含有糖结合模块以改变植物细胞壁的组成和结构或者增强降解作用的植物糖基水解酶的用途的制作方法

专利名称：含有糖结合模块以改变植物细胞壁的组成和结构或者增强降解作用的植物糖基水解酶的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有糖结合模块以改变植物细胞壁的组成和结构或者增强降解作用 的植物糖基水解酶的用途。
背景技术：
地球上最丰富的生物聚合物(即纤维素)的水解占据全球碳循环的中心 位置，并具有宽范围有机体分泌组的前纤维素水解酶，以分解这种复杂的不可溶的 底物。这些酶中研究得最明确的是内切-β-1，4-葡聚糖酶(也叫作EGase或纤 维素酶；EC3. 2. 1.4)，其已经在细菌、真菌、植物和动物中被识别和鉴定(Lynd等人 "Microbial Cellulose Utilization !Fundamentals andBiotechnology,，，Microbiol Mol Biol Rev 66:506—577(2002) ；Hilden 等人"Recent Developments on Cellulases and Carbohydrate-binding Moduleswith Cellulose Affinity, "Biotech Lett 26:1683-1693(2004) ；Libertini 等 K,"Phylogenetic Analysis of the Plant Endo-beta-1,4-glucanase GeneFamily"J Mol Evol 58:506-515(2004))。要特别注意的 是微生物EGase，这是因为它们在纺织品改造工业中的重要性，以及它们在处理木质纤维生 物质(biomass)中的潜在用途(Lynd 等人‘‘Consolidated Bioprocessing ofCellulosic Biomass :an Update, "Curr Opin Biotech 16 :577_583 (2005))，导致详细地了解它们的表 达、调节和酶的性质((Lynd 等人‘‘ConsolidatedBioprocessing of Cellulosic Biomass an Update，，，Curr Opin Biotechl6 :577_583 (2005) ；Rabinovich 等 A "The Structure and Mechanism ofAction of Cellulolytic Enzymes, " Biochemistry(Moscow) 67 850-871 (2002) ；Bayer等人"The Cellulosomes :Multienzyme Machines for Degradation ofPlant Cell Wall Polysaccharides, "Ann Rev Microbiol 58:521-554(2004))。此外， 详细的结构-功能研究已鉴别出有助于纤维素结合和水解的重要的结构特征。正如许多的糖基水解酶一样，微生物EGase通常具有模块式结构，包含至少一种 催化结构域(⑶)，通过柔性连接区以连接到单个或多个糖结合模块(CBM)上(Wilson等 人Adv Biochem Eng Biot 65:1-21(1999))。CBM结构上具有多种多样的非催化结构域， 且一般使蛋白靶向多糖底物，而且它们共同表现出一定范围的结合特性(Boraston等人 “Carbohydrate-binding Modules :Fine_tuning Polysaccharide Recognition，”Biochem J 382:769-781 (2004))。CBM使得酶结合到底物的表面，通过增大局部的酶的浓度来增强催化活性，且有可能破坏表面结构以得到更有效的催化作用((Linder等人“The Roles and Function of Cellulose-bindingDomains，，，J Biotech 57:15-28(1997))。还表明 CBM 能 使酶靶向特异性底物，甚至是微域(Boraston等人J Biol Chem 278:6120-6127(2002); Carrard ^A"Cellulose-binding Domains Promote Hydrolysis of Different Sites onCrystalline Cellulose, ” Proc Natl Acad Sci USA 97 10342-10347 (2000)) EGage 结合到纤维素被认为是在纤维素水解中的限制的步骤，因此，CBM是这些模块式的水解 纤维蛋白的重要组分(Jung 等人“Binding andReversibility of Thermobifida fusca Cel5A, Cel6B, and Cel48A and TheirRespective Catalytic Domains to Bacterial Microcrystalline Cellulose, ”Biotech Bioeng 84:151—159(2003))。 与这些微生物酶的详细的生物化学分析相比，植物EGase的体内底物和作用 机理还知道得非常少。已有报道使用可溶的人造纤维素衍生物的大多数的活性，例如 羧甲基纤维素(CMC)，但是只是很少的较详细的底物特性的研究没有显示共同的模型 (Libertini 等 A"Phylogenetic Analysis of thePlant Endo-beta-1,4-glucanase Gene Family，，，J Mol Evol 58:506-515(2004) ； Brumme 11 等人“Plant Endo-beta-1, 4-glucanase !Structure, Properties andPhysiological Function,，，Amer Chem Soc Symp Ser 566 100-129 (1994) ；Molhoj 等 A "Towards Understanding the Role of Membrane-boundendo-β-1,4-glucanases in Cellulose Biosynthesis,，，Plant Cell Physiol43 :1399-1406 (2002) ；Rose 等人 The Plant Cell Wall, Blackwell Publishing, pp. 264-324(2003))，多数同工酶表明出对不同级的可溶性的葡聚糖有优先的活性。然而， 重要且一致的结论是植物EGase不能降解结晶纤维素，其特征是已经很长一段时间归因于 植物EGase的不同的结构特征缺少CBM。植物EGase属于糖基水解酶家族9 (GH9)，并包括大的多基因家族(Coutinho， P. Μ.禾口 Henrissat, B. In "Recent Advances in CarbohydrateBioengineering,"H. J.Gilbert, G. Davies, B. Henrissat 禾口 B. Svenssoneditors, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, (1999) ；Henrissat 等 人"A Census of Carbohydrate-active Enzymes in the Genome ofArabidopsis thai iana,，，Plant Mo 1 Biol 47: 55-72(2001))，其分成不同的子家族(Libertini 等人“Phylogenetic Analysis of the PlantEndo-beta-1,4-glucanase Gene Family,"J Mol Evol 58:506-515(2004))。 α-和β-EGase都具有预期的向细胞壁分泌的N-末端信号序列，而Y-EGase具有连接 到长的N-末端延伸的GH9催化核心，并具有使蛋白锚定在质膜或胞内细胞器的膜扩展结 构域(Molhoj 等人"Towards Understanding the Roleof Membrane-bound endo-β-Ι, 4-glucanases in Cellulose Biosynthesis, "PlantCell Physiol 43 1399-1406(2002)； Robert 等 人"An Arabidopsisendo-1,4-β -D- glucanases Involved in Cellulose Synthesis UndergoesRegulated Intracellular Cycling. ,，，Plant Cell 17: 3378-3389(2005))。之前已经核实了西红柿EGase，最初叫作TomCel8，(Catala等人Plant Physiol 118 1535 (1998)),现在称作 Solanum lycopersicum Cel9Cl (SlCel9Cl)，其在 α-EGase中代表新的不同的结构亚类，且在多种植物种类中核实了直向同源物(Libertini 等人"Phylogenetic Analysis of the PlantEndo-beta-1,4-glucanase Gene Family J Mol Evol 58:506-515(2004) ；Catala 等人 Plant Physiol 118 1535(1998) ；Trainotti等人"A Novel E-typeendo-β-1,4-glucanase with a putative Cellulose-binding Domain is HighlyExpressed in Ripening Strawberry Fruits. ,，，Plant Mol Biol 40: 323-332(1999) ；Trainotti 等人"PpEG4 is a Peach endo-β -1,4-glucanase gene whoseExpression in Climacteric Peaches does not Follow a Climacteric Pattern,"J Exp Bot 57:589-598(2006) ；Arpat 等人"Functional Genomics of CellElongation in Developing Cotton Fibers, "Plant Mol Biol 54:911-929(2004)))。这些亚类的成员展 现出不同的模块结构，具有常见的N-末端信号肽和GH9催化核心，但还具有另外的不连续 的C-末端延伸部分，该部分通过富脯氨酸和羟氨酸的连接子区域与CD连接(图1A)。这 种C-末端模块具有记忆微生物CBM的特征，表明这种结构域可能连接到纤维素，尽管不存 在生物化学的证据来支持这种假设。产生重组SlCel9Cl的重复尝试已经表明它对水解的易感性，保持全长蛋白的特征。然而，本发明描述的双重策略以证明SlCel9Cl的C-末端模块与结晶纤维素结合，其 为植物中的第一个这样的例子。结果表明SlCel9Cl及直向同源物包括植物EGase的不 同亚类，其特征在于代表CBM的新家族的不同的C-末端结构域(指CBM49)。数据还表明 SlCel9Cl⑶能水解多种纤维的和非纤维的植物细胞壁底物，并且还讨论了 EGase的这种新 的结构亚类的潜在作用。本发明的目的在于克服现有技术中的上述的这些及其它的缺陷。

发明内容
本发明涉及包括核酸构建体的转基因植物细胞。所述的核酸构建体含有编码植物 内切-1，4- β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶的核酸分子，其中植物内切-1， 4_ β _木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶各自具有模块式的糖结合模块和/或编 码组成型的催化结构域的区域和/或单个或多个模块式的糖结合结构域。所述核酸构建体 还包括植物启动子和植物终止序列，其中植物启动子和植物终止序列可操作性地与核酸分 子偶联，且至少植物启动子或植物终止序列之一与该核酸分子异源。本发明还涉及转基因植物的生产方法。该方法包括提供含有植物内切-1， 4- β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶核酸分子的核酸构建体，其中植物内 切-1，4- β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶各自具有模块式的糖结合模块和 /或编码组成型催化结构域的区域和/或单个或多个模块式的糖结合结构域。所述核酸构 建体还包括植物启动子和植物终止序列，其中植物启动子和植物终止序列可操作性地与核 酸分子偶联，且至少植物启动子或植物终止序列之一与该核酸分子是异源的。生产转基因 植物的方法还包括用核酸构建体转化植物细胞以生成转基因植物细胞，以及从转基因植物 细胞繁殖转基因植物。本发明的另一方面涉及多糖解聚的方法。该方法包括提供植物酶，其选自植物内 切-1，4-β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4-β -葡聚糖酶及其混合物或催化结合结构域。 植物内切-1，4- β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶各自具有糖结合结构域， 或编码组成型催化结构域的区域和/或单个或多个模块式的糖结合结构域。该方法还包括 在对生物质的多糖解聚有效的条件下，用生物质培养植物酶。本发明的另一方面涉及能够承受增强的多糖解聚作用的植物的识别方法。该方法包括提供候选植物的集合并测定候选植物集合的生物质的量和/或消化能力。在测定的集 合中的生物质的量和/或消化能力增加的植物作为能够承受增强的多糖解聚作用的候选 植物。本发明还涉及能够承受增强的多糖解聚作用的植物的生产方法。该方法包括提供植物的集合，并在植物集合中诱导突变以生产突变植物的集合。对突变植物的集合的生物 质的量和/或消化能力进行测定。与集合中的其它植物相比，在测定的突变植物集合中，相 对于非突变植物具有增加的生物质的量和/或消化能力的植物作为能够承受增强的多糖 解聚作用的候选植物。许多的微生物内切-1，4_β-葡聚糖酶(EGase，或纤维素酶)具有糖结合模块 (CBM)，其需要有效的结晶纤维素降解。然而，CBM不存在于目前已经用生化鉴定的植物 EGase中，因此，植物EGase通常不认为具有降解结晶纤维素的能力。本发明识别了西红柿 即番茄(Solarium tycopersicum) Cel8 (SlCel9Cl)的EGase的生物化学特征，其具有与代 表之前未鉴定的CBM家族的不同的C-末端非催化模块。体外结合研究表明所述的模块实 质上连接到结晶纤维素上并能够作为部分的重组嵌合蛋白类似地结合，该蛋白含有细菌嗜 高温放线菌(Thermobifida fusca)的EGase催化结构域(⑶)。定点突变研究表明色氨 酸559和573在结晶纤维素结合中起作用。代表新CBM家族(CBM49)的SlCel9Cl CBM是 植物EGase的新结构亚系(C系)的限定特征，其成员分布在整个植物界中。此外，也表明 SlCel9Cl CD能水解人造纤维素聚合物、纤维素低聚糖和多种植物细胞壁多糖。


图1所示为在植物家族9糖基水解酶中的结构和序列变化；图IA所示为模块结 构的示意性的展示图细胞质结构域(深灰色)、跨膜结构域(白色)、信号序列(黑色)、 GH9催化结构域(浅灰色)、连接子区域(粗黑线)、糖结合模块(六边形)；结构亚类由 TomCe 13 (A 类，U78526)、TomCell (B 类，U13054)和 SlCel9Cl/TomCel8 (C 类，AAD08699) 表示；图IB所示为SlCel9Cl的C-末端110氨基酸的SlCel9Cl氨基酸序列对比，所述的 SlCel9Cl含有从其它植物物种选择的直向同源物和从C. fimi木聚糖酶IOA选择的家族 2CBM ；三个保守的表面暴露的Trp残基(对应于C. fimi的CBM2a中的W17、W54和W72) 用星号标记；CBMs 包含S1 (SlCel9Cl, AAD08699)、At (拟南芥(Arabidopsis thaliana)、 Atlg64390) > Os ( 7jC 禾g (Orzya sativa)、NM_188491)、Pp ( /]、 AL % W- (Physcomitrella patens)、BJ591253)、Cf (粪碱纤维素单胞菌(Cellumonas fimi) ；Cex、XynlOA、AAA56791)。图2所示为纯化的Cel6/Cel9Cl融合蛋白与纤维素底物的结合。图2A表示用 不同浓度的 BMCC 培养的 Cel6/Cel9Cl 融合蛋白(FP，A ) > T. fuscaCel6A(TfCel6A, O ) 和Τ. fusca Cel6A⑶(TfCel6A⑶，■)；误差条表示三次反应的标准偏差；图2B表示用 不同浓度的微晶纤维素培养的Cel6/Cel9Cl融合蛋白(FP)、T. fusca Cel6A(TfCel6A)和 Τ. fusca Cel6A⑶(TfCel6A⑶)，培养后的结合或未结合的蛋白用SDS-PAGE分离；显示分子 量标记(KDa)。图3所示为SlCel9Cl糖结合模块的定点突变；图3A表示SlCel9ClCBM的分子模 型，突出了提议的突变形成的功能上重要的残基；影像包括在NMR模板、IEXG上(红色)的 最好的SlCel9Cl CBM模型(蓝绿色)的Ca-原子的重叠；图3B表示GST-CBM与BMCC的结合；在25°C下，GST-CBM( )与0_3mg/ml的BMCC在3小时内的结合效率与单独使用 GST( A )进行对比；误差条表示三次反应的标准偏差；图3C表示与GST-CBM(WT)相比，在 25°C时，含有单个氨基酸置换的突变体与2mg/mlBMCC在3小时内的相对结合效率。
图4所示为反应温度和pH对SlCel9Cl活性的影响。重组SlCel9Cl⑶用(w/ ν)的CMC培养4小时，通过测定还原的糖的产量来测量其活性。图4A表示在缓冲液A中， 在指定的温度下测得的SlCel9Cl⑶的最适温度；图4B表示在缓冲液A中，在pH4_8的范 围内测得的最适PH ；误差条表示三次反应的标准偏差。图5所示为在聚合的多糖底物上的SlCel9Cl⑶的底物特性；用ABN，阿拉伯聚糖； XG，木葡聚糖；低粘度的CMC，LVC ；中粘度的CMC，MVC ；AX阿拉伯木聚糖；MLG大麦(1，3) (1， 4)-3-0-葡聚糖来培养重组的51&19(1 CD，4小时后，在37°C和pH 6.0下，测量还原的糖； 误差条表示3次试验的标准偏差。图6所示为纤维低聚糖的SlCel9Cl⑶消化产物的薄层色谱(TLC)；通道1，标准 糖葡萄糖(Gl)、纤维二糖(G2)、纤维三糖(G3)、纤维四糖(G4)和纤维五糖(G5)；通道2_6， 在37°C时，用SlCel9Cl⑶处理2小时后的1. 5mM G2-G6 ；G6和G7分别为纤维六糖酶和纤 维七糖酶。图7A-B表示源自野生型(图7A)和转基因植物(图7B)的拟南芥茎的X射线宽角 衍射；用20 μ m, IOKeV的光束([λ ] = 1. 35Α)得到衍射模型，样品与探测器的距离为86mm ； 使用程序Fit2D分析峰值积分；样品表明赤道衍射峰值，200、110、1-10 (某种程度上重叠) 和用于计算的经线峰值002。
具体实施例方式本发明涉及包括核酸构建体的转基因植物细胞。所述核酸构建体含有编码植物内 切-1，4-β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4-β -葡聚糖酶的核酸分子，其中植物内切-1， 4_ β _木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶各自具有模块式的糖结合结构域，或编 码组成型催化结构域的区域和/或单个或多个糖结合结构域。所述核酸构建体还包括植物 启动子和植物终止序列，其中植物启动子和植物终止序列可操作性地与核酸分子偶联，且 至少所述植物启动子或植物终止序列之一与该核酸分子是异源的。启动子可以是组成型启动子、组织特异性启动子(如植物的茎特异性)或者诱导 型启动子。编码植物内切-1，4- β -葡聚糖酶的核酸分子可以是At 1 g48930、At 1 g64390、 At4gll050、TomCe18,SlCel9Cl、SIGH9C1、0s04g0674800、0sGlu6、0s01g0220100、0sCel9A、 0sGlu5、0s01g0219600、0sCel9B或者0sGlu7。这些葡聚糖酶的更详细的名单如下含糖结合模块家族49的糖基水解酶家族9编码植物内切-β -1，4-木聚糖酶的核酸分子可以是At 1 g 10050、At 1 g58370、At4g08160、At2gl4690、At4g33860、At4g33810、At4g33840、At4g38650、At4g33820、 0s03g0672900或者PttXynlOA。这些木聚糖酶的更详细的名单如下
含有糖结合模块家族22的糖基水解酶家族10描述有机体 GI 登录号#PubMed克隆Pcpl"85E10，5^ 白杨 109627682 AC182710.2 DCEK^基因组ff^f的序列和其施福人类基因组中心73624748推定的木聚糖酶Xynl 烟草DQ152919. 1mRNA，完整的 cds推定的木聚糖酶Xyn273624750 DQ152920烟草mRNA，完整的 cds14778587518094749邻接的VV78X067077. 4，葡萄AM479759. 2全部的基因组鸟枪序列克隆pFL8341，4-3-D 木1486120811389760大麦AF287731. 1聚糖木聚糖水解酶mRNA，完整的 cds.(HordeumvuIgaresubsp.Vulgare)克隆pFL699 1,4-β -D14861198大麦AF287726. 111389760聚糖木聚糖水解酶基因，完整的cds.内切-1，4-β-木聚糖酶的71142587大麦AJ 49365.1 Van Canpenhout, S 和
X-II基因，外显子1-3，等位基因 HiroX-II.Volckaert, G. D 在 _大麦研究中的不同阶段的内切i-l，4- M糖酶同工酶X-I和X-II的不同^ii Plant Sci.169 (3)，512-522(2005)，其全部内容在 _内ΛΦ文中作为#%。大麦 1486119211389760克隆pFL400 1,4-β -DAF287723. 1木聚糖木聚糖水解酶mRNA，部分的 cds.大麦 71142585Van Caipenhout, S Plant内切-1，4-β-木聚糖酶AJ849364. 1Sci. 169 ⑶，512"522的χ-Ι基因，外显子(2005)，其_内Mlft纳A^文中作为参考。1-3，等位基因BetzesX-I.(1，4)-β-木聚糖内切水大麦 1718235U59312. 18914532解酶同工酶X-I mRNA，完整的 cds.木聚糖内切水解酶同工酶大麦 18135949065693U73749. 1X-I基因，完整的cds.内切-1，4-β_^^ 8|的 大麦 71142589Van Caipatout,SPlantAJ849366. 1x-II基因，外显子1-3，Sci. Iffl(3),512-522BetzesK-IL_，其織内纳ΛΦ文中作为#%。■体3上的来自克隆 蒺藜苜蓿 166788357Msen, CCU468275. 4ΜΤΗ2-119023 的 DNA 序列，(Medicago 158935745.完整的序列truncatula)内切木聚糖酶番木瓜 23429644AANlO 199. 1(Caricapapaya)糖苷水解酶家族10;类似蒺藜苜蓿92868656ABE78655. 1半乳糖结合的
糖苷水解酶，家族10;蒺藜苜蓿92891089ABE90631. 1类似半乳糖结合的推定的1，4-β-D 木聚糖水稻(Oryza 38175736BAC57375. 2木聚糖水解酶sativaJaponicaGroup)0s07g04567007_K 稻11361109716100779BAF21475. 1'推定的 1，4-β-D 木聚水稻55168219AAV44085. 1糖木聚糖水解酶''推定的 1，4-β-D 木聚水稻55168259AAV44125. 1糖木聚糖水解酶'[水稻0s05g0319900水稻11357873816100779BAF17101. 10s05g0304900^K稻11357869616100779BAF17059. 1推定的内切-1，4_β-木7jC稻1552860412447438BAB64626. 1聚糖酶X-I推定的(1，4)-β-^^糖7jC稻5379217512447438BAD52808. 1内切水解酶0s01g0134900/K 稻11353147816100779BAF03861. 1推定的1，4-β-木聚糖酶19920133水稻ΑΑΜ08565. 1推定的1，4-β-木聚糖酶水稻20087079ΑΑΜ10752. 1推定的1，4-β-減糖酶 7ΥΜ31431438Buell, GR , et al.AAP53219. 1Sciaice 300,156^-1569_，其麵内 W 纳ΛΦ文中作为#%。1，4-β-^^ 糖酶， 推定 7jC 稻7870832112791992ABB47296. 1
的0sl0g0351600水稻11363902316100779BAF26328. 1 推定的1，4-β-木聚糖酶水稻19920134ΑΑΜ08566. 1假设的蛋白水稻 20087080 ΑΑΜ10753. 11，4-β _ 木聚糖酶，推定 水稻11028894212791992ΑΑΡ53220. 2的，表达的0sl0g0351700水稻11363902416100779BAF26329. 1s03g02018007_K 稻11354777116100779BAFl 1214. 1推定的内切-1，4-β-木水稻1552860212447438ΒΑΒ64624. 1聚糖酶X-I推定的(1，4)-β-木聚糖水稻5379217412447438BAD52807. 1内切水解酶0s01g0134800水稻11353147716100779BAF03860. 1推定的1，4-β-木聚糖酶小麦40363757BAD06323. 1(Triticumaestivum)本发明还涉及转基因植物的生产方法。该方法包括提供含有编码植物内切-1， 4_ β-木聚糖酶(糖基水解酶家族10)和/或植物内切-1，4-β-葡聚糖酶(糖基水解酶 家族9)的核酸分子的核酸构建体，其中植物内切-1，4-β -木聚糖酶和/或植物内切-1， 4- β -葡聚糖酶各自具有模块式的糖结合模块，和/或编码组成型催化结构域的区域和/或 单个或多个模块式的糖结合结构域。所述核酸构建体还包括植物启动子和植物终止序列， 其中植物启动子和植物终止序列可操作性地与核酸分子偶联，且至少所述植物启动子或植 物终止序列之一与核酸分子是异源的。生产转基因植物的方法还包括用核酸构建体转化植 物细胞以生成转基因植物细胞，以及从转基因植物细胞繁殖转基因植物。本发明的核苷酸序列可以插入许多可利用的表达载体和使用本领域熟知的试剂 的细胞系统中的任何一个。合适的载体包括但不限于以下的病毒载体，例如λ载体系统 gtll、gt WES. tB,Charon 4，以及质粒载体，如 pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、 pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKClOl、SV 40、pBluescript II SK+/-或者 KS+/-(参见‘‘Stratagene Cloning Systems" Catalog (1993) from Stratagene, La Jolla, CA,其整体并入本文中作为参考)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(参见F. W. Studier等人"Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression ofCloned Genes，”Gene Expression Technology第185卷(1990)，其整体并入本文中作为参考)，及其任意的衍生物。重组分子 可通过转化而导入细胞中，尤其是经过传导、结合、移动或电穿孔。使用现有技术中的标准 的克隆程序将DNA序列克隆进载体中，这些技术见于Sambrook等人MolecularCloning =A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor Press，NY(1989)，禾口 Ausubel，F. Μ·等人 (1989)Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 其全部内容并入本文中作为参考。在制备表达的核酸载体中，各种核酸序列可正常地插入或置换进入细菌质粒中。 可采用任何方便的质粒，其将通过具有细菌复制系统、允许在细菌中选择的标记以及通常 一个或多个独特的方便定位的限制性位点进行鉴定。提及的作为转化载体的多种质粒可 用于植物的转化。载体的选择取决于优选的转化技术和转化的靶向物种。使用导致冠瘿病 的土壤传播的细菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，很多载体可用于稳定转化。 冠瘿病的特征是受感染植物的下茎和主根上发展的肿瘤或瘿。这些肿瘤是由于部分细菌质 粒DNA转移或并入植物染色体的DNA中。这种移转的DNA(T-DNA)与植物细胞的正常基因 一起表达。“肿瘤诱导质粒”的质粒DNA、pTi或Ti-DNA含 有将T-DNA移入植物中的必要的 病毒(vir)基因。T-DNA运载编码涉及植物调节因子和细菌的营养(冠瘿氨基酸)的生物 合成中的蛋白的基因。T-DNA由两个25bp不完整的称作“边界序列”的同向重复序列限定。 通过移除致癌基因和冠瘿氨基酸基因，并用目的基因将它们取代，有可能将外源DNA转入 植物中，而元需肿瘤的形成或根癌农杆菌的增殖。Fraley等人“Expression of Bacterial Genes in Plant Cells, "Pro. Nat' IAcad Sci USA 80 :4803_4807 (1983)，其全部内容并入 本文中作为参考。该技术的进一步的改进引起双元载体系统的发展(Bevan，Μ.， "BinaryAgrobacterium Vectors for Plant Transformation,，，Nucleic Acids Res. 12 8711-8721 (1984)，其全部内容并入本文中作为参考)。在这个系统中，所有的T-DNA序列 (包括边界)都从PTi移除，且含有T-DNA的第二载体的被引入根癌农杆菌中。这种第二 载体的优点是可在E. coli和A. tumefaciens中复制，并含有促进转基因克隆的多克隆位 点。经常使用的载体的例子是pBinl9。Frisch等人“Complete Sequence of the Binary VectorBinl9, ” Plant Molec. Biol. 27 :405_409 (1995)，其全部内容并入本文中作为参考。 任何现在知悉的或以后描述用于遗传转化的合适的载体都适合于用于本发明中。Cohen和Boyer的美国专利4237224描述了使用限制酶裂解和使用DNA连接酶连 接以生产重组质粒形式的表达系统，其全部内容并入本文中作为参考。接着，通过在包括在 组织培养中生长的原核生物和真核细胞的单细胞培养中的转化和复制以引入这些重组的 质粒。某些“控制元件”和“调节序列”也并入载体构建体中。这些包括载体的非翻译区、 启动子、5'和3'未翻译区，该5'和3'未翻译区与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和 翻译。这些元件的强度和特异性是可以改变的。视使用的载体系统和宿主而定，可以使用 任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型或诱导型的启动子。组成型启动子是在生物体的发展和生命周期中引导基因表达的启动子。一些广泛 用于诱导转基因表达的组成型启动子的例子包括来自于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(NOS)基因启动子(Rogers等人的美国专利5，034，322，其全部内容并入本文中作为参考)、花椰 菜花叶病毒(CaMV) 35S和19S启动子(Fraley等人的美国专利5，352，605，其全部内容并入 本文中作为参考)、源自几个肌动蛋白基因中的任意一个的那些，已知它们在多数细胞类型 中表达(Privalle等人的美国专利6，002, 068，其全部内容并入本文中作为参考)、以及泛 素启动子，其是已知的聚集在许多细胞类型中的基因产物。
诱导型启动子是响应诱导剂能够直接地或间接地激活一个或多个DNA序列或基 因的转录的启动子。在没有诱导剂的情况下，DNA序列和基因将不会被转录。诱导剂可以 是化学剂，如代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或者是直接施加在植物上的生理 应激反应，如冷、热、盐、毒素或通过病原体或致病剂(如病毒或真菌类)的作用。含有诱 导型启动子的植物细胞可通过将诱导剂外部施用于细胞或植物上以暴露给诱导剂，例如通 过喷洒、浇水、加热或通过暴露给可操控的病原体。用于本发明的合适的诱导型启动子的 例子是糖皮质激素-诱导的启动子(Schena等人“ASteroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells, "Proc Natl AcadSci USA 88 :10421-5 (1991)，其全部内容 并入本文中作为参考)。当使转基因植物与纳摩尔浓度的糖皮质激素接触或通过与地 塞米松，一种糖皮质激素类似物接触时，在转化的植物中诱导转基因编码的蛋白的表达。 Schena 等人 “A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells，，，Proc NatlAcad Sci USA 88 10421-5 (1991) ；Aoyama ^A "A Glucocorticoid-MediatedTransc riptional Induction System in Transgenic Plants,”Plant J. 11 605-612(1997), VX 及 McNellis 等人“Glucocorticoid-Inducible Expressionof a Bacterial Avirulence Gene in Transgenic Arabidopsis InducesHypersensitive Cell DeathiPlant J. 14(2) 247-57(1998)，其全部内容并入本文中作为参考。此外，诱导型启动子包括那些启动子，即 其具有在选定的植物组织内以组织特异性的方式来调节目的基因的作用。这种组织特异性 或可发展地调节的启动子的例子包括种子、花、水果或根特异性的为本领域熟知的启动子 (Shewmaker等人的美国专利5，750，385，其全部内容并入本文中作为参考)。在本发明的优 选的实施方式中，异源的启动子连接到构建体的核酸上，其中“异源启动子”限定为构建体 的核酸本质上不与之连接的启动子。发明的核酸构建体还包括可操作的3’调节区，其选自那些能够提供mRNA的正 确的转录终止和多聚腺苷酸化以在选择的宿主细胞中表达并可操作性地连接到本发明的 改造的特征核酸分子上。业已知道3’调节区的数量在植物中是可操控的。例示性的3’ 调节区包括但不限于胭脂碱合成酶(“職，，)3，调节区(Fraley等人“Expression of Bacterial Genes in PlantCells,"Proc. Nat' 1 Acad. Sci· USA 80 :4803_4807(1983)，其 全部内容在此并入本文中作为参考)和花椰菜花叶病毒(“CaMV”)3’调节区(Odell，等人 “Identification of DNA Sequences Required for Activity of theCauliflower Mosaic Virus 35S Promoter, "Nature 313(6005) :810_812 (1985)，其全部内容在此并入本文中作 为参考)。事实上，在植物中已知的可操控的任意的3’调节区会满足本发明的核酸的编码 序列的正确表达。使用熟知的分子克隆法可将上述不同的组分连接在一起以生成含有本发明的核 酸构建体的表达系统，这些方法记述于Sambrook等人MolecularCloning =A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor 出版社，NY(1989)，和 Ausubel 等人(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons， New York, N. Y.，巾，胃i胃内· 在此并入本文中作为参考。本发明的核酸构建体设定成编码可翻译的RNA分子。其结果是，那些RNA分子 将在核糖体处翻译以生成由核酸构建体编码的蛋白。可通过连接克隆的基因增加以这种 方式生成的蛋白，其中所述的基因用代表病毒调节序列(即a 5’未翻译的序列)的合成 双链寡核苷酸编码目的核酸构建体Gehrke的美国专利4，820，639，和Wilson的美国专利 5，849，527，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。一旦制备了本发明的核酸构建体，就要准备并入宿主细 胞中。因此，本发明的另一 方面涉及含有核酸构建体的重组宿主细胞，其中所述的核酸构建体具有一个或多个本发明 的优化的植物核酸分子。基本上，在有效地产生宿主细胞中的核酸分子的转录的条件下，通 过用本发明的核酸构建体转化宿主细胞来实现该方法，其使用的是本领域已知的标准克隆 方法，例如 Sambrook 等人记述的 Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringsLaboratory, Cold Springs Harbor, New York(1989) ,^^^ ^ Λ^Λ^ Φ 作为参考。合适的宿主细胞包括但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、植物等 等。优选宿主细胞是细菌细胞或植物细胞。转化方法可导致核酸在启动子的控制下进行暂 时或稳定的表达。作为转化结果优选本发明的核酸构建体稳定地插入重组植物细胞的基因 组中，尽管暂时表达可用于重要的目的，尤其是调研中的植物正在缓慢生长中。适合于转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、合子和体细胞胚、愈伤组 织、原生质体、雄穗、花粉、胚芽、花药，等等。选择的转化方式是最适合于待转化的组织的方 式。植物组织中的暂时表达通常通过粒子轰击实现(Klein等人，“High-Velocity Microprojectiles for Delivering Nucleic Acids Into Living Cells，，，Nature 327 70-73(1987)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。在该方法中，将钨或金的微粒(直 径1-2μπι)涂在目标NDA上，接着在组织处使用高压气体轰击。采用这种方式有可能将外 源DNA输送入到细胞核中，并在组织的当前条件下得到基因的短暂表达。也可将生物活性 的粒子(如含有载体和异源DNA的干的细菌细胞)推入植物细胞中。也可以使用现在已知 的或以后新开发的粒子轰击的其它变型。稳定地将核酸构建体引入植物细胞的合适的方法是使用之前用核酸构建体转化 的根癌农杆菌或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)以感染植物细胞。如前所述， 农杆菌(Agrobacterium)的Ti (或RI)质粒能够很成功地将外源核酸分子转移到植物细胞 中。使用将耐受性赋予病原体的基因以转化植物细胞的另一方法是宿主细胞的粒子轰击 (也称作生物射弹转化)，其描述于美国专利4，945，050,5, 036，006和5，100，792中，这些 者β属于Sanfor等人，且在Emerschad等人“Somatic Embryogenesis and PlantDevelopment from Immature Zygotic Embryos of Seedless Grapes (Vitisvinifera)" Plant Cell Reports 14:6-12(1995)中有描述，所有的这些文献都并入本文中作为参考。然而，其它的 引入方法是用其它实体(如微细胞、细胞、溶酶体或其它了融合的脂质体表面的实体)来融 合原生质体(Fraley等人Proc Natl Acad Sci USA 79 :1859_63 (1982)，其全部内容纳入本 文中作为参考)。核酸分子也能通过电穿孔的方式而被引入植物细胞中(Fromm等人Proc Natl Acad Sci USA 82 :5824(1985)，其全部内容纳入本文中作为参考)。在这种技术中，在含有表达盒的质粒的存在下使植物原生质体电穿孔。高场强度的电脉冲可逆地透化生物 膜，使得质粒引入。电穿孔的植物原生质体使细胞壁重组，分开并再生。转化的精确方法对 本发明的实现并不重要。任何能导致选择的宿主细胞的高效转化的方法都可用于本发明 中。
转化之后，必须再生转化的植物细胞。从培养的原生质体的植物再生记载于Evans 等人的 Handbook of Plant Cell Cultures，卷 1 : (MacMillanPublishing Co. , New York, 1983) ；Vasil LR.(编辑)，Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press，Orlando，卷 I，1984，和 Vol. 111(1986)，以及 Fitch 等人〃 Somatic Embryogenesis and PlantRegeneration from Immature Zygotic Embryos of Papaya (Carica papayaL.)，“ Plant Cell Rep. 9 :320 (1990)，其全部内容纳入本文中作为参考。再生的方式因植物的种类不同而变化，但是通常首先提供的是转化的原生质体的 悬浮物或含有外植体的皮氏培养皿。形成愈伤组织，且从愈伤组织诱导出幼苗，继而生出 根。或者，在愈伤组织中可诱导胚芽的形成。这些胚芽像自然的胚芽般发育成植物。培养 基通常含有各种氨基酸和激素，如茁长素和细胞分裂素。高效的再生取决于培养基、基因型 以及培养的历史。如果控制了这三个变量，那么再生是可再现和可重复的。较佳地，转化的细胞首先用选择标记识别，同时将标记随本发明的核酸构建体一 起引入宿主细胞中。合适的选择标记包括但不限于编码以耐受抗生素的标记，如对卡那霉 素有耐受性的 nptll 基因，(Fraley 等人 Proc NatlAcad Sci USA 80:4803-4807(1983)， 其全部内容纳入本文中作为参考)，和耐受庆大霉素、G418、潮霉素(hygromycin)、链霉素、 奇霉素(spectinomycin)、四环素、氯霉素等的基因。细胞或组织在含有合适的抗生素的选 择的培养基上生长，其中通常仅仅是表达抗生素耐受性标记的那些转化物继续生长。其它 类的标记物也适合于包含在本发明的表达盒中。例如，编码以耐受灭草剂(如耐受磺脲) 的基因是有用的，或者dhfr基因，其对甲氨喋呤具有耐受性(Bourouis等人EMBO J 2 1099-1104(1983)，其全部内容纳入本文中作为参考)。类似地，编码酶类以提供生成可识 别的化合物的“报告子基因”也是适合的。基因融合实验中最广泛地使用的报告子基因已 经是UidA，其是一种来自编码β葡萄糖苷酸酶蛋白的大肠杆菌(Escherichia coli)的基 因，也禾尔作 GUS0 Jefferson 等人"GUS Fusions [beta]Glucuronidase as aSensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants，”EMB0 J6 :3901_3907 (1987)，其全部 内容纳入本文中作为参考。类似地，提供生成可发光识别的化合物的酶类(如荧光酶素) 也是有用的。这些选择标记物的使用取决于目标物种，对于某些目标物种，最好使用不同的 抗生素、灭草剂或生物合成选择标记物。然后，使用包含在用于转化的给定盒的病毒基因的特异性探针，通过Southern blot杂交分析来测试根据抑制剂或其它选择的标记物选择的植物细胞及组织的病毒基因 的获得(Sambrook 等人"Molecular Cloning ALaboratory Manual "Cold Spring Harbor, New York =Cold Spring HarborPress (1989)，其全部内容纳入本文中作为参考)。在含有本发明的核酸构建体的融合基因稳定地并入转基因植物后，所述转基因可 通过有性杂交转移到其它的植物中。可使用任意的一些标准的繁殖技术，这取决于杂交的 物种。一旦产生了这种类型的转基因植物，就可以根据常用的方法栽培植物本身，以至于核 酸构建体存在于得到的植物中。或者，从转基因植物回收转基因种子。然后这些种子可种植在土壤中，再使用常用的方法栽培，最后得到转基因植物。本发明可与多种植物或其种子联合使用。合适的植物包括双子叶植物和单子叶植 物。可用的庄家类植物包括苜蓿、谷物、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、土豆、 甘薯、豆类、豌豆、菊苣、莴苣、菊苣、卷心菜、抱子甘蓝(brussel sprout)、甜菜、欧洲防风 草、芜青、花椰菜、西兰花、芜青、小萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、笋瓜、 南瓜、绿皮密生胡瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、山酶、菠萝、黄豆、烟草、西红 柿、高粱、木瓜、杨树、柳树、甘蔗、芒草和多年生草如柳枝稷、东方Y草、蓝色粗茎杆的草、 芦苇草和印度草。生物质包括含有纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质和碳水化合物(如淀粉和糖) 的材料。通常形式的生物质包括树、灌木和草、玉米和玉米壳以及城市固体废物、废纸和庭 院废物。淀粉、糖和蛋白质含量高的生物质如玉米、谷物、水果和蔬菜通常用作食物消耗。相 反，纤维素、半纤维素和木质素含量高的生物质不容易消化，因此主要用于木和纸品、燃料 或处理掉。乙醇和其它的化学发酵产物通常由糖制备而来，所述的糖源自淀粉和糖含量高 的原料，如玉米。农业生物质包括植物枝条、矮树丛、茎、玉米和玉米壳、能源植物、森林、水果、花、 谷物、草、草本植物、叶子、树皮、针叶、圆木、根、树苗、短期轮作木本作物(short rotation woody crops)、灌木、轮换草、树、蔬菜、蔓藤以及硬和软木(不包括含有有害材料的木头)。 此外，农业生物质包括在农业生产中(包括农耕和造林活动)产生的有机废物，尤其包括森 林木头废料。农业生物质可以是任意前述的单独物或组合物或其混合物。生物质包括原始生物质和/或非原始生物质，如农业生物质、商业生物质、建造及拆卸废料、城市固体废物、废纸和庭院废物。本发明涉及破碎或打碎的植物材料。术语糖化作用是指将复合的碳水化合物(如淀粉或纤维素)分解成它的单糖组分 的过程。术语多糖是指含有重复的糖单元的聚合物，包括淀粉、聚葡萄糖、木质纤维素、纤 维素及这些物质的衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、醋 酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸丙酸纤维素、淀粉和淀粉酶衍生物、胶淀粉及其衍生物以 及其它的化学和物理改造的淀粉)等等。解聚可通过化学或物理技术来实现，包括Y射线辐射、臭氧和UV射线的组合、超 声波降解、机械压力、加热或酸水解。多糖解聚可以是将高分子量的多糖到较低分子量的改造。可使用一系列的技术来解聚植物细胞壁的多糖(包括纤维素和半纤维素)。这 些技术揭不于 Lynd 等人的 “Consolidated Bioprocessing of CellulosicBiomass An Update, ” Curr Opin Biotechnol 16 577-583 (2005) ；Himmel 等人 ^"Biomass Recalcitrance-Engineering Plants and Enzymes for BiofuelsProduction，，，Science 315 :804-807(2007)，其全部内容纳入本文中作为参考。本发明的焦点是通过在解聚之前 改造植物细胞壁的组合物和/或通过将本文所述的蛋白质加入到细胞壁中来增强多糖的 解聚。解聚方法(通常也称作糖化作用)一般是酶解的，包括单独的糖基水解酶或其混合 物。一般来自微生物，但是本发明将等同地适应于任何现有的或者将来的可用于解聚多糖 的非-酶技术。
根据本发明的多糖解聚，可以进行发酵。发酵材料包括能够产生乙醇的任意的材 料或有机物。乙醇包括乙醇或乙醇与水的混合物。通常，发酵是天然的乙醇产生者的细菌、 酵母和真菌起作用的过程，其中，细菌如运动发酵单胞菌和大肠杆菌，酵母如酿酒酵母或木 糖发酵酵母。或者，可使用引入的工程有机物来发酵，其中所述的有机物以通过引入外源遗 传材料(如来自天然乙醇产生者的丙酮酸脱羧酶和/或脱氢酶基因)来产生乙醇。进一步， 产生乙醇的有机物的突变体和衍生物，如通过已知的遗传和/或重组技术产生的那些突变 体和衍生物，在增强和/或改变乙醇产量的基础上已经生产和/或选择突变体和衍生物。糖到乙醇或其它化学物质的发酵可使用生物催化剂在流化床生物反应器中完成， 如使用高浓度的固定的微生物。流化床生物反应器与反渗透过滤器以液体导通。微生物运 动发酵单胞菌的固定的浓度超过IOltl细胞/ml。然而，其它合适的微生物也可以用来产生 乙酉享，例如酉良酒酵母 (Saccharomycescedvisiae)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis) > ^flli'ff^fij (Saccharomyces uvarum,)禾口)feIif^fiJ (Saccharomyces bayginEis)。 "SJiMf 同的水状胶体凝胶形成固定材料，例如使用交联的角叉胶或直径为1. 0-1. 5mm凝胶球的改 造的骨凝胶。根据以下的参数操作流化床生物反应器温度约为25°C -约40°C，糖的浓度 范围为10% -20%，液体的流速范围约为0. 05-0. 5cm/秒。一旦发酵过程完成，就形成稀释的终产物(如乙醇)。合并随后的基于吸收的浓缩 步骤可用于浓缩稀释的终产物。在吸收的情况下，可使用与终产物有高亲和性的兼容的固 体吸收剂。这可通过使用双组分颗粒的流化床生物反应器完成，其使得同向或逆向流经生 物催化剂粒子的流化床的吸收剂粒子能将发酵和产品回收两个过程组合起来。双组分粒子 流化床生物反应器具有至少一个入口和至少一个出口。该方法的完整描述见于Scott等人 的美国专利5，270，189，其全部内容在此并入本文中作为参考。本发明的另一方面涉及生物质的一般的多糖解聚的方法。该方法包括提供植物 酶，其选自植物内切-1，4- β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶及其混合物。 所述植物内切-1，4- β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶各自具有糖结合结构 域，或编码组成型催化结构域的区域和/或单个或多个模块式的糖结合结构域。该方法还 包括在对生物质的多糖解聚有效的条件下用生物质培养植物酶。与上述大体相同的方式转 基因生成的酶可用于多糖的解聚。或者，这些酶可从植物中分离而来。本发明的另一方面涉及能够承受增强的多糖解聚的植物的识别方法。该方法包括 提供候选植物的集合并测定该植物集合的生物质的量和/或消化能力。在生物质的量和/ 或消化能力增加的测定的集合中的植物被认为是能够承受增强的多糖解聚的候选植物。在上述的方法中，识别植物的步骤是通过杂交或聚合酶链反应(PCR)进行的。根 据本发明，这些方法用来分析植物是否具有含糖结合结构域或编码组成型催化结构域的区 域和/或单个或多个模块式的糖结合结构域的内切-1，4- β _木聚糖酶和/或植物内切-1， 4-β-葡聚糖酶。原位杂交测定用来测量正常细胞和从组织样品得到的假想细胞的表达水平。标记 核酸序列能够检测和测量相对表达水平。通过比较正常细胞和从组织样品中得到的假想细 胞之间的表达水平，可通过基因产物降低的表达水平来识别适合于多糖解聚的植物。检测在多核苷酸样品中的给定序列的方法包括通过聚合酶链反应选择性的序 列扩增。PCR描述于Mullis等人的美国专利4，683，202和Saiki等人的“EnzymaticAmplification of Beta-globin Genomic Sequences andRestriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia，” Science230 :1350_1354(1985)，其全部内容在此并 入本文中作为参考。在此方法中，与选择的序列的相对端部分互补的引物与热循环联合用 于启动引物启动的复制的连续循环。扩增的序列可容易地通过多种技术识别。这种方法尤 其适于检测适于多糖解聚的植物。本发明还涉及能够承受增强的多糖解聚的植物的生产方法。该方法包括提供植物的集合，并在植物集合中诱导突变，以生成诱变植物的集合。测定诱变植物的集合的生物质 的量和/或消化能力。与集合中的其它植物相比，在测定的诱变植物的集合中具有相对于 非突变植物增加的生物质的量和/或消化能力的植物(具有编码模块家族10植物内切-1， 4- β -木聚糖酶和/或模块家族9植物内切-1，4- β -葡聚糖酶的核酸分子)作为是能够承 受增强多糖解聚的候选植物识别。如上所述，本发明涉及在植物集合中诱导突变以生成诱变植物的集合的方 法。突变相关的方法使用称为TILLING的方法(定向诱导基因组局部突变)，其依赖在 基因序列(基于PCR)水平筛选较大集合的突变体，然后评价随后从突变种子库中长大 的选择的突变植物。这个方法产生了大范围的突变等位基因，该方法快速且是自动化 的，且该方法适合于任何能被化学诱变的有机物(McCallum等人“Targeted Screening for Induced Mutations，” Nat Biotechnol 18(4) :455_457 (2000)，其全部内容在此 并入本文中作为参考)。TILLING也在McCallum等人的“Targeting Induced Local Lesions INGenomes(TILLING)for Plant Functional Genomics,，，Plant Physioll23 439-442(2000) ；Dillon ^ 人 ^"Domestication to Crop Improvement :Genetic Resources for Sorghum and Saccharum (Andropogoneae) ,，，Annalsof Botany 100 975-989(2007)中有记述，其全部内容在此并入本文中作为参考。实施例以下的实施例仅是用作阐述本发明的具体实施方式
，并不以任何方式限制本发明 的范围。实施例1-5的材料和方法TfCel6A CD :SlCel9Cl CBM 融合蛋白的表达E. coli 中的(Cel6/Cel9Cl FP)—为了形成 Τ. fusca TfCel6A CD :SlCel9Cl CBM 融合蛋白构建体，用PCR扩增SlCel9Cl CBM46 DNA序列(氨基酸500-607)(表1)，接着 用 Pstl 和 Xhol 消化。编码 TfCel6A CD (氨基酸 1-312)的 cDNA 记述于(Salminen，0· PhD Thesis, CornellUniversity, Ithaca, New York(2002)，其全部内容在此并入本文中)中， 其在pET 26b+载体(Novagen ；Madison, WI)中含有TfCel6A，所述载体经PCR(表1)扩增 并用EcoRl和Pstl消化。得到的cDNA片段连接到已经用EcoRl和Xhol消化的pET载体 中。表1克隆用的引物序列克隆用的引物序列 在30°C时，根据pET表达手册(Novagen ；Madison，WI)的规定，在含有60 μ g/ml卡 那霉素和0. 5%葡萄糖的M9基本培养基(6L)中用0. 5mMIPTG进行4小时诱导在BL21(DE3) 细胞中的Cel6/Cel8 FP的表达和分离外周胞质液体。将液体的最终浓度调到50mM MES，pH 6. 5 (缓冲液B)，应用到SP-S印harose柱中(GE卫生保健，Piscataway, NJ)，用线性梯度的 NaCl (在缓冲液B中的0-1. OM NaCl)洗脱蛋白。合并有EGase活性的片段，应用到HiTrap Butyl FF柱(GE卫生保健)中，且用线性梯度的硫酸铵(在缓冲液B中0. 9-0M)对融合蛋 白进行洗脱。SlCel9Cl CBM的分子蛋白建模使用MODELLER来构建SlCel9Cl CBM的所有原子结构模型(Sali等人 “Comparative Protein Modelling by Satisfaction of Spatial Restraints,"J Mol Biol 234 779-815(1993) ；Sali ^AWEvaluation of ComparativeProtein Modeling by MODELLER, "Proteins 23 :318_326 (1995)，其全部内容并入本文中作为参考)。从SPMS 的BLAST搜索中获得SlCel9Cl CBM的对比。从PDB中得到模板结构。通过移动在初始序列 对比中的缺失和插入以进行微小的手调，该初始序列对比落入邻近的环区的模板的α -螺 旋线和β-链中。谷胱甘肽S-转移酶-SlCel9Cl CBM融合蛋白的构建体以及定点突变pGEX表达系统用作SlCel9Cl CBM的定点。含有CBM(氨基酸526-625)的SlCel9Cl DNA序列的区域经PCR(表1)扩增，并与EcoRI/Sall-消化的pGEX_5X_l (GE卫生保健)相 连以生成 GST-S1 Ce 19C1 CBM (GST-CBM)。使用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)进行GST-CBM的定点突变。相关 PCR引物列于表2中。通过DNA测序(Cornell BRC ；Ithaca，NY)核实单个突变的存在，阳 性克隆进一步指定为 GST-CBM W522A、GST-CBM Y529A、GST-CBM W559A 和 GST-CBM W573A, 指定数表示在成熟的SelCel9Cl蛋白中的氨基酸。表2定点突变的引物序列定点突变用的引物序列 mm^ sr-CAAAGGGGAACTASTTCAiSSOCWrcTiSAATaKSA^^ CSEQiO NO 0} mmM ^cTTcocATOMaASc^reAAcmsrreascTrms* (SEQioNaio)VWW^铬 CmSTOAGTATCTOTAS^MSrCtTCCWrCASAOC^r {SCO ID NO 12) mmM钤(mQ ID 13) WWM铷 {SEO ID MO 14) mmMsVcrcorrcAircTOiCAsciro^aWiiCTCTrrAccAO^ (βεοιθΝθ: δ)
mmM y.f涨O 钔 ^ 询*变化的残基加下划线标识根据pGEX系统手册(GE卫生保健)，在28 °C下，使用0. 2mM IPTG诱导在 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL细胞(Stratagene)中的GST-CBM及其突变体的蛋白表达，持续 4 小时。将细胞团块重悬在 20mM Tris pH 8、20mM Tris pH 8、5mM DTT 和 ImM PMSF 中，再 使用法式压滤壶(French press)溶解细胞，接着进行高速离心和过滤以除去细胞碎片。将 无细胞的提取物加载在GSTrap FF柱上(GE卫生保健)，用50mM MES pH6. 5UOOmM NaCl、 5mM DTT、25mM还原的谷胱甘肽洗脱结合的蛋白。多糖底物根据(Irwin等人，Biotechnol Bioeng 42 1002-1013 (1993)，其全部内容在 此纳入本文中作为参考)，制备细菌微晶纤维素(BMCC ；MonsantoCellulon, Monsanto 公司)和磷酸溶胀纤维素(PASC)的储备悬液。根据(Kim等人，Purification and Characterization of Thermobifida fusca xylanaselOB,” Can J Microbiol 50: 835-843(2004)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)制备不可溶的燕麦-斯佩耳特小 麦木聚糖，并从Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)购买低粘度的(取代度=0. 65-0. 9，聚合 度=400)和中粘度的(取代度=0.7，聚合度=1100)羧甲基纤维素(CMC)。以下的多糖 底物从Megazyme International (Wicklow，Ireland)获得低粘度的长豆角半乳甘露聚糖 (Gal Man = 22 78)、糖用甜菜阿拉伯树胶酸(arabinan) (Ara Gal Rha GalUA =88 3 2 7)、含淀粉的木葡聚糖(Ara Gal Xyl Glc = 3 16 36 45)、 低粘度的小麦阿拉伯糖基木聚糖(Ara Xyl = 41 59 ；Glc, Gal和Man < 1% )和中粘 度的大麦β-葡聚糖(纯度>97%，具有<0.3%的阿拉伯糖基木聚糖污染物)。结合试验从(Irwin等人的“Roles of the Catalytic Domain and Two CelluloseBinding Domains of Thermomonospora fusca E4 in Cellulose Hydrolysis, " JBacteriol 180 1709-1714(1998)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)调整方法，并根据(Irwin等人的 Biotechnol Bioeng 42 1002-1013 (1993)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)制备含 纤维素底物。在室温下，在装有缓冲液B的2. Oml离心管中对Cel6/Cel9Cl FP、TfCel6A和 Cel6A CD 进行结合试验、以及在装有 50mM MES (pH 6. 5)、50mM NaCl、5mM CaCl2,2. 5mMDTT 和12. 5mM还原的谷胱甘肽的2. Oml离心管中对GST-CBM进行结合试验，以及在含0_3mg/ml BMCC和2nmol每种蛋白的2. Oml离心管中对突变体进行结合试验。室温下翻滚转动反应1 或3小时。通过离心分离除去未结合的蛋白。通过测量蛋白浓度(A28tl)来测定未结合的蛋白片段。也使用SDS-PAGE确定蛋白与微晶纤维素(Avicel纤维素)、BMCC和木聚糖的 结合。试验物在0.5ml的最终反应物体积中含有0-50mg微晶纤维素和50yg蛋白，且根 据上述的方法进行测定。使用缓冲液将含有结合蛋白的多糖块清洗三次，并重悬于2. 5X Laemmli缓冲液，再煮沸10分钟。分别使用10%或15% (w/v)的聚丙烯酰胺凝胶通过 SDS-PAGE分析结合和未结合的片段。对于比较CBM-GST和突变体与BMCC (2mg/mL)结合的 实验，使用 Typhoon 9400 Variable Mode Imager (GE 卫生保健)和 ImageQuant 软件(GE 卫 生保健)，通过与不含纤维素的对照物进行比较以确定每种结合和未结合的片段的相对量。 每个实验重复三次。在巴斯德毕赤酵母中的SlCel9Cl⑶的表达在巴斯德毕赤酵母(Invitrogen，Carlsbad CA)中生成重组SlCel9ClCD。通 过PCR(表1)将对应于CD (氨基酸22-505)的cDNA扩增，并克隆进入pPIC9K载体 (Invitrogen)中。根据生产商(Invitrogen)的用户指南生长并诱导(4d，16°C，250rpm)培 养物。培养物上清液调节到85%的硫酸铵中，将沉淀物重新悬于2. 5ml缓冲液A(50mM MES pH 6. 0,5mM CaCl2)中，接着用 PD-10 柱(Amersham Biosciences)除去盐分。将洗脱液应 用到HiTrapSP FF柱(GE卫生保健)上，并用0-0. 6M NaCl的梯度进行洗脱。酶活性的鉴定根据(Irwin等人的 Biotechnol Bioeng 42 :1002_1013 (1993) ;Ghose 等人的 Pure Appl Chem 59 :257_268 (1987)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)，在30°C下， 使用在0. 4ml缓冲液B中的细菌微晶纤维素(BMCC，2. 5mg/ml)、低粘度甲羧基纤维素(CMC， 1% w/v)和磷酸溶胀纤维素(ASC，0. 2% w/v)测定 Cel6/Cel9Cl FP、TfCel6A 和 the Cel6A CD的水解活性，试验分别进行20、4和2小时，每个BMCC的实验使用0. 4nmol蛋白，每个 CMC和ASC的试验使用0. 067nmol蛋白。除非另有说明，在37°C下，根据(Lever等人的“A New Reaction for Colorimetric Determination ofCarbohydrates, "Anal Biochem 47: 273-279(1972)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)的记述，在总体积为100 μ 1的含有 每个多糖底物的最终浓度为0.2% (w/v)的缓冲液A中对SlCel9Cl CD的水解活性进行定 量，持续4小时。在25-72°C内，使用在缓冲液A中的1 % (w/v)低粘度CMC (Sigma)来确定 SlCel9Cl⑶活性的最适温度，持续4小时。在37°C下，使用在缓冲液A (pH 4-8)中的 (w/v)低粘度CMC(Sigma)来确定SlCel9Cl⑶活性的pH曲线，持续进行4小时。为研究 钙对活性的影响，在37°C下，4小时内在反应混合物中加入5mM CaCl2±10mM EDTA。除非 另有说明，在37°C下，在含有缓冲液A中的0.2% (w/v)多糖底物的100 μ 1反应物中，对 SlCel9Cl CD的底物特异性进行试验(图6中列出的底物)，持续进行4小时。
t艮据(Jung 等人的"DNA Sequences and Expression in Streptomyceslividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene fromThermomonospora fusca, "Appl Environ Microbiol 59 :3032_3043 (1993)，其全部内容在此纳入本文中作 为参考)，在Whatman LK5D 150-A硅胶板上使用薄层色谱法(TLC)分析SlCel9Cl CD降解 纤维低聚糖(纤维二糖，G2 ；纤维三糖，G3 ；纤维四糖，G4 ；纤维五糖，G5和纤维六糖，G6 ； SeikagakuAmerica, Falmouth, MA)的能力以及得到的反应产物，但是，使用两种混合比例增 加的乙酸乙酯-水-甲醇(40 15 20，体积/体积)以分离低聚糖例外。
实施例1-植物EGase的模块结构
来自西红柿的EGase在历史上认为是TomCel 1_8 ；然而，根据作为Solanum Iycopersicum的西红柿的名称，将TomCel8重新命名为SlCel9Cl，以符合用于细菌EGase 的标准命名法(Henrissat 等人的"A Scheme forDesignating Enzymes that Hydrolyse the Polysaccharides in the Cell Wallsof Plants, "FEBS Lett 425 352-354(1998), 其全部内容在此纳入本文中作为参考)。该命名法提供了重要的信息，由于SlCel9Cl的 名字表明这种蛋白是来自GH家族9的西红柿(Si)纤维素酶(Cel) (Linder等人的“The Roles andFunction of Cellulose-binding Domains，，，J Biotech 57 :15-28 (1997)，其 全部内容在此纳入本文中作为参考)，其含有C类(C)结构域结构(图1A)。在植物EGase 总科中，A-C类分别对应于单独的膜锚定的分泌的GH9催化模块，和在含有其它的C-末 端结构域的组(图 1A). Libertini 等人(Libertini 等人的 “Phylogenetic Analysis of the Plant Endo-beta-l，4-glucanase Gene Family，，，J Mol Evol 58:506-515(2004)， 其全部内容在此纳入本文中作为参考)提出，含有推定的CBM(C类，图1A)的类是嵌套 在仅含有CD (B类，图1A)的较大组内的亚组。然而，考虑到内含子/外显子组织，它们 的系统发育研究主要集中在DNA序列，并提供了进一步进化的前景。同源的蛋白序列清 楚地表明植物GH9 EGase家族具有模块式的组织，该组织含有3个不同的亚组(图1A)。 EGases可能源于古代真核生物始祖，所述始祖先于真核生物王国的趋异演变(Davison等 人的“Ancient Origin ofGlycosyl Hydrolase Family 9 Cellulase Genes, "Mol Biol Evol 22 =1273-1284 (2005)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)，因此是普遍存在的。 因此，包括A和B类的成员的GH9基因已经在很多原始植物分类中确认，例如苔藓、蕨类 植物和苏铁类(Libertini 等人的 “Phylogenetic Analysis of thePlant Endo-beta-l, 4-glucanase Gene Family, "J Mol Evol 58 :506_515 (2004)，其全部内容在此纳入本文 中作为参考)。在苔藓小立碗藓中额外地存在用类似的推定的CBM编码预期的EGase的 EST (登录号BJ591253)，这进一步表明所有的三个亚类都存在于整个植物界中。C类EGase的推定的CBM结构域通常具有100-110个氨基酸，数据库的BLAST 检索表明这些结构域与微生物家族2CBM最为类似。SlCel9Cl和选择的植物直向同源 物的推定的CBM的氨基酸与粪碱纤维单胞菌木聚糖IOA的家族2a CBM对比(图1B)， 表明特定的残基保守，该残基已经通过实验测定对家族2a CBM与纤维素(在CBM2a中 的 W17、W54 禾口 W72)的结合很重要，(McLean 等人的 “Analysis of Binding of the Family 2aCarbohydrate-binding Module from Cellulomonas fimi xylanase IOA toCellulose :Specificity and Identification of Functionally Important AminoAcid Residues, "Protein Eng 13 :801_809 (2000)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)，如图 IB中的星号所示。然而，较低整体程度的氨基酸序列一致性(约18% )低于阈值，所述阈 值估计为至少 35% (Sanchez 等人的"Large-scale Protein Structure Modeling of the Saccharomyces cerevisiaeGenome，nProc Natl Acad Sci USA 95 :13597_13602(1998)，其 全部内容在此纳入本文中作为参考)，有必要得出关于它的结构或潜在功能的结论。因此， 采用生物化学方法测定推定的CBM结构域是否在碳水化合物结合中起作用。实施例2- SlCel9Cl CBM底物结合研究在E. coli或巴斯德毕赤酵母中多次尝试表达全长SlCel9Cl蛋白都一直产生两种含有预期大小的CD和CBM的多肽，但是其不含有预期大小的天然蛋白。这可能反映 连接子区域对蛋白水解的高敏感性，其普遍存在于细胞培养中(Irwin等人的Biotechnol Bioeng 42 :1002-1013(1993)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。做了很多尝试来解 决这个问题，例如改变培养物的PH、温度、培养基组分以及加入各种蛋白酶抑制剂鸡尾酒， 但都没有成功。因此，采用两种可替代的策略来确定C-末端的域是否是功能CBM。
为建立SlCel9Cl CBM作为模块EGase酶的一部分能够加强纤维素结合，生成了嵌 合蛋白(Cel6/Cel9Cl FP)，其包括 TfCel6A 的 CD、从 T. fusca 明确鉴定的 EGase (Bujnicki 等人的“Structure Prediction Meta Server, "Bioinformatics 17 :750_751 (2001)，其全 部内容在此纳入本文中作为参考)，该嵌合蛋白经设计以用来取代它自己的含有SlCel9Cl CBM的家族2的CBM。Cel6/Cel9Cl FP与两种结晶纤维素底物，BMCC和Avicel的结合与完 好的TfCel6A和TfCel6A⑶的结合进行单独的比较。TfCel6A表明与BMCC有最大的结合， 大约80%的蛋白结合到底物(图2A)中。TfCel6A CD在该实验中用作阴性对照，如预期那 样，其没有结合到BMCC，因其缺少CBM，而在高的底物浓度时，Cel6/Cel9Cl FP结合到几乎 全部的BMCC以及TfCel6A上。因此，在这些条件下，SlCel9Cl CBM具有与TfCel6A CBM2 相同的结合度，且其功能是用作不连续的纤维素结合模块，这是来自植物EGases的第一个 报道的例子。使用Avicel作为结合底物进行基于凝胶的定性试验也得到类似的结果(图 2B)。实施例3 SlCel9Cl CBM对溶纤活性的影响相信EGase CBM的重要功能是，通过增加⑶与它的底物之间的局部联系的持续时 间和程度来增强纤维素水解。为了测定这是否适用于SlCel9Cl CBM，将在三种纤维底物上 的Cel6/Cel9Cl FP的水解活性与TfCel6A和TfCel6A CD的水解活性进行单独的对比(表 3)。所有的三种蛋白都水解结晶BMCC，但是单独的Cel6/Cel9Cl FP和TfCel6A CD仅分别 具有29%和56%的TfCel6A活性。相反，TfCel6A和TfCel6A CD对酸溶胀纤维素(ASC)、 不能溶解的、非结晶纤维素底物具有相同的活性。尽管非结晶底物上的活性不需要CBMJfi 是Cel6/Cel9Cl FP仍然仅仅具有其它酶的特异性活性的一半。对于这种减少的活性，一种 可能的解释是Cel6/Cel9Cl FP的两个结构域之间的电荷差，因为TfCel6A⑶和CBM的预 期Pl分别为5. 9和4. 2，而SlCel9Cl⑶和CBM结构域的预期pi则分别为8. 1和10. 1。在 由柔性连接子区域连接的FP的两个结构域之间的这种较大的电荷差(4. 2pl单位)可促进 内域联系，其可能阻碍底物进入活性部位裂口。表3在细菌微晶-(BMCC)、羧甲基-(CMC)和酸性溶胀纤维素(ASC)上的Cel6A/ Cel9Cl融合蛋白(FP)的活性( μ摩尔的纤维二糖/分钟/ μ摩尔蛋白)BMCCASCCMCΤ. Fusca Cel6A0. 34 士 0. 0123.79 士 1.96 52. 70 士 4. 18T. Fusca Cel6A CD 0.19士0.0123. 52士2. 77 42. 90士2. 89Cel6A/ Cel9Cl FP 0.11 士0.0112. 68士2. 90 35. 14士0. 04因为推论这个单链的可溶的多糖可更容易进入活性部位，得到比含有BMCC或ASC 更大的活性，通过测试含有CMC、可溶的、非结晶纤维素聚合物的三种蛋白的活性进行研究 (表3)。这证明了所有的三种蛋白的情况确实如此(表3)，但是Cel6/Cel9Cl FP的活性仍然小于TfCel6A或TfCel6A CD的活性，其支持以下观点即在活性部位的位阻是造成活性减少的原因。然而，基于与Cel6/Cel9Cl FP的结合数据的结果，纤维素底物看来完全可到 达CBM。另一解释是两个模块的构造是催化结构域与底物在空间上隔开，导致底物可达性减 少，继而其活性减少。 实施例4_SlCel9Cl CBM的定位突变 为进一步检测SlCel9ClCBM的性质和得到重要的结构-功能信息，使用可计 算的建模来识别可能对纤维素的结合有帮助的残基。结构预测群体服务器(Structure Prediction Meta Server) (SPMS)的“3-D Jury”评分函数用来识别 SlCel9Cl CBM 的可能的 折叠结构(Ginalski 等人的“3D-Jury :ASimple Approach to Improve Protein Structure Predictions, "Bioinformaticsl9 1015-1018 (2003) ；Xu 等人的“Solution Structure of a Cellulose—bindingDomain from Cellulomonas fimi by Nuclear Magnetic Resonanc eSpectroscopy, ”Biochemistry 34 :6993_7009 (1995)，其全部内容在此引入本文中作为参 考)。这种方法识别两种可替代的类似免疫球蛋白的β三明治折叠体，且评分等级为最“重 要”的结构是来自粪碱纤维单胞菌(PDB，1EXG)的外一1，4- β -D葡聚糖酶家族2 CBM和人 类ADP-核糖基化因子结合蛋白GGAl (PDB, 1ΝΑ8)。这些结果表明SlCel9Cl CBM的结构与已 知的微生物CBM的结构不同，但是与IEXG微生物CBM的相似度允许预测这个结构域的通常 的拓扑机构并生成三维模型。 基于C. f imi木聚糖酶IOA (IEXG)的CBM2模板的SlCel9Cl CBM结构域的精 制模型(图3A)与母结构的桶装折叠特征(即在最终对比中只有少数几个短的插 入/缺失)紧密相配。来自C.fimi的CBM2是称为A类的CBM的较大组的成员，其通 过与在平的结合平面上的芳香残基介导的配体的疏水堆积作用与结晶底物的表面连 接(Boraston 等人 StJ"Carbohydrate-binding Modules :Fine-tuning Polysaccharide Recognition, "Biochem J 382 769-781 (2004) ；McLean ^AWAnalysis of Binding of theFamily 2a Carbohydrate-binding Module from Cellulomonas fimi xylanaselOA to Cellulose :Specificity and Identification of Functionally ImportantAmino Acid Residues，”Protein Eng 13 :801_809 (2000)，其全部内容在此并入本文中作为参 考))。接下来，在确定的定点突变研究之前，使用可计算的模型引导识别在纤维素结合中 具有可能的重要作用的残基。正如使用IEXG模板那样，含有明确限定的疏水核的模型由 多于五个芳香残基组成。这些包括SlCel9Cl的W522，图IB的序列对比最初表明其可能表 示一种C. fimiCBM2 (IEXG)的结合纤维素的残基(W17)；然而，在可预测的模型中，它对应 于在C. fimi CBM2中的疏水核中的W12。推断的功能重要的SlCel9ClW559和W573的残基 被提出在模板中与W54和WI2对比(图3A)，其与已知的CBM的特征一致(Brummell等人 的"Cell Wall Metabolism inFruit Softening and Quality and its Manipulation in Transgenic Plants，”Plant Mol Biol 47 :311_3401 (2001)，其全部内容在此纳入本文中 作为参考)。所述模型进一步表明SlCel9Cl的W529可能在空间上与IEXG的W17类似，从 而表示第三个潜在的结合位点(图3A)。之前使用C. fimi CBM2a也表明这个结合位点可 由Trp或Tyr残基占据，而无需纤维素的结合(McLean等人的“Analysis of Binding of the Family 2a Carbohydrate-binding Modulefrom Cellulomonas fimi xylanase IOA to Cellulose :Specificity andldentification of Functionally Important Amino AcidResidues，”ProteinEng 13 :801_809 (2000)，其全部内容在此纳入本文中作为参考))。有 趣的是，W529在来自在C类中的其它植物EGase的CBM之间是保守的，进一步表明了其重 要的功能作用(图1B)。
为促进定位突变体的蛋白表达和纯化，SlCelQA的CBM和相关突变的变体表达为 C-末端的融合蛋白，该融合蛋白通过10个氨基酸连接子(GST-CBM)连接到谷胱甘肽S-转 移酶上。在使用亲和纯化蛋白的共同培养试验中，GST-CBM结合到BMCC，而GST作为阴性对 照单独测定，表明没有结合图3B)，这证明当SlCel9Cl CBM融合到GST和在E. coli中表达 时，其也用作功能性纤维素结合模块。为了确定以上讨论的任何保守的芳香残基(图3A)是否有助于在SlCel9Cl CBM 与纤维素之间的相互作用，以下的残基都单独地突变成丙氨酸W522、Y529、W559和W573。 通过模型预测后面的3个残基是表面暴露的，因此有可能介导与结晶纤维素的堆积相互作 用，而预测W522附在模块的疏水核上(图3A)。选择的芳香残基的非保守置换为丙氨酸支持一些但不是所有的基于结构模型的 预言。W573A突变体对结合(图3C)的影响最大，导致未突变的GST-CBM(WT)的结合能力小 于10%。类似地，W522A和W559A突变体分别表现出结合减少25%和30%。然而，当与WT 比较时，Y529A突变对结合没有明显影响(图3C)，这表明它对与纤维素的相互作用没有起 作用。因此，W559A和W573A突变体的结果支持源自模型的预测。在W522的情况下，观察 到的结合的减少可能是由于疏水核的打断而引起结构域的稳定性丧失，或者它的建模错误 而实际上表面暴露在外。实施例5_SlCel9Cl CD的特征仍然没有建立植物EGase的体内底物，少数几个使用各种纯化的天然的或重 组的同工酶的体外研究仍没有显示底物特异性的一致性模型。大部分以生物化学鉴定 的植物EGase属于B类，包括分泌的GH9⑶，且通常它们全部都具有CMC酶活性，而没 有对抗结晶纤维素的活性，已经报道了对抗含有内i3_l，4-Glc连接的潜在的细胞壁底 物的不同活性，包括混合连接的(1，3)，(l，4)-i3-D-葡聚糖(MLG)、葡甘露聚糖和木葡 聚糖(Rose 等人的 ThePlant Cell Wall, Blackwell Publishing, pp. 264-324(2003)； Master 等 人 的"Recombinant Expression and Enzymatic Characterization of PttCel9A, aKOR Homologue from Populus tremula χ tremuloides,，，Biochemistry43 : 10080-10089(2004)；其全部内容在此纳入本文中作为参考)。也已经使用不同的底物测 试两种A类EGase (甘蓝型油菜BnCel 16和白杨PttCel9A)的活性，并且还核实了其不同 点(Molho j 等人的"Characterization of aFunctional Soluble Form of a Brassica napus Membrane-anchoredEndo-1,4-beta-glucanase Heterologously Expressed in Pichia pastoris，”Plant Physiol 127:674-684(2001) ；Woolley 等人的"Purification andProperties of an Endo-beta-1,4-glucanase from Strawberry andDown-regulation of the Corresponding Gene,Cell, "Planta 214 :11_21 (2001)，其全部内容在此纳入本文 中作为参考)。两者都表明对非结晶纤维素CMC和ASC具有高度活性，但是对结晶纤维素、 木葡聚糖、MLG或木聚糖显示很少活性甚至没有活性(Molhoj等人的“Characterization of aFunctional Soluble Form of a Brassica napus Membrane-anchoredEndo-1, 4-beta-glucanase Heterologously Expressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol127 674-684(2001) ；Woolley等人的“Purification andProperties of an Endo-beta-l， 4-glucanase from Strawberry andDown—regulation of the Corresponding Gene, Cell," Planta 214 :11_21 (2001)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)，且仅仅是 PttCel9A水解纤维-低聚糖。至今，还没有关于植物C类EGase的底物特异性的报道，因此，在检测对各种细 胞壁多糖和纤维素底物的活性之前，对重组SlCel9Cl CD活性的最适温度和pH进行试 验。在37°C，经SlCel9Cl⑶进行的对低粘度CMC的水解是最佳的(图4A)，因此这个 温度将用于以后所有的试验。许多公开的报道描述了在25-30°C的试验条件下测定植 ^ W EGase ^ (Molho j ^AW "Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassica napusMembrane-anchored Endo-I,4-beta-glucanase Heterologously Expressed inPichia pastoris, "Plant Physiol 127:674-684(2001) ；Maclachlan φ 人的Method Enzymol 160 :382_391 (1988)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)，但需 要注意的是，SlCel9Cl⑶在这些温度下的活性少于一半。也鉴定了 SlCel9Cl WpH曲 线，在该曲线上可以观察到最适活性在PH 4. 5与6. O之间(图4B)，其与之前鉴定的A 类植物 EGases 得到的结果相似(Molhoj 等人的 “Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassicanapus Membrane-anchored Endo-I,4-beta-glucanase HeterologouslyExpressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol 127 674-684(2001)； Woolley 等 人 ^"Purification and Properties of an Endo-beta-l,4-glucanase fromStrawberry and Down-regulation of the Corresponding Gene, Cel 1,，，Planta214 : 11-21 (2001)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。还进一步观察到活性需要钙，以及， 相反地，也观察到钙螯合剂抑制活性。当在最适PH和温度下测定底物特异性时，用大麦MLG 观察到最高的活性，然后是使用阿拉伯糖基木聚糖、中等粘度的CMC、低粘度的CMC，然而也 存在使用阿拉伯树胶酸和罗望子木葡聚糖观察到的可以忽略的活性(图5)。用西红柿水果 或西红柿悬液培养的细胞的BMCC或木葡聚糖没有检测到活性。通过SlCel9Cl⑶对纤维低聚糖(G2-G6)进行的水解用TLC来评估图6)。用纤维 六糖(G6)观察到最高活性，然后在纤维五糖(G5)和纤维四糖(G4)上观察到显著减少的活 性。水解产物为G6消化生成G3、G4和G2 ；G5裂解成G3和G2 ；G4水解生成G2和G3 (图 6)。这些结果与之前的A类和B类的植物GH9 EGases的研究一致，所述的植物GH9 EGase 看来具有亲和性更高的⑶结合亚位点，其能结合至少6个连续的1，4-β -连接的Glc单 兀(Woolley 等人 "Purification and Properties of anEndo-beta- 1,4-glucanase from Strawberry and Down-regulation of theCorresponding Gene，Cell，，，Planta 214 :11-21(2001)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。植物A类EGase也显示仅 仅裂解 G5 和 G6(Molhoj 等人的“Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassica napusMembrane-anchored Endo-I,4-beta-glucanase Heterologously Expressed inPichia pastoris, ”Plant Physiol 127 :674_684 (2001) ;Eckert 等人的 "GeneCloning,Sequencing,and Characterization of a Family 9 Endoglucanase(CelA) with an Unusual Pattern of Activity from the ThermoacidophileAlicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009，” Appl Microbiol Biotechnol60 :428_436 (2002)其全部内 容在此纳入本文中作为参考)。然而，用C类SlCel9Cl⑶在G4上观察到的额外的活性，这在之前没有报道过。这种结果证实了之前的假设(Molhoj等人的“Characterization of a FunctionalSoluble Form of a Brassica napus Membrane-anchoredEndo—l, 4-beta-glucanase Heterologously Expressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol 127 =674-684(2001)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)，即在C类植物EGase的催化 裂口中的W316的存在可促进G4的裂解，其中所述的C类是在这个位置上保留Trp的唯一 类别。为进一步确认TLC数据，使用基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(MALDI-T0F MS)来鉴定由G5消化得到的产物。这证明产生了 G3和G2，但并没有产生其它的糖类。还 注意到，市售的G6底物含有少量的G7，因此不会产生转糖基活性(样品6，图6)。
当与之前研究的A或B类植物EGase的那些进行比较时，SlCel9Cl⑶具有宽的底 物特异性。宽的底物范围对微生物GH9酶是不常见的(Molhoj等人的“Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassicanapus Membrane-anchored Endo-I, 4-beta-glucanase HeterologouslyExpressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol 127:674-684(2001) ；York 等人的"The Structures of Arabinoxyloglucans Produced by SolanaceousPlants，，，Carbohydr Res 285 :99_128 (1996)，其全部内容在此纳入本文 中作为参考)，且以前也在微生物的GH9家族的成员中检测到木聚糖酶的活性。最初在市 售的长豆角半乳甘露聚糖上检测到一些水解活性，其通过测量还原基团而测定。然而，通 过随后的粘度分析没有观察到半乳甘露聚糖解聚，且当用纯63，64-a-D-半乳糖基-甘露 五糖孵育和经MALDI-TOF MS测定时，所述酶并没有生成反应产物。因此，水解活性可能是 由于含有少量未知的多糖的市售半乳甘露聚糖的污染而引起的。将用大麦MLG的高活性 与之前报道的通过在苔藓上的柏杨A类EGase (另一 MLG底物)所表现出的低活性进行比 较(Molho j 等人的"Characterization of a Functional Soluble Form of aBrassica napus Membrane-anchored Endo-I,4-beta-glucanaseHeterologousIy Expressed in Pichia pastoris, "Plant Physiol 127 :674_684(2001)，其全部内容在此纳入本文中作为 参考)。然而，大麦β-葡聚糖MLG在β-1，3-糖苷键之间有较长的β-1，4-葡聚糖的一段 序列，这可使它用作更好的底物。也报道了另一 A类酶、即甘蓝型油菜Cell6对大麦MLG具 有可以忽略的活性(Woolley 等人的 “Purification and Properties of anEndo-beta-l， 4-glucanase from Strawberry and Down-regulation of theCorresponding Gene, Cell," Planta 214 :11-21 (2001)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。用葡聚 糖观察到的最小活性与之前的植物EGase的研究一致(Master等人的“Recombinant Expression and EnzymaticCharacterization of PttCel9A, a KOR Homologue from Populus tremula xtremuloides, "Biochemistry 43 10080-10089(2004)； Molhoj 等人的"Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassica napusMembrane—anchored Endo-I,4-beta-glucanase Heterologously Expressed inPichia pastoris, "Plant Physiol 127:674-684(2001) ；Woolley等人的“Purification and Properties of an Endo-beta-1,4-glucanase fromStrawberry and Down-regulation of the Corresponding Gene, Cell，”Planta214 :11-21 (2001)，其全部内容在此纳入本 文中作为参考)，且可能反映未取代的1，4-β -连接的Glc残基充分靠近的一段序列较罕 见，尽管令人感兴趣的是，罗望子木葡聚糖是比西红柿木葡聚糖稍微好点的底物，即使前 者表现出更大程度的侧链分支(Pauly等人的“Molecular Domains of theCellulose/xyloglucan Network in the Cell Walls of Higher Plants,"Plant J20 :629_639 (1999)， 其全部内容在此纳入本文中作为参考)。结构类似的TfCel9A也缺少对木葡聚糖的活 性，表明高水平的分支链可能妨碍进入催化裂口(Molhoj等人的“Characterization of a Functional Soluble Form of aBrassica napus Membrane-anchored Endo-I, 4-beta-glucanaseHeterologousIy Expressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol 127 :674-684(2001)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。
本发明提供第一个植物EGaSe(SlCel9Cl)的报道，其含有有助于与结晶纤维素结 合的功能性的模块式的CBM。类推微生物的研究，这表明C类植物EGase在促进纤维素降解 中起作用。一个可能性是它们在不可逆的壁分解相关的过程中起作用，例如水果变软和器 官切除。在成熟的水果中观察到SlCel9Cl的转录丰度增加，其相当于快速的壁降解，这可 以支持前述的观点。然而，应该注意的是，SlCel9Cl的体外底物特异性看来比大多数已知的 GH9酶要宽。或者，C类EGase可用来在纤维素微纤维周围水解多糖链，所述微纤维包括无定 形或类晶体纤维素链和其它相关的聚合物。事实上，据报道，木葡聚糖聚合物的子类与微纤 维表面紧密结合，因此难以接近不具有CBM的木葡聚糖(Harpster等人的“Suppression of a Ripening-relatedEndo—l,4—beta-glucanase in Transgenic Pepper Fruit Does Not PreventDepolymerization of Cell Wall Polysaccharides During Ripening, 'T1IantMol Biol 50 :345-355(2002)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。虽然有足够的证据 (balance of evidence)表明大多数GH9 EGase不水解木葡聚糖(Rose等人的The Plant Cell Wall, Blackwell Publishing，pp.264—324(2003) ；Master 等人的“Recombinant Expression and Enzymatic Characterizationof PttCel9A, a KOR Homologue from Populus tremula χ tremuloides, "Biochemistry 43 :10080—10089 (2004)，其全部内容 在此纳入本文中作为参考)，这个结论几乎只是基于使用非天然的底物的体外试验。此 夕卜，木葡聚糖可采用更易于攻击的细胞壁(in muro)构象。使用转基因植物的一个研究也 表明植物EGase不会在体内水解木葡聚糖；然而，这包含无CBM的B类EGase (Rose等人 的"Cooperative Disassembly of theCellulose-xyloglucan Network of Plant Cell Walls !Parallels Between CellExpansion and Fruit Ripening. ,，，Trends Plant Sci 4 :176-183(1999)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。多糖的构象和定位可能通 过它们与纤维素的相互作用而受到较大影响(Rose等人的“Cooperative Disassembly of theCeIlulοse-xyloglucan Network of Plant Cell Walls !Parallels Between CellExpansion and Fruit Ripening. ,，，Trends Plant Sci 4 176-183 (1999) ；Chen 等人 !^"Endoxylanase Expressed During Papaya Fruit Ripening-Purification, Cloning and Characterization, "Funct Plant Biol 30 :433_441 (2003)，其全部内容在此纳入本 文中作为参考)，因此体外分析的结果应该谨慎解释。第三个特定的情形(scenario)是CBM的主要功能是使⑶靶向相关的底物，以促 进细胞壁微域的修饰，然后CD和CBM模块的蛋白水解分离。已经给模块式的木聚糖酶提出 过这种水解醇标革巴机制(Downes 等人的 “Expression and Processing of a Hormonally Regulated Beta-Expansinfrom Soybean,"Plant Physiol 126:244—252(2001)，胃 全部内容在此纳入本文中作为参考)，翻译后的蛋白质水解已建议另一植物壁的解散 蛋白、β-扩展蛋白的激活机制(Shpigel等人的“Bacterial Cellulose-binding DomainModulates In Vitro Elongation of Different Plant Cells,，，Plant Physiolll7 1185-1194(1998)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)。最后，C类EGase可能包含在壁装配中，例如通过在生物合成的过程中调节纤维素 结晶度，因此，其在细胞扩增中起作用。业已显示，将外源细菌CBM应用到植物组织中能导 致生长增加(Shoseyov的美国专利6，184，440，其全部内容在此纳入本文中作为参考)，已 报道表达细菌CBM的转基因烟草植物比其同类型的野生植物生长的速度更快，产出的生物 质也更多。这种现象归因于干扰微纤维生物合成和结晶的CBM。植物C类EGase基因的表达与降解过程(如水果软化和切断)有关 (Trainotti 等人的"A Novel Ε-type Endo-beta-1,4-glucanase with a PutativeCellulose-binding Domain is Highly Expressed in Ripening StrawberryFruits. , "Plant Mol Biol 40: 323-332(1999) ；Trainotti ^AW "PpEG4 is aPeach Endo-beta-1,4-glucanase Gene whose Expression in ClimactericPeaches does not Follow a Climacteric Pattern,"J Exp Bot 57 :589-598(2006)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)，以及和细胞延长 (Arpat 等人的"Functional Genomics of Cell Elongation in Developing Cotton Fibers, "Plant Mol Biol 54 :911_929 (2004)，其全部内容在此纳入本文中作为参考)有 关，因此，这些蛋白可具有多种生理机能。实施例6-S1CGH9C1 和 S1GH9C1-CBM49 的过量表达S1GH9C1的组成型过量表达载体是通过插入编码区创建的，该编码区包括代替在 二元载体 pCAMBIA 1305. 2(CAMBIA, Canberra, Australia)中的 GUS 基因的天然信号肽和 终止密码子,其由CaMV 35S启动子驱动。弓丨物对5 ‘ -GCCCCATCATGAAATGAAGGGTTTTGTTGG-3' (SEQ ID N0:17)/5' -CGCCGGGTGACCTTTAGACTAGAGTGT-3‘ (SEQ ID NO 18)用于扩增 对应于氨基酸1-625的完整S1GH9C1编码区，扩增产物用BspHI/BstEII裂解，载体用NcoI/ BstEII切开。过量表达的S1GH9C1 CBM49的构建体是通过插入包括终止密码子CBM 49编 码区来取代GUS基因而创建，所述CBM49位于二元载体pCAMBIA 1305. 2 (CAMBIA, Canberra, Australia)的过氧化氢酶信号序列的下游，且与其框内连接，并由CaMV 35S启动子驱动。 引物对 5' -CCAGTCCCAGATCTTGCTCATGTTACTATTC-3' (SEQ ID N0:19)/5' -CGCCGGGTGA CCTTTAGACTAGAGTGT-3 ‘ (SEQ ID NO 18)用于扩增对应于 S1GH9C1 的氨基酸 527-615 的 S1CBM49编码区，扩增产物和载体都用BspHI/BstEII裂解。消化的PCR产物和载体连接并 转化至E. coli XLlO-Gold(Stratagene)。克隆的插入物在载体上测序，所述的载体含有对 35S启动子有特异性的正向定向的引物和反向定向的引物5' -CGCCGGGTGACCTTTAGACTAGA GTGT-3 ‘ (SEQ ID NO 18)。得到的质粒35S: :S1GH9C1和35S: :S1CBM49转化至A. tumefaciens，并随后转化至 前述的种植阿拉伯芥(Arabidopsis ecotype Columbia)。在前述的1 2 1隔离的潮霉 素平板上筛选T3种子，以识别与用于进一步分析的插入纯合的T2植物。转基因植物显示从种子萌芽后的5天起，根和枝的生物质都增加，也表明生长速 率加快。实施例7-拟南芥茎的宽角度X射线衍射(WAXS)分析使用同步加速辐射X射线微光束分析，在Cornell高能同步加速源上进行试验，以 得到EGase如何影响纤维素微纤维的特性的原子水平的结构信息。将具有C类EGase的突变体的拟南芥植物与设计成组成性地表达完整S1GH9C1或它的位于植物细胞壁上CBM49 的植物进行比较。在C类EGaSeGH9C2(Atlg64390)中的两种突变体等位基因在纤维素结晶 度调节中使CBM49的功能清楚地显示出来。gh9c2-l中的突变导致在GH9催化结构域的活 性位点上有67个氨基酸丢失，使得所述蛋白无水解活性；然而，它保留了它的CBM49。在相 同基因gh9c2-2中的另一独立的突变是由于导致待翻译的蛋白仅有106个氨基酸的移码引 起的，从而使得GH9和CBM49结构域丢失。当在前述的GH9C2突变体中的纤维素的微晶结 构尺寸与野生型植物的尺寸进行比较时，完全丢失两个结构域(gh9c2-2)的突变体显示微 晶尺寸增大，其中催化突变体(gh9c2-l)导致尺寸适当增大(表4)。基于CBM49结构域用 作调节纤维素结晶度的模型，可以预期，当除去这个结构域时，正如在gh9c2-l和其它含有 CBM49的突变体中所观察到的那样，微晶尺寸因此增大，如下表所示(表4)。
表4.拟南芥突变体的茎组织的纤维素的微晶尺寸Col. 单个的葡聚糖链之间的氢键结合的程度是影响结晶度的主要因素。当因转基因表 达而使得存在于壁上的CBM49的量增加时，观察到对纤维素结晶度的相反影响。图7中所 示为野生型拟南芥的茎的片段上和组成性地表达来自西红柿S1GH9C1的CBM49的植物的X 射线衍射模型的例子。在35S::CBM49植物中，当与野生型(WT)的未转化的植物相比时，结 晶材料的质量更小。微晶主轴的分布在35S: :CBM49植物中明显更宽，正如围绕相当于200 反射的环的更均勻的强度所示的那样。因此，所述纤维素在35S: :CBM样品中显然没有很好 地定向，且在35S::CBM49植物中的微晶与野生型的微晶不类似。然而，尽管定向明显破坏， 微晶尺寸大体上不会改变。
JTs.过量表达植物的茎的组织的纤维素的微晶尺寸
基因型Col. VT_35S: CBM49 35S::S1GH9C1
—微晶尺寸 I27 A 26 A 30 A尽管在此详细地描述了优选的实施方式，但是，在不脱离本发明的精神的情况下， 本发明领域的技术人员显然可作出很多的改变、增加、替换等等，因此，以上所有的这些都 应包含在本发明所附的权利要求书所限定的范围内。
权利要求
转基因植物细胞，其包括核酸构建体，所述的核酸构建体包括编码植物内切-1，4-β-木聚糖酶和/或植物内切-1，4-β-葡聚糖酶的核酸分子，其中植物内切-1，4-β-木聚糖酶和/或植物内切-1，4-β-葡聚糖酶各自具有模块式的糖结合结构域，或编码组成型催化结构域的区域和/或单个或多个模块式的糖结合结构域；植物启动子；以及植物终止序列，其中所述植物启动子和植物终止序列可操作地与所述核酸分子偶联，且至少所述植物启动子或植物终止序列之一与所述核酸分子异源。
2.根据权利要求1所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述的启动子是组成型启动子。
3.根据权利要求1所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述的启动子是组织特异性的。
4.根据权利要求3所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述的启动子是植物茎特异 性的。
5.根据权利要求1所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述的启动子是诱导型的。
6.根据权利要求1所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述的核酸分子编码选自以 下的植物内切-1,4-β-葡聚糖酶:Atlg48930、Atlg64390、At4gll050、TomCel8、SlCel9Cl、 SIGH9C1、0s04g0674800、OsGlu6、0s01g0220100、OsCel9A、OsGlu5、0s01g0219600、OsCel9B 和 OsGlu7。
7.根据权利要求1所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述的核酸分子编码选自 以下的植物内切-1，4- β -木聚糖酶:Atlgl0050、Atlg58370、At4g08160、At2gl4690、 At4g33860、At4g33810、At4g33840、At4g38650、At4g33820、0s03g0672900 和 PttXynlOA。
8.—种转基因植物种子，其特征在于，所述转基因植物种子包含如权利要求1所述的 转基因植物细胞。
9.一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物包含如权利要求1所述的转基因植 物细胞。
10.根据权利要求9所述的转基因植物，其特征在于，所述的启动子是组成型启动子。
11.根据权利要求9所述的转基因植物，其特征在于，所述的启动子是组织特异性的。
12.根据权利要求11所述的转基因植物，其特征在于，所述的启动子是植物茎特异性的。
13.根据权利要求9所述的转基因植物，其特征在于，所述的启动子是诱导型的。
14.根据权利要求9所述的转基因植物，其特征在于，所述的核酸分子编码选自以下 的植物内切-1，4-β-葡聚糖酶:Atlg48930、Atlg64390、At4gll050、TomCe 18, SlCel9Cl、 SIGH9C1、0s04g0674800、0sGlu6、0s01g0220100、0sCel9A、0sGlu5、0s01g0219600、0sCel9B 和 0sGlu7。
15.根据权利要求9所述的转基因植物，其特征在于，所述的核酸分子编码选自以下的 植物内切-1，4-β -木聚糖酶:Atlgl0050、Atlg58370、At4g08160、At2gl4690、At4g33860、 At4g33810、At4g33840、At4g38650、At4g33820、0s03g0672900 和 PttXynlOA。
16.一种权利要求9所述的转基因植物的组成部分。
17.一种多糖解聚的方法，所述的方法包括提供根据权利要求9所述的转基因植物的生物质；以及 使所述的生物质进行多糖解聚。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括 使进行多糖解聚的生物质发酵。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的发酵产生乙醇。
20.一种转基因植物的生产方法，所述的方法包括 提供核酸构建体，该核酸构建体包括编码植物内切-1，4-β-木聚糖酶和/或植物内切-1，4-β-葡聚糖酶的核酸分子，其 中所述植物内切-1，4- β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚糖酶各自具有糖结合结 构域，或编码组成型催化结构域的区域和/或单个或多个模块式的糖结合结构域； 植物启动子；以及植物终止序列，其中所述植物启动子和植物终止序列可操作地与核酸分子偶联，且至 少所述植物启动子或植物终止序列之一与核酸分子异源； 用核酸构建体转化植物细胞以生成转基因植物细胞；以及 从转基因植物细胞繁殖转基因植物。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的启动子是组成型启动子。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的启动子是组织特异性的。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的启动子是植物茎特异性的。
24.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的启动子是诱导型的。
25.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的核酸分子编码选自以下的植物 内切-1，4-β -葡聚糖酶:Atlg48930、Atlg64390、At4gll050、TomCel8、SlCel9Cl、SIGH9Cl、 0s04g0674800、OsGlu6、0s01g0220100、OsCel9A、OsGlu5、0s01g0219600、OsCel9B 和 OsGlu7。
26.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的核酸分子编码选自以下的植 物内切 _1，4-β-木聚糖酶:Atlgl0050、Atlg58370、At4g08160、At2gl4690、At4g33860、 At4g33810、At4g33840、At4g38650、At4g33820、0s03g0672900 和 PttXynlOA。
27.一种多糖解聚的方法，所述的方法包括提供选自以下的植物酶植物内切_1，4-β-木聚糖酶、植物内切-1，4-β-葡聚糖酶及 其混合物，其特征在于，所述的植物内切-1，4- β -木聚糖酶和/或植物内切-1，4- β -葡聚 糖酶各自具有糖结合结构域、编码组成型催化结构域的区域和/或单个或多个模块式的糖 结合结构域；以及用生物质在对多糖解聚生物质有效的条件下培育植物酶。
28.一种识别能够承受增强的多糖解聚的植物的方法，所述的方法包括 提供候选植物的集合；测定所述植物集合的生物质的量和/或消化能力；以及将测定的集合中具有增加的生物质的量和/或消化能力的植物标识为能够承受增强 的多糖解聚的候选植物。
29.根据权利要求28所述的方法，进一步包括使所述候选植物进行繁殖程序以生产子代植物。
30.根据权利要求29所述的方法，进一步包括 使所述子代植物进行多糖解聚。
31.一种生产能够承受增强的多糖解聚的植物的方法，所述的方法包括 提供植物的集合；在所述植物的集合中诱导突变，以产生突变的植物集合； 测定突变植物集合中的生物质的量和/或消化能力；将测定的突变植物的集合中相对于非突变植物具有增加的生物质的量和/或消化能 力的植物标识为与集合中的其它植物相比，能够承受增强的多糖解聚的候选植物。
32.根据权利要求31所述的方法，进一步包括 使所述候选植物进行繁殖程序，以生产子代植物。
33.根据权利要求32所述的方法，进一步包括 使所述子代植物进行多糖解聚。
全文摘要
本发明公开了一种包括核酸核酸构建体的转基因植物细胞。核酸构建体包含编码植物内切-1，4-β-木聚糖酶和/或植物内切-1，4-β-葡聚糖酶的核酸分子，其中植物内切-1，4-β-木聚糖酶和/或植物内切-1，4-β-葡聚糖酶各自具有模块式的的糖结合结构域，或多个模块式的糖结合结构域。所述核酸构建体还包括植物启动子和植物终止序列，其中植物启动子和植物终止序列可操作地与核酸分子偶联，且至少植物启动子或植物终止序列之一与核酸分子异源。本发明还涉及生产转基因植物、多糖解聚转基因植物和非转移因植物的方法，以及识别能够承受增强的多糖解聚的植物的方法。
文档编号C12N15/82GK101873794SQ200880103692
公开日2010年10月27日 申请日期2008年6月23日 优先权日2007年6月22日
发明者B·R·乌尔巴诺维奇, C·卡塔拉, J·罗斯 申请人:康乃尔研究基金会有限公司