多聚核酸可用于该三合一反应中。在本发明的优选实施方式中，样品是核糖核酸，其选自下组原核生物核糖核酸、真核生物核糖核酸、病毒核糖核酸、源自太古细菌(Archaeon)的核糖核酸、微小-核糖核酸(miRNA)、核仁小核糖核酸(snoRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、通常非聚腺苷酸化的核糖核酸和核糖体核糖核酸(rRNA)；还可以是两种或更多种上述核糖核酸的混合物。样品当然还可已经含有聚腺苷酸RNA。RNA可用作模板，其选自下组真核生物核糖核酸、mRNA、原核生物核糖核酸、miRNA、snoRNA和rRNA。在本发明的最优选实施方式中，样品包含核糖核酸，其选自miRNA或snoRNA。此外，不同含量的不同种类核糖核酸的混合样品优选伴有其它物质。依据本发明方法的这些优点，本发明人证明能有效制备和表征miRNA，而没有污染。这些方法通常能良好地反转录少量RNA。本发明还涉及用于反转录的试剂盒，所述试剂盒装有具有反转录酶活性的酶和聚(C)多核苷酸，优选聚(C)多核糖核苷酸。在一个实施方式中，首先聚腺苷酸化RNA，再反转录样品。实施例实施例1证明同一反应容器中聚腺苷酸反应和反转录的结合单-步方法的可行性；不同缓冲液对检测22-聚体RNA寡核苷酸的影响该实验证明了在同一反应容器中聚腺苷酸反应和反转录的结合单-步方法的可行性。为该目的，在各种条件下进行结合的单-步方法。一方面，给缓冲液添加聚腺苷酸聚合酶，另一方面，给缓冲液添加反转录酶。此外，测试了聚腺苷酸聚合酶缓冲液和反转录酶缓冲液的混合物。作为对照，根据图IA采用两-步方法进行反应。如表1所示设置反应。表1聚腺苷酸反应和反转录<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>PAP:聚腺苷酸聚合酶RT:反转录rATP:腺苷5'-三磷酸使用表2所示的试剂。表2聚腺苷酸反应和反转录的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>核苷酸)或不用模板(lb、2b、3b、4b，所有均加水代替模板)进行反应。进行无模板的反应作为可能出现非特异性背景的对照。选择玉米RNA作为背景RNA，因为待检测的22-聚体RNA寡核苷酸的序列在玉米中不存在。酶灭活后(参见表5分钟，93°C)，2μ1各试验la/b-4a/b用作实时PCR的模板。如表3所示，利用QuantiTectSYBR绿色PCR试剂盒(目录号204143)和表4所示引物一式三份地进行实时PCR试验。表3=SYBR绿色实时PCR中的组分<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4SYBR绿色PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>PCR方案的构成是QuantiTectSYBR绿色PCR主混合物中所含HotStarTaq聚合酶的初始再活化，15分钟，95°C；然后进行40轮的15秒、94°C，30秒、52°C和30秒、72°C(参见表5)。表5=SYBR绿色实时PCR的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>收集72°C延伸步骤期间的荧光数据。用ABIPRISM7700(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))进行PCR分析，反应体积为20μ1。然后对PCR产物进行解链曲线分析。利用ABIPRISM7000实时PCR仪器进行分析。表6表1所示试验的实时PCR分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>然后通过琼脂糖-凝胶电泳验证PCR产物的身份。为此，将10μ1各PCR反应加载于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上并分离。IOObp梯(英杰公司，目录号15628-050)用作大小标准品。结果示于图3。实施例2证明同一反应容器中聚腺苷酸聚合酶反应和反转录的结合单-步方法的重现性和特异性该实验的目的是重现同一反应容器中聚腺苷酸聚合酶反应和反转录的结合单_步方法的可行性。为此，分析同一反应容器中聚腺苷酸聚合酶反应和反转录的单_步方法，例如检测22-聚体RNA寡核苷酸的效率。按照标准条件的所用模板的反转录反应用作检测特异性的对照。为此目的，在各种条件下进行结合的单_步方法。一方面，给缓冲液添加聚腺苷酸聚合酶，另一方面，给缓冲液添加反转录酶(表7、8)。表7所进行反应的名称和组分<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表8组合的聚腺苷酸聚合酶/反转录反应和标准反转录反应的组成终浓度的数值<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>此外，为验证后续PCR中的特异性，进行了标准反转录反应(见上表7、8)。聚腺苷酸聚合酶反应和反转录后，将样品分开。在各情况中，将UniGAPdT引物和反转录酶再次加入至样品的一半(见上表7)。其目的是排除在轻微程度上A-尾在UniGAPdT引物上的不良连接产生假阳性信号的可能性。加入用德国希尔登市恰根公司的RNeasyMidi试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany,目录号75144)分离的总RNA作为模板。各反应所用的组分及其名称见上表7。检测的22-聚体RNA的序列对应于人Leu7amiRNA(EMBL登录号:AJ421724)，其可能在人血细胞，例如白细胞中表达。然而，由于用于RNA分离的RNeasy方法的纯化技术，如此少的RNA的纯化极其无效。该RNeasy方法只能确保大小超过200个碱基的RNA有效结合在RNeasy柱的二氧化硅膜上(恰根RNeasyMidi/Maxi手册，06/2001，第9页)，因此，严重缺乏了小RNA，例如miRNA。此外，合成22-聚体RNA的使用浓度远高于预计的内源性拷贝数。反应的设置如表8所示(见上表)。利用表9所示试剂。表9用于聚腺苷酸反应和反转录的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>酶灭活后(5分钟，93°C)，用水对各试验作12稀释，2μ1各试验la/b-8a/b用作实时SYBR绿色PCR的模板。如上表9所示，利用QuantiTectSYBR绿色PCR试剂盒(目录号204143)和表10所示引物一式两份地进行实时PCR试验。表10=SYBR绿色实时PCR的组分<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>通用尾-引物HumUni引物中所含的序列5'-AACGAGACGACGACAGAC-3'如US2003/0186288A1所述。PCR方案的构成是QuantiTectSYBR绿色PCR主混合物中所含HotStarTaq聚合酶的初始再活化，15分钟，95°C；然后进行40轮的15秒、94°C，30秒、52°C和30秒、72°C(参见表11)。表11SYBR绿色PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>收集72°C延伸步骤期间的荧光数据。用应用生物系统公司的AppliedBiosystems7500快速实时PCR系统进行PCR分析，反应体积为20μ1，然后进行解链曲线分析。从实时PCR分析可以明显看出，结合的单_步聚腺苷酸反应和反转录在聚腺苷酸聚合酶缓冲液和RT缓冲液中均是可能的。优选的缓冲液条件早已在文章中给出(见上文)。利用不同缓冲液获得的Ct值有很大不同。为检测特异性而进行的没有聚腺苷酸反应的标准反转录反应(反应3、6)均是阴性(无Ct)。因此，可以得出结论与预计的一样，没有22-聚体RNA(1，4，7)或天然产生的miRNA(2，5，8)的聚腺苷酸化，则没有PCR扩增的模板，因此没有信号产生(“无Ct")。在“双重RT”试验中，第一温育后，再加入RT酶和UniGAPdT引物以制备UniGAPdT引物，其可能在第一反应中进行聚腺苷酸_加尾，通过RT反应检测。所有试验显示没有Ct，S卩，未检测到不良假象。不良假象，例如cDNA合成所用引物的聚腺苷酸加尾也未检测到。实施例3通过本发明方法检测各种miRNA该实验的目的是证明借助采用本发明方法(包括聚腺苷酸反应和常规反转录)合成的模板cDNA，可通过miRNA特异性PCR引物检测几种靶标。为此，进行利用293RNA作为模板的方法。所用模板的标准条件反转录反应用作特异性检测的对照。在后续SYBR绿色PCR中，总之在各情况中，miRNA的4种不同特异性引物之一与尾-特异性引物一起使用。此外，位于人肌动蛋白转录物3’-端的引物与尾-特异性引物一起使用来检测聚腺苷酸反应和反转录的效率。对于聚腺苷酸反应和反转录(PAP+RT反应)，将表13所示试剂移至一起，如表16所示。表13用于聚腺苷酸反应和反转录的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>聚腺苷酸聚合酶I安比康公司；材料号80U:2030RNAmm普罗麦格公司；材料号N2511UniGAPdT引物5'-TGGAACGAGACGACGACAGACCAAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVVN-3'293RNA来自人细胞系293用恰根公司RNeasyMidi试剂盒分离(ATCC号CRL-1573)表16:PAP+RT反应"KfO终浓度IOx缓冲液RTrATPIOmMImM聚腺苷酸聚合酶21Ι/μ12UdNTP混合物(ATGC，各5mM)0.5mMUniGAPdT引物10μMΠΠRNA酶抑制剂IOU/μ1θSensiscript反转录酶1μ1不含RNA酶的水WMa)293RNA20ng/μ15μI(IOOng)b)H2O用作阴性对照5μ1总体积20μ1温育1小时，37°C5分钟，93°C在反应a)中加入293RNA作为阴性对照，在反应b)中加入水作为阴性对照。作为检测特异性的对照，根据表17的图表，利用表14所示试剂进行标准反转录反应。表14:反转录反应的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表17:标准RT反应<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在反应c)中，加入293RNA作为阴性对照，在反应d)中，加入水作为阴性对照。然后在37°C温育样品1小时。为终止反应，在93°C温育反应5分钟，该温度步骤使酶灭活。在酶灭活后，用水对各试验作12稀释，然后将2μ1的各试验a)-d)用作实时SYBR绿色PCR中的模板。PCR的材料如表15所示。表15=SYBR绿色PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>吸取10种不同的反应混合物。在反应1-5(表18)的各情况下使用miRNA特异性引物或β-肌动蛋白3’引物和尾-引物(HumUni)0表18=SYBR绿色PCR反应1-5<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在反应6-10(表19)的各情况下仅利用一种引物，miRNA特异性引物或尾-特异性引物。在反应6-10(表19)的各情况下仅利用一种引物，miRNA特异性引物或尾-特异性引物。表19反应6-10的仅含一种引物的对照<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>引入反应混合物中的引物的顺序可见表20。一式两份进行实时PCR试验。表20:引物<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>通用尾引物HumUni引物中所含的序列AACGAGACGACGACAGAC如US2003/0186288A1所述。PCR方案的构成是QuantiTectSYBR绿色PCR主混合物中所含HotStarTaq聚合酶的初始再活化，15分钟，95°C；然后进行40轮的15秒、94°C，30秒、52°C和30秒、72°C(参见表21)。记录72°C延伸步骤期间的荧光数据。用AppliedBiosystems7000快速实时PCR系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μ1，然后进行解链曲线分析。表21:3_步骤PCR方案<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>可以看出，对于选作例子的β-肌动蛋白系统，标准条件下进行反转录的效率和本发明方法的相当，从实时PCR中相当的Ct值可以明显看出(图6)。当利用标准条件下产生的cDNA时，实时PCR得到38以上的极高Ct值，表示在用Sybr绿色进行的实时PCR中检测特异性非常高(图6)。在PCR产物的琼脂糖凝胶分析中，检测到预计大小的PCR产物(图8)，当利用标准条件下产生的cDNA时，未检测到产物。miR24产物是例外。在本文中，当利用标准条件下产生的cDNA时，产生了错误大小的PCR产物(图8，还见图6)。如果采用本发明方法产生的cDNA，则检测不到该产物(图8)。在反转录或本发明方法中利用水代替模板RNA的所有对照反应均不显示信号，即在相关实时PCR中未获得Ct值(图7，上部)。仅利用一种引物的反应也一样(图7，上部)。在PCR中用水代替cDNA的阴性对照也未获得Ct值(图7)。实施例4通过聚腺苷酸反应和反转录的结合单_步方法检测miRNA，随后用尾-特异性探针检测实时PCR产生的cDNA该实验利用Taqman探针进行实时PCR，所述探针具有尾引物(UniGapdT)的特异性结合位点。通过探针的检测代表了通过SYBR绿色实时PCR检测的一种可信替代方法。使用探针还可能进行多重PCR，即一种或多种额外靶核酸，例如内部对照(可以是例如持家基因)的共扩增。对于聚腺苷酸反应和反转录(PAP+RT反应)，表22所示试剂一起移入，如表24所表22聚腺苷酸反应和反转录的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表24:PAP+RT反应<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>然后，37°C温育反应混合物，然后在93°C使酶灭活5分钟。灭活酶后，2μ1未稀释混合物用作实时PCR的模板，其含有用于检测的Taqman探针。PCR的材料如表23所示，如表25所示一起移入。表23QT探针PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表25=QuantiTect探针PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>实时PCR试验一式两份进行。通用尾-引物HumUni引物中所含序列AACGAGACGACGACAGAC如US2003/0186288A1所述。从人GAPDH基因座中取出Taqman探针序列；它不包含在US2003/0186288A1中。PCR方案的构成是=QuantiTect探针PCR主混合物中所含HotStarTaq聚合酶的初始再活化，15分钟，95°C；然后进行45轮的15秒、94°C，和30秒、52°C(参见表26)。表26两-步骤PCR方案PCR初始再活化15分钟，95'C__<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>记录52°C退火步骤期间的荧光数据。用7700序列检测系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μ1。PCR结果如表27所示。表27=PCR结果mleu7aCt|Ct平均值|CV,%未稀释，2x10820.24~20.310^45_20.37__可能通过尾-特异性探针进行检测，从而得到预计的结果。实施例5聚腺苷酸聚合酶浓度和温育时间对聚腺苷酸反应和反转录的结合单_步步法的影响在该试验中，本发明方法中利用两种浓度的聚腺苷酸聚合酶(2U或0.5U)，各15分钟或1小时。测试RT缓冲液(恰根公司)和聚腺苷酸聚合酶缓冲液中各种情况下的所有条件。对于聚腺苷酸反应和反转录(PAP+RT反应)，如表30中所述将表28所示试剂一起移入反应a)2U聚腺苷酸聚合酶，反应b)0.5U聚腺苷酸聚合酶)。表28聚腺苷酸反应和反转录的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表30:PAP+RT反应<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>然后，37°C温育样品(1.1小时/2.15分钟)。然后在93°C加热反应5分钟，从而灭活酶。然后，在SYBR绿色PCR中利用未稀释的各2μ1反应液。反应测试两次。为此，如表31所示将表29所示试剂一起移入，然后如表32所示进行PCR。表29=SYBR绿色PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表31SYBR绿色PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表32三-步骤PCR方案<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>PCR方案的构成是QuantiTectSYBR绿色PCR主混合物中所含HotStarTaq聚合酶的初始再活化，15分钟，95°C；然后进行40轮的15秒、94°C，30秒、52°C和30秒、72°C(参见表32)。记录72°C延伸步骤期间的荧光数据。用AppliedBiosystems7000快速实时PCR系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μ1，然后进行解链曲线分析。可见聚腺苷酸反应和反转录的单_步方法的效率对聚腺苷酸聚合酶的浓度和温育时间均依赖(图9)。实施例6用各种反转录酶实施本发明方法在RT缓冲液(恰根公司)中利用总共5种不同的反转录酶(见表35)实施本发明方法(反应1-5)，此外，为了比较，在各情况中缓冲液中均加入反转录酶(反应6-9)。表35所用的反转录酶和缓冲液<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>对于聚腺苷酸反应和反转录的单-步方法(PAP+RT反应)，对于反应1_5(反应缓冲液缓冲液RT(恰根公司))，表33所示试剂如表36所述一起移入；对于反应6-9(额外的反转录酶，各情况中补加在缓冲液中)，表33所示试剂如表37所述一起移入。表33聚腺苷酸反应和反转录的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表36缓冲液RT(恰根公司)中的PAP+RT反应<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表37补加了反转录酶的缓冲液中的PAP+RT反应<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>然后，37°C温育样品1小时。然后93°C加热反应5分钟，从而灭活酶。然后，在SYBR绿色PCR中利用各2μ1反应液。反应测试两次。为此，如表38所示将表34所示试剂一起移入，然后如表39所示进行PCR。表34SYBR绿色PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表38=SYBR绿色PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表39三-步骤PCR方案<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>PCR方案的构成是QuantiTectSYBR绿色PCR主混合物中所含HotStarTaq聚合酶的初始再活化，15分钟，95°C；然后进行40轮的15秒、94°C，30秒、52°C和30秒、72°C(参见表39)。记录72°C延伸步骤期间的荧光数据。用AppliedBiosystems7000实时PCR系统(应用生物系统公司)进行PCR分析，反应体积为20μ1，然后进行解链曲线分析。为标准反转录反应优化反转录酶的用量，可能解释Ct值中观察到的差异。实施例7证明在同一反应容器中聚腺苷酸反应、反转录和PCR的结合三-步方法的可行性；各种添加物对检测22聚体RNA寡核苷酸效率的影响该实验的目的是证明在同一反应容器中聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和PCR的结合三_步方法的可行性。为此目的，在以下条件下采用所述添加进行该结合三_步方法。用图IB所示的两_步方法进行反应作为对照。对于聚腺苷酸反应、反转录和PCR(PAP+RT反应+PCR)的三-步方法，一起使用表40所示材料，如表41所示。表40聚腺苷酸反应，反转录和PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>玉米RNA20ng/μ2μ(40ng)~"7总体积|20μ1~反应一式三份进行。为此，如表41所述将表40所示试剂一起移入，如表42所述进行反应。表42“三合一”反应的反应方案<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>反应方案首先包括聚腺苷酸聚合酶和用QuantiTect多重反转录酶混合物的反转录的组合反应条件(45分钟，37°C和15分钟，50°C)。然后，在95°C温育15分钟，从而灭活聚腺苷酸聚合酶和反转录酶，并活化QuantiTect多重RT-PCR主混合物中所含的HotStarTaqDNA聚合酶。然后是45轮PCR:94°C、15秒，52°C、30秒(见表43)，以在实时PCR中扩增产生的let7a-cDNA。利用UniGapdT引物的5’-尾的特异性荧光标记探针进行检测。记录52°C退火/延伸步骤期间的荧光数据。用AppliedBiosystems7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)进行该“三合一”反应，反应体积为20μ1。如图14所示，“三合一”反应能在玉米RNA背景下特异性检测合成的22聚体RNA寡核苷酸。在玉米RNA背景下含有合成的22聚体RNA寡核苷酸的样品提供的Ct值为20.61，而玉米RNA的对照反应的Ct值为30.65。该实验显示在给定的条件下“三合一”反应在技术上是可行的。实施例8用手工PCR引物“热启动”进行本发明的“三合一”方法，其目的在于促进结合三-步方法的反应。作为对照，基于图IB进行两-步方法的反应。用表43所示材料设置反应，如表44所示。表43聚腺苷酸反应，反转录和PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>利用表45的PCR引物制备引物混合物，将各情况中一个反应的所需用量加入光学帽的盖子(实时PCR容器的盖子，应用生物系统公司；材料号4323032)。然后，在加热块上以37°C温育盖子20分钟，直到液体蒸发，从而干燥引物。盖子中的PCR引物完全干燥后，如表44所示将试剂移到一起，加入光学试管(实时PCR容器，应用生物系统公司；材料号4316567)中，用预处理的光学帽密封，如表46所示进行PCR。一式三份地进行反应测试。表45=PCR盖子中干燥的寡聚-混合物的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表46“三合一”反应的反应方案<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>反应方案首先包括聚腺苷酸聚合酶和用QuantiTect多重反转录酶混合物的反转录的组合反应条件(45分钟，37°C和15分钟，50°C)。然后，在95°C加热反应3分钟来灭活聚腺苷酸聚合酶和反转录酶。然后，从装置中简单取下PCR管，倒置，使盖中所含的干燥PCR引物重新溶解，从而其能用于随后的PCR反应。随后在95°C温育12分钟，以活化包含在QuantiTect多重RT-PCR主混合物中的HotStarTaqDNA聚合酶。此处选择3分钟的较短再活化时间，因为反应混合物已为灭活聚腺苷酸聚合酶和反转录酶而在95°C加热了3分钟。然后是45轮PCR:94°C、15秒，52°C、30秒(见表46)，以在实时PCR中扩增产生的let7a-cDNA。利用UniGAPdT引物的5，-尾的特异性荧光标记探针进行检测。记录52°C退火/延伸步骤期间的荧光数据。用AppliedBiosystems7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)进行该“三合一”反应，反应体积为20μ1。实施例9用PCR“热启动”引物进行本发明的“三合一”方法，其目的在于促进结合三-步方法的反应的特异性。作为对照，基于图IB进行两-步方法的反应。用表47所示材料设置反应，如表48所示。表47聚腺苷酸反应，反转录和PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表48=QuantiTect多重RT-PCR主混合物(恰根公司)中的PAP+RT反应+PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表49“三合一”反应的反应方案<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>模型样品由具有mleu7amiRNA的序列的RNA寡核苷酸组成。该样品在玉米RNA的背景上接种。一式三份地进行反应测试。为此，如表48所述将表47所示试剂一起移入，如表49所述进行反应。反应方案首先包括聚腺苷酸聚合酶和用QuantiTect多重反转录酶混合物的反转录的组合反应条件(45分钟，37°C和15分钟，50°C)。然后，在95°C温育15分钟来活化包含在QuantiTect多重RT-PCR主混合物中的HotStarTaqDNA聚合酶。然后是45轮PCR941、15秒，521、30秒(见表49)，以在实时PCR中扩增产生的let7a_cDNA。利用UniGAPdT引物的5’-尾的特异性荧光标记探针进行检测。记录52°C退火/延伸步骤期间的荧光数据。用AppliedBiosystems7500实时PCR系统(应用生物系统公司)进行该“三合一”反应，反应体积为20μ1。实施例10用PCR“热启动”引物进行本发明的“三合一”方法，其目的在于促进结合三_步方法的反应的特异性。作为对照，基于图IB进行两-步方法的反应。用表50所示材料设置反应，如表51所示。表50聚腺苷酸反应，反转录和PCR的材料<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表51=QuantiTect多重RT-PCR主混合物(恰根公司)中的PAP+RT反应+PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>对于leu7a是mleu7aIO9拷贝/μ2μ(2χ109拷贝)玉米RNA20ng/μmleu7aIO9拷贝/μ2μ(40ng)总体积__Ι20μ1表52“三合一”反应的反应方案聚腺苷酸反应和反转录45分钟，37。C-_PCR初始再活化95，15分钟__变性__15秒，940C45x退火/延伸30秒，52'C模型样品由具有mleu7amiRNA的序列的RNA寡核苷酸组成。该样品在玉米RNA的背景上掺加。一式三份地进行反应。为此，如表51所述将表50所示试剂一起移入，如表52所述进行反应。反应方案首先包括聚腺苷酸聚合酶和用QuantiTect多重反转录酶混合物的反转录的组合反应条件(45分钟，37°C)。然后，在95°C温育15分钟来活化包含在QuantiTect多重RT-PCR主混合物中的HotStarTaqDNA聚合酶。然后是40轮PCR:94°C、15秒，52°C、30秒(见表52)，以在实时PCR中扩增产生的let7a-cDNA。利用UniGAPdT引物的5，-尾的特异性荧光标记探针进行检测。记录52°C退火/延伸步骤期间的荧光数据。用AppliedBiosystems7500实时PCR系统(应用生物系统公司)进行该“三合一”反应，反应体积为20μ1。图1比较了本发明的单_步方法⑶和现有技术已知的两_步方法㈧。聚腺苷酸聚合酶本发明的具有聚腺苷酸化活性的酶；反转录酶本发明的具有反转录酶活性的酶；rATP核糖核苷酸，在本文中是例如腺嘌呤_5’-三磷酸；dNTP脱氧核糖核苷酸’寡聚dT尾引物锚定寡核苷酸，本发明有各种可能的实施方式；UniGAPdT引物锚定寡核苷酸的特定实施方式；尾作为锚定寡核苷酸任选部分的5’-尾；w按照本发明定义，通过聚腺苷酸化活性加上的均质多聚尾的长度(大于10-20个碱基)；x，y:按照本发明定义，本发明锚定寡核苷酸的3'-锚定序列的类型和长度；ζ定义为本发明锚定寡核苷酸的均质多聚部分的长度。图2图示了表6的Ct值的条件a)包含各情况下的模板，条件b)仅加入H2O而代替模板(PAP反应中的吐0)。在b)中，40轮PCR(进行的最大循环数)未得到信号，因此显不“无Ct”。图3显示了实施例1的实时PCR产物的琼脂糖凝胶分析。M:100bp梯(英杰公司，目录号15628-050)。2%琼脂糖用TAE中的溴化乙锭染色，作为运行缓冲液。加样图1号道标记；然后在各情况中彼此依次作3次测试:1a,lb,2a,2b,3a,3b,4a,4b0图4显示了实时PCR分析表8所述混合物的反应产物得到的Ct值的表格。对于3和6，40轮PCR(进行的最大循环数)未得到信号，因此显示为“无Ct”。图5图示了实时PCR分析表8所示混合物的反应产物得到的Ct值。图6显示了实时PCR分析表18所述混合物b)和e)的反应产物得到的Ct值的表格。在标准RT的2、4和5中，在38轮后最早检测到信号，或在2)中，无信号，因此显不为“无Ct”。图7显示了表18所示混合物b)和d)，表19只用一个引物的对照，混合物a)_d)的实时PCR结果的表格。40轮PCR(进行的最大循环数)未得到信号，因此显示为“无Ct”。图8显示了实施例3的实时PCR产物的琼脂糖凝胶分析。M:100bp梯(英杰公司，目录号15628-050)。2%琼脂糖，用溴化乙锭染色，用TAE作为运行缓冲液。图9显示了实时PCR分析表30所述的混合物la、b)和2a)、b)的反应产物获得的Ct平均值的表格。下部实时PCR分析表30所述混合物的反应产物获得的Ct平均值的图示。图10显示了实时PCR分析表36，1-5和表37，6_9所述混合物的反应产物获得的Ct平均值的表格。下部实时PCR分析表36，1-5和表37，6_9所述混合物的反应产物获得的Ct平均值的图示。图11显示所用核酸序列清单。图12显示本发明的锚定寡核苷酸。图13比较了本发明的单-步“三合一”方法⑶和现有技术已知的三_步方法(A)。聚腺苷酸聚合酶本发明的具有聚腺苷酸化活性的酶；反转录酶本发明的具有反转录酶活性的酶；rATP核糖核苷酸，本文中是例如腺嘌呤-5'-三磷酸；dNTP脱氧核糖核苷酸；寡聚dT尾引物锚定寡核苷酸，本发明有各种可能的实施方式例；UniGAPdT引物锚定寡核苷酸的特定实施方式；尾作为锚定寡核苷酸任选部分的5’-尾;w按照本发明定义，通过聚腺苷酸化活性加上的均质多聚尾的长度(大于10-20个碱基)；X，y:按照本发明定义，本发明锚定寡核苷酸的3'_锚定序列的类型和长度；ζ定义为本发明锚定寡核苷酸的均质多聚部分的长度。PCR引物用于特异性检测cDNA的至少一种寡核苷酸，任选至少一种探针；PCR酶能特异性检测样品所含cDNA的酶活性。图14显示了实施例7的反应混合物(对应于表41)和表42的反应混合物的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值表格。下部图示了实施例7中的反应混合物(对应于表41)和表42的反应混合物的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值。图15显示了实施例8中的反应混合物(对应于表44)和表46的反应混合物的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值表格。下部图示了“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值。图16显示了各种量(IOpg到Iyg)的miRNAeasyRNA，其在IOOng聚腺苷酸或聚(C)存在或不存在下用miScript反转录。得到的cDNA用于实时PCR；在这种情况下，测试7miR-16和let-7a。图17显示了各种量(IOpg到1μg)的miRNAeasyRNA,其在各种量的聚腺苷酸存在或不存在下用miScript反转录。得到的cDNA用于实时PCR；在这种情况下，测试了miR-16。图18显示了各种量(IOpg到Iyg)的miRNAeasyRNA，其在各种量的聚(C)存在或不存在下用miScript反转录。得到的cDNA用于实时PCR；在这种情况下，测试了miR-16。图19显示了使用IOpgmiRNAeasyRNA，其在50ng聚(C)存在或不存在下用miScriptRT试剂盒反转录。得到的cDNA用于实时PCR来检测GADPH。图20显示了各种量(I-IOOng)的miRNAeasyRNA的，其在各种量的聚(C)存在或不存在下用miScript反转录。得到的cDNA用于实时PCR，在这种情况下，测试GADPH。图21显示了利用10和IOOpgmiRNAeasyRNA，其在50ng聚(C)存在或不存在下用miScriptRT试剂盒反转录。得到的cDNA在实时PCR中测试，用于检测GADPH。图22显示了各种量(I-IOOng)的miRNAeasyRNA，其在各种量的聚(C)存在或不存在下用miScript反转录。得到的cDNA用于实时PCR；在这种情况下，测试了⑶C2。图23显示了用IngmiRNAeasyRNA，其在50ng聚(C)存在或不存在下用miScriptRT试剂盒反转录。得到的cDNA在实时PCR中测试，用于检测⑶C2。图24显示了实施例9中的反应混合物(对应于表48)和表49的反应混合物的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和利用热启动引物的实时PCR分析)的Ct平均值表格。下部图示了表48的反应混合物的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值。图25显示了实施例10中的反应混合物(对应于表51)和表52的反应混合物的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和利用热启动引物的实时PCR分析)的Ct平均值表格。下部图示了表51的反应混合物的“三合一”反应(即在一反应容器中联合聚腺苷酸聚合酶反应、反转录和实时PCR分析)的Ct平均值。权利要求一种在酶反应中合成样品的cDNA的方法，该方法的特征在于包括以下步骤a.同时提供具有末端转移酶活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、缓冲液、至少一种核糖核苷酸、至少一种脱氧核糖核苷酸、锚定寡核苷酸和扩增产生的cDNA的酶及试剂，b.加入包含核糖核酸的样品，和c.在一个或多个温度步骤中温育步骤a)和b)的物质，所述温度步骤的选择应使得所述第一种酶和所述第二种酶显示活性，然后扩增在该方法中如此产生的cDNA。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应还包括约65°C-95°C的较高温度的至少一个温度步骤。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，随后采用聚合酶链式反应扩增该方法中产生的cDNA，该反应包含随机引物和/或包含特异性引物和/或任选的一种或多种探针。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述末端转移酶活性是聚腺苷酸化活性。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包含核糖核酸，其选自下组原核生物RNA、真核生物RNA、病毒RNA、太古细菌-RNA、miRNA、snoRNA、mRNA、tRNA、通常非聚腺苷酸化的RNA和rRNA，以及它们的混合物。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述锚定寡核苷酸选自下组聚腺苷酸寡核苷酸、聚(C)寡核苷酸、聚(T)寡核苷酸、聚(G)寡核苷酸、聚(U)寡核苷酸、额外包含5'-尾的聚腺苷酸寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚(C)寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚⑴寡核苷酸，额外包含5'-尾的聚(G)和额外包含5'-尾的聚⑶寡核苷酸。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述锚定寡核苷酸的长度通常介于6-150个核苷酸之间并且任选在3’-端具有锚定序列。8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述锚定寡核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫代磷酸-脱氧核糖核酸、环己烯_核酸(CeNA)、N3‘-P5'-亚磷酰胺(NP)、或三环-脱氧核糖核酸(tcDNA)。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述核糖核苷酸选自下组腺苷-5'-三磷酸、胸苷-5'-三磷酸、胞嘧啶-5'-三磷酸、鸟嘌呤-5'-三磷酸、尿嘧啶-5'-三磷酸、含碱基类似物的核糖核苷酸，其中所述核糖核苷酸任选经修饰或作标记。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸选自下组脱氧腺苷-5'_三磷酸(dATP)、脱氧胸苷-5'-三磷酸(dTTP)、脱氧胞嘧啶-5'-三磷酸(dCTP)、脱氧鸟嘌呤-5‘-三磷酸(dGTP)、脱氧尿嘧啶-5‘-三磷酸(dUTP)，其中所述脱氧核糖核苷酸可任选经修饰或作标记。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸的标记物选自下组放射性标记物，例如32P、33P、35S、3H、荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、6_羧基荧光素(FAM)、咕吨、罗丹明、6-羧基-2'，4'，7'，4，7-六氯荧光素(HEX)、6_羧基-4‘，5'-二氯-2',7'-二甲基荧光素(JOE)、N，N，N',N'-四甲基_6_羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(R0X)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明110；香豆素，例如伞形酮，苯甲亚胺，例如Hoechst33258；菲啶，例如德克萨斯红、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、P卜啉染料、聚甲炔染料、花青苷染料，例如Cy3、Cy5,Cy7,BODIPY染料、喹啉染料和Alexa染料。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述修饰选自下组生物素化、洋地黄毒苷标记和半抗原。13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应中脱氧核糖核苷酸的浓度是至少0.OlmM和最多10mM。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP存在的浓度为0.2mM-2mM。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH为6-10并包含Mg2+离子。16.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述具有末端转移酶活性或聚腺苷酸化活性的酶选自下组原核生物来源、真核生物来源、病毒来源、太古细菌来源和植物来源的酶。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述具有聚腺苷酸化活性的酶是选自下组的酶大肠杆菌的聚腺苷酸聚合酶、酵母菌的聚腺苷酸聚合酶、牛的聚腺苷酸聚合酶、蛙类的聚腺苷酸聚合酶和人的聚腺苷酸聚合酶。18.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述具有反转录酶活性的酶选自下组病毒、细菌、太古细菌和真核生物的酶，特别是耐热生物的酶和只有通过改变它们基因序列的诱变或相应的缓冲液条件才能获得这种功能的酶。19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述具有反转录酶活性的酶选自下组HIV反转录酶、M-MLV反转录酶、EAIV反转录酶、AMV反转录酶、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)DNA聚合酶I>M-MLVRNA酶H(Superscript、SuperscriptII、SuperscriptIII)、Monsterscript(埃皮森特公司)、Omniscript、Sensiscript反转录酶(恰根公司)、ThermoScript和Thermo-X(均来自英杰公司)、AccuScript反转录酶(斯特拉塔基因公司)。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，步骤c)中物质的温育在一个或多个温度步骤中进行，所述温度步骤的选择应使得所述第一种酶和所述第二种酶显示活性。21.一种反应混合物，其包含具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、任选的缓冲液、任选的至少一种核糖核苷酸、任选的至少一种脱氧核糖核苷酸和任选的锚定寡核苷酸、任选的随机引物、任选的均质多聚核酸以及具有DNA合成活性的酶。22.如权利要求21所述的反应混合物，其特征在于，所述混合物包含具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、缓冲液、至少一种核糖核苷酸、至少一种脱氧核糖核苷酸、锚定寡核苷酸、任选的随机引物、任选的均质多聚核酸和具有DNA合成活性的酶、任选的至少一种特异性引物，其特征在于，扩增步骤所必需的组分，例如引物或具有DNA合成活性的酶任选处于同一容器中，但暂时无活性或首先在空间上与其它试剂隔开。23.一种装有如权利要求21或22所述反应混合物的试剂盒。全文摘要本发明涉及在酶促反应中合成样品的cDNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤同时提供具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、缓冲液、至少一种核糖核苷酸、至少一种脱氧核糖核苷酸、锚定寡核苷酸；加入包含核糖核酸的样品和在一个或多个温度步骤中温育以前步骤的物质，所述温度步骤的选择应使得所述第一种酶和第二种酶显示活性，其特征还在于在同一反应混合物中进行扩增。本发明还涉及包含具有聚腺苷酸化活性的第一种酶、具有反转录酶活性的第二种酶、任选的缓冲液、任选的至少一种核糖核苷酸、任选的至少一种脱氧核糖核苷酸、任选的锚定寡核苷酸和具有DNA合成活性的酶的反应混合物。文档编号C12Q1/68GK101802222SQ200880103457公开日2010年8月11日申请日期2008年2月13日优先权日2006年8月14日发明者C·科菲哈格,D·洛弗特,H·恩格尔,M·科鲁兹,S·耶拉米利申请人:恰根有限公司