经过修饰的因子ix多肽及其用途的制作方法

专利名称：经过修饰的因子ix多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本申请涉及经过修饰的因子IX多肽，例如，展现升高的比活性的因子IX多肽和聚合物缀合的因子IX多肽。本申请还涉及用于生成经过修饰的因子IX多肽及其缀合物 (conjugate)的方法，及使用经过修饰的因子IX多肽，例如，治疗罹患血友病B的患者的方法。
背景技术：
血友病B影响1/34，500名男性，而且是由编码凝固因子IX(FIX)的基因中导致血液中FIX蛋白低或检测不到的各种遗传缺陷引起的(Kurachi, et al.，Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6 :991-997,1992 ；Lillicrap, Haemophilia 4:350-357,1998)。FIX 水平不足导致凝固缺陷和源自出血失控的症状。血友病B通过静脉内输注血浆衍生的或重组的FIX蛋白来有效治疗，或是停止已经开始的出血或是防止出血发生(预防)(Dargaud， et al. ,Expert Opin. Biol. Ther. 7 :651-663 ；Giangrande,Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524, 2005) ο有效预防要求维持最低FIX谷水平为正常水平的约(Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524，2005)。由于天然 FIX (血浆衍生的或重组的)的半衰期是大约18至M小时，FIX水平在推注后3至4天内下降至不到正常水平的1%，这就必须平均每三天重复注射以实现有效预防(Giangrande，Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524, 2005) 0这样频繁的静脉内注射对患者成问题，而且对实现有效预防成障碍 (Petrini, Haemophilia 13Suppl 2 16-22，2007)，尤其在孩子中。比活性升高的 FIX 蛋白具有延长保护持续时间的潜力，因此具有显著的医学好处。发明概述本申请提供FIX多肽(也称作经过修饰的FIX多肽，FIX突变蛋白，或FIX变体)， 其包含经过修饰以改善FIX比活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，引入了一或多处氨基酸替代。在一些实施方案中，该多肽具有凝固活性。在一些实施方案中，该经过修饰的 FIX多肽可包含氨基酸残基85，86，87，338，和410处的至少一处替代。该经过修饰的FIX多肽可通过引入一或多处氨基酸替代，例如，用任何氨基酸替代来生成。例示性实施方案包括如下的FIX多肽，其包含一或多处替代诸如，但不限于(a)D85F ；D85G ；D85H ；D85I ；D85M ；D85N ；D85R ；D85S ；D85W ；D85Y ；V86A ；V86D ； V86E ；V86G ；V86H ；V86I ；V86L ；V86M ；V86N ；V86P ；V86Q ；V86R ；V86S ；V86T ；T87F ；T87I ； T87K ；T87M ；T87R ；T87V ；T87W ；R338A ；R338F ；R338I ；R338L ；R338M ；R338S ；R338T ；R338V ； R338W ；E410N ；E410Q ；(b) D85W 和 T87R ；D85F 和 T87I ；D85W 和 T87W ；D85R 和 T85R ；D85I 和 T87R ；D85Y 和 T87F ；D85I 和 T87M ；D85F 和 T87R ；D85F 和 T87V ；D85R 和 T87K ；D85H 和 T87I ；D85I 和 T87I ；D85Y 和 T87K ；D85S 和 T87R ；D85Y 和 T87R ；D85G 和 T87K ；D85H 和 T87W ；D85H 和 T87K ；D85F 和 T87K ；D85H 和 T87V ；D85M 和 T87I ；D85H 和 T87M ；R338A 和 E410N ；R338A 和 E410Q ；
(C) D85W, V86A,和 T87R ；D85F, V86A,和 T87I ；D85W, V86A,和 T87W ；D85R, V86A,和 T85R ；D85I, V86A，和 T87R ；D85Y, V86A，和 T87F ；D85I, V86A，和 T87M ；D85F, V86A，和 T87R ； D85F, V86A，和 T87V ；D85R, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87I ；D85I, V86A，和 T87I ；D85Y, V86A,和 T87K ；D85S，V86A，和 T87R ；D85Y, V86A,和 T87R ；D85G, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87W ；D85H, V86A，和 T87K ；D85F, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87V ；D85M, V86A，和 T87I ； D85H, V86A，和 T87M ；(d) D85W, V86A, T87R,和 R338A ；D85F, V86A, T87I，和 R338A ；D85W, V86A, T87W,和 R338A ；D85R, V86A, T85R,和 R338A ；D85I，V86A, T87R,和 R338A ；D85Y, V86A, T87F,和 R338A ； D85I, V86A, T87M，和 R338A ；D85F, V86A, T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87V，和 R338A ；D85R, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87I，和 R338A ；D85I, V86A, T87I，和 R338A ；D85Y, V86A, T87K，和 R338A ；D85S, V86A, T87R，和 R338A ；D85Y, V86A, T87R，和 R338A ；D85G, V86A, T87K, 和 R338A ；D85H, V86A, T87W,和 R338A ；D85H, V86A, T87K,和 R338A ；D85F, V86A, T87K,和 R338A ；D85H, V86A, T87V,和 R338A ；D85M, V86A, T87I，和 R338A ；D85H, V86A, T87M,和 R338A ；(e) D85W, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85F, V86A, T87I，R338A,和 E410N ；D85W, V86A, T87W, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T85R, R338A，禾口 E410N ；D85I, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85Y, V86A, T87F, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87M, R338A,和 E410N ；D85F, V86A, T87R, R338A，禾口 E410N ；D85F, V86A, T87V, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T87K, R338A, 和 E410N ；D85H, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87K, R338A，禾口 E410N ；D85S, V86A, T87R, R338A，禾口 E410N ；D85Y, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85H, V86A, T87V, R338A, 和 E410N ；D85M, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87M, R338A,和 E410N ；D85W, V86A, T87R, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85W, V86A, T87W, R338A, 和 E410Q ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410Q ；D85I, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87F, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87R, R338A, 和 E410Q ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410Q ；D85R, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85Y, V86A, T87K, R338A, 和 E410Q ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87K, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87V, R338A，禾口 E410Q ；D85M, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；及其任意组合。本发明还提供FIX多肽缀合物，其包含经过修饰以改善FIX比活性的氨基酸序列和共价附着至该FIX多肽的一或多个聚合物模块。在一些实施方案中，该聚合物模块共价附着至该FIX多肽上的糖模块，其中该糖模块在哺乳动物细胞中表达期间天然附着至该肽。本申请还提供药物制备物，其包含经过修饰的FIX多肽和药学可接受载体。本申请还提供用于治疗血友病B的方法，其包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的本文所述药物制备物。本申请还提供编码经过修饰的多肽的DNA序列，以及经过该DNA序列转染的真核宿主细胞。本申请还提供用于生产经过修饰的FIX多肽的方法，其包括(i)通过引入一或多处氨基酸替代修饰该多肽的氨基酸序列；(ii)在，例如，哺乳动物细胞系中表达该多肽；并 (iii)纯化该多肽。本申请还提供缀合物，其包含a)包含通过引入一或多处氨基酸替代经过修饰的氨基酸序列的因子IX多肽，其中至少一处氨基酸替代位于残基338 ；b)附着至所述一或多个糖基化位点的一或多糖模块；和c)共价附着至一或多个糖模块的一或多个聚合物模块。本申请还提供用于改善聚合物模块对多肽的缀合的方法，其包括a)提供具有一或多个糖基化位点的多肽，其中该糖基化位点包含一或多个唾液酸；b)氧化所述多肽的所述唾液酸；c)提供催化剂；并d)将包含氨基-氧官能团的聚合物模块共价附着至所述氧化后的唾液酸。附图简述

图1描绘一幅图，显示正常大鼠中glycoPEG化FIX-R338A，FIX_R338A和重组野生型FIX的剂量标准化药动学概况。图2描绘一幅图，显示血友病B小鼠中glycoPEG化FIX-R338A, FIX-R338A和rFIX 的药动学概况。图3描绘一幅图，显示静脉内注射rFIX，FIX-R338A或glycoPEG化FIX-R338A后血友病B小鼠的血浆中的FIX活性。图4显示一项通过SDS-PAGE对有和无催化剂的情况中PEG化反应的时间过程分析。发明详述本发明提供包括一或多处氨基酸替代的FIX多肽。例如，经过修饰的FIX多肽可包含氨基酸残基85，86，87，338，和410处的至少一处替代。经过修饰的FIX多肽可具有升高的比活性，这会提供，例如，血友病B患者中延长的针对出血的保护时间。经过修饰的FIX 多肽会以比当前可用的野生型FIX蛋白疗法可能的次数少的FIX注射使血友病B患者能够实现针对出血的保护。活化后的因子VII (FVII)通过与因对血管壁的损害而暴露的组织因子(TF)形成复合物来启动正常止血过程。该复合物随后活化FIX;活性形式称作FIXa。FIX的活化肽通过因子XIa(FXIa)或组织因子(TF)/因子VIIa复合物在两个位点处的蛋白水解切割被切除以生成催化活性分子，因子1 (FIXa)。FMa和因子VIIIa (FVIIIa)将FX转变成因子 Xa (FXa)，其继而将凝血酶原转变成凝血酶。凝血酶然后将纤维蛋白原转变成纤维蛋白，导致纤维蛋白凝块形成。野生型FIX具有众多翻译后修饰，已经提出其中一些在体内药动学概况中发挥作用。一旦生成，FIX应保留酶活性并与FVIII，FXI，和FX相互作用以成为血友病B的有效治疗。引入替代氨基酸不应扰乱这些相互作用和功能。本申请部分地提供对FIX的修饰，其有可能导致升高的比活性及最低限度的功能扰乱。通过以较低的蛋白质水平赋予功效，增强FIX比活性的改变可补偿凝固活性的潜在损失而且还潜在延长经过修饰的分子的功效。
经过修饰的FIX多肽本发明提供包含一或多处氨基酸替代的FIX多肽，就是，经过修饰的FIX多肽。如本文中使用的，“因子IX”指FIX蛋白，其是内在凝固途径的一个成员且对于血液凝固是必须的。要理解，此定义包括天然以及重组形式的FIX蛋白。除非另有规定或指明，如本文中使用的，FIX意指在其在凝固中的正常作用中的任何功能性人FIX蛋白分子，包括其任何片段、类似物、变体、和衍生物。术语“片段”，“衍生物”，“类似物”，“突变蛋白”，和“变体”在涉及本申请的多肽时意指该多肽保留实质性相同生物学功能或活性的片段，衍生物，类似物， 突变蛋白，和变体。FIX多肽的非限制性例子包括FIX，FIXa,和FIX具有FIX活性的截短形式。任何前述维持至少一定程度FIX活性的生物学活性片段，删除变体，替代变体，或添加变体也可充当FIX多肽。在一些实施方案中，FIX多肽可包含与SEQ ID NO 1至少约70，80，90，或 95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽是生物学活性的。生物学活性可，例如，通过本文所述凝固测定法来测定。经过修饰的FIX多肽可含有保守氨基酸替代。保守替代在本领域中认定为用一种氨基酸替代具有相似特性的另一种氨基酸，而且包括，例如，丙氨酸变成丝氨酸；精氨酸变成赖氨酸；天冬酰胺变成谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变成谷氨酸；半胱氨酸变成丝氨酸； 谷氨酰胺变成天冬酰胺；谷氨酸变成天冬氨酸；甘氨酸变成脯氨酸；组氨酸变成天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变成亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变成缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变成精氨酸；甲硫氨酸变成亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变成酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变成苏氨酸；苏氨酸变成丝氨酸；色氨酸变成酪氨酸；酪氨酸变成色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变成异亮氨酸或亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO :1的FIX多肽包含1-30， 1-20，或1-10处保守氨基酸替代。特定氨基酸的单字母缩写，其对应氨基酸，和三字母缩写如下A，丙氨酸(Ala)； C，半胱氨酸(Cys) ；D，天冬氨酸(Asp) ；E，谷氨酸(Glu) ；F，苯丙氨酸(Phe) ；G，甘氨酸 (Gly) ；H，组氨酸(His) ；I，异亮氨酸(Ile) ；K，赖氨酸(Lys) ；L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨酸(Met) ；N，天冬酰胺(Asn) ；P，脯氨酸(Pro) ；Q，谷氨酰胺(Gln) ；R，精氨酸(Arg) ；S，丝氨酸(Ser) ；T，苏氨酸(Thr) ；V，缬氨酸(Val) ；W，色氨酸(Trp) ；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸 (Nle)。经过修饰的FIX多肽还可糖基化。多肽的糖基化通常是N-连接的或0-连接的。 N-连接指碳水化合物模块(moiety)附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列Asn-X-Ser和 Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促附着至Asn侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列任一的存在产生潜在的N-连接糖基化位点。一种例示性N-连接糖基化位点可表述如下Xl-Asn-X2-X3-X4 ；其中Xl任选是Asp，Val, Glu, Gly, 或Ile ；X2是除Pro外的任何氨基酸；X3是Ser或Thr ；且X4任选是Val, Glu, Gly，Gln,或 IIe。N-连接糖基化位点添加至FIX多肽通过改变氨基酸序列，使得一或多个上文所述三肽序列得到引入来实现。0-连接糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一附着至羟基氨基酸， 最常见附着至丝氨酸或苏氨酸，尽管附着至5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也是可能的。 0-连接糖基化位点添加至FIX多肽可通过改变氨基酸序列，使得一或多个Ser或Thr残基得到引入来实现。糖基化位点可，例如，通过删除一或多个氨基酸残基，一或多个内源FIX氨基酸残基用另一氨基酸替代，或添加一或多个氨基酸残基来引入。氨基酸残基的添加可以在天然 FIX分子的两个已有氨基酸残基之间或在N-或C-末端。所用氨基酸替代术语学如下。第一个字母代表人FIX的一个位置处天然存在的氨基酸残基。后面的数字代表成熟人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO 1)中的位置。第二个字母代表替代(替换/置换/取代)天然氨基酸的不同氨基酸。例如，V86A表示SEQ ID NO=I 位置86处的Val残基用Ala残基替换。本文中所用FIX残基编号系统指天然人FIX蛋白的，其中残基1代表成熟FIX多肽在切除信号序列和前肽(prop印tide) 二者之后的第一个氨基酸。天然或野生型FIX指 SEQ ID NO 1所示全长成熟人FIX分子。可能想要与对照多肽比较具有一或多处氨基酸替代的经过修饰的FIX多肽的特性。比较的特性包括，例如，溶解度，活性，血浆半衰期，和结合特性。为比较选择最适宜的对照多肽在本领域技术人员的见识之内。在一些实施方案中，对照多肽可以除一或多处氨基酸替代外与经过修饰的多肽相同。例示性多肽包括野生型FIX多肽和包含一或多处活化替代，诸如R338A和/或V86A的FIX多肽。本发明的一个方面提供经过修饰的FIX多肽，其具有与对照多肽相比升高的比活性。可能想要增强的比活性来降低实现治疗效果所需给药频率。因而，在某些实施方案中， FIX 多肽具有相对于对照蛋白升高约 20，30，40，60，80，100，150，200，300，400，500，600， 700，800，900，或 1000% 的比活性。如本文中将多肽药物施用于患者的语境中使用的，术语“半衰期”定义为患者中药物的血浆浓度降低一半所需时间。用于药动学分析和测定半衰期和体内稳定性的方法对于本领域技术人员会是熟悉的。详情可见于Kenneth，et al.，Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists 禾口 Peters, et al. , Pharmacokinetc analysis :A Practical Approach(1996)。还可参考"Pharmacokinetics，，，M Gibaldi&D Perron, published by Marcel Dekker，2nd Rev. edition(1982)，其记载药动学参数诸如 t-α和t-β半衰期和曲线下面积(AUC)。经过修饰的FIX多肽的活性可描述为绝对值，诸如以单位计，或相对于对照多肽的活性的百分比。FIX比活性可定义为在凝固级联中发挥功能，经与活化后的血小板上的 FVIIIa相互作用诱导FXa形成，或支持血液凝块形成的能力。活性可在体外通过诸如凝块分析等技术，如记载于，例如，McCarthy, et al.，(Thromb. Haemost. 87 :824-830,2002), 和本领域技术人员知道的其它技术来评估。活性也可在体内使用数种动物系之一来评估， 所述动物系故意以血友病B的遗传突变育种，使得自此类系生成的动物FIX缺陷的。此类系可得自多种来源诸如，但不限于，Division ofLaboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, N. Y.禾口 Department of Pathology, University ofNorth Carolina, Chapel Hill，N. C。这两种来源，例如，提供罹患犬血友病B的犬。或者,FIX 缺陷小鼠也是可得的(Sabatino，et al. ,Blood 104 :2767-2774,2005) 为了测试 FIX活性，将测试多肽注射入患病动物，做一小切口并与健康对照比较出血时间。人野生型FIX具有200个单位每mg左右的比活性。FIX的一个单位定义为1毫升正常(合并的)人血浆中存在的FIX的量(对应于100%的FIX水平)。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽可具有至少约200个单位，300个单位，400个单位，500个单位，或更多每mg FIX多肽的比活性。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽可具有至少约500 个单位，600个单位，700个单位，750个单位或更多每mg FIX多肽的比活性。在一些实施方案中，FIX的比活性可使用APTT或活化部分促凝血酶原激酶时间测定法(记载于，例如， Proctor, et al.，Am. J. Clin. Pathol. 36 :212,1961)来测量。当在细胞，诸如肝或肾细胞中表达时，FIX多肽可由细胞机制合成，经历翻译后修饰，并然后由细胞分泌入胞外环境。自细胞分泌的FIX多肽的量因此依赖于蛋白质翻译和胞外分泌这两种过程。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽可以相对于对照蛋白质分泌的量降低不超过约10，20，30，40，50，60，70，或80 %量分泌。例如，经过修饰的FIX多肽可以相对于对照FIX多肽降低不超过约80%的量分泌，如果经过修饰的多肽以与对照相比至少约20%的量分泌的话。FIX多肽分泌的量可，例如，通过使用任何公知方法测定胞外环境中的蛋白质水平来测量。用于蛋白质定量的传统方法包括2-D凝胶电泳，质谱术，和抗体结合。用于测定生物学样品中蛋白质水平的例示性方法包括基于抗体的技术，诸如免疫印迹(Western印迹)，免疫组织学测定法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，或放射免疫测定法 (RIA)。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽以相对于对照蛋白质与FVIII，FXI，或FX 中至少一种的相互作用降低不超过约40，50，60，70，或80%的水平与FVIII，FXI，或FX中至少一种相互作用。例如，经过修饰的FIX多肽可以相对于对照FIX多肽降低不超过约80% 的水平与FVIII，FXI，或FX中至少一种相互作用，如果经过修饰的多肽以与对照相比至少约20%的水平与FVIII，FXI，或FX中至少一种相互作用的话。FIX对凝固级联其它成员的结合可通过本领域技术人员知道的任何方法来测定，包括例如，Chang，et al. , (J.Biol. Chem. 273 :12089-12094,1998)中记载的方法。本申请部分提供包含一或多处氨基酸替代的FIX多肽。在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽:D85F ；D85G ；D85H ；D85I ；D85M ；D85N ；D85R ； D85S ；D85W ；D85Y ；V86A ；V86D ；V86E ；V86G ；V86H ；V86I ；V86L ；V86M ；V86N ；V86P ；V86Q ； V86R ；V86S ；V86T ；T87F ；T87I ；T87K ；T87M ；T87R ；T87V ；T87W ；R338A ；R338F ；R338I ；R338L ； R338M ；R338S ；R338T ；R338V ；R338W ；E410N ；E410Q ；或其任意组合。在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽D85W和T87R ； D85F 和 T87I ；D85W 和 T87W ；D85R 和 T85R ；D85I 和 T87R ；D85Y 和 T87F ；D85I 和 T87M ；D85F 和 T87R ；D85F 和 T87V ；D85R 和 T87K ；D85H 和 T87I ；D85I 和 T87I ；D85Y 和 T87K ；D85S 和 T87R ；D85Y 和 T87R ；D85G 和 T87K ；D85H 和 T87W ；D85H 和 T87K ；D85F 和 T87K ；D85H 和 T87V ； D85M 和 T87I ；D85H 和 T87M ；R338A 和 E410N ；R338A 和 E410Q ；或其任意组合在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽D85W，V86A， 和 T87R ；D85F, V86A,和 T87I ；D85W, V86A,和 T87W ；D85R, V86A,和 T85R ；D85I，V86A,和 T87R ； D85Y, V86A，和 T87F ；D85I, V86A，和 T87M ；D85F, V86A，和 T87R ；D85F, V86A，和 T87V ；D85R, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87I ；D85I，V86A,和 T87I ；D85Y, V86A,和 T87K ；D85S，V86A，和 T87R ；D85Y, V86A，和 T87R ；D85G, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87W ；D85H, V86A，和 T87K ； D85F, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87V ；D85M, V86A,和 T87I ；D85H, V86A,和 T87M ；或其任意组合在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽D85W，V86A， T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87I，和 R338A ；D85W, V86A, T87W，和 R338A ；D85R, V86A, T85R, 和 R338A ；D85I, V86A, T87R,和 R338A ；D85Y, V86A, T87F,和 R338A ；D85I, V86A, T87M,和 R338A ；D85F, V86A, T87R,和 R338A ；D85F, V86A, T87V,和 R338A ；D85R, V86A, T87K,和 R338A ； D85H, V86A, T87I，和 R338A ；D85I, V86A, T87I，和 R338A ；D85Y, V86A, T87K，和 R338A ；D85S, V86A, T87R，和 R338A ；D85Y, V86A, T87R，和 R338A ；D85G, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87W，和 R338A ；D85H, V86A, T87K，和 R338A ；D85F, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87V, 和 R338A ；D85M, V86A, T87I，和 R338A ；D85H, V86A, T87M，和 R338A ；或其任意组合。在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽D85W，V86A， T87R, R338A,禾口 E410N ；D85F, V86A, T87I, R338A,禾口 E410N ；D85W, V86A, T87W, R338A, 和 E410N ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87F, R338A，和 E410N ；D85I, V86A, T87M, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410N ；D85R, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87I, R338A，禾口 E410N ；D85I, V86A, T87I, R338A，禾口 E410N ；D85Y, V86A, T87K, R338A, 和 E410N ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85G, V86A, T87K, R338A，禾口 E410N ；D85H, V86A, T87W, R338A，禾口 E410N ；D85H, V86A, T87K, R338A, 和 E410N ；D85F, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87V, R338A,和 E410N ；D85M, V86A, T87I, R338A，禾口 E410N ；D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410N ；D85W, V86A, T87R, R338A, 和 E410Q ；D85F, V86A, T87I, R338A,和 E410Q ；D85W, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85R, V86A, T85R, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87R, R338A，禾口 E410Q ；D85Y, V86A, T87F, R338A, 和 E410Q ；D85I, V86A, T87M, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87V, R338A，禾口 E410Q ；D85R, V86A, T87K, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87I, R338A, 和 E410Q ；D85I, V86A, T87I, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85S, V86A, T87R, R338A，和 E410Q ；D85Y, V86A, T87R, R338A，和 E410Q ；D85G, V86A, T87K, R338A, 和 E410Q ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87K, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87V, R338A，禾口 E410Q ；D85M, V86A, T87I, R338A, 和 E410Q ；D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；及其任意组合。在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽(a)D85F ；D85G ；D85H ；D85I ；D85M ；D85N ；D85R ；D85S ；D85W ；D85Y ；V86A ；V86D ； V86E ；V86G ；V86H ；V86I ；V86L ；V86M ；V86N ；V86P ；V86Q ；V86R ；V86S ；V86T ；T87F ；T87I ； T87K ；T87M ；T87R ；T87V ；T87W ；R338A ；R338F ；R338I ；R338L ；R338M ；R338S ；R338T ；R338V ； R338W ；E410N ；E410Q ；(b) D85W 和 T87R ；D85F 和 T87I ；D85W 和 T87W ；D85R 和 T85R ；D85I 和 T87R ；D85Y 和 T87F ；D85I 和 T87M ；D85F 和 T87R ；D85F 和 T87V ；D85R 和 T87K ；D85H 和 T87I ；D85I 和 T87I ； D85Y 和 T87K ；D85S 和 T87R ；D85Y 和 T87R ；D85G 和 T87K ；D85H 和 T87W ；D85H 和 T87K ；D85F 和 T87K ；D85H 和 T87V ；D85M 和 T87I ；D85H 和 T87M ；(c) D85W, V86A,和 T87R ；D85F, V86A,和 T87I ；D85W, V86A,和 T87W ；D85R, V86A,和 T85R ；D85I, V86A，和 T87R ；D85Y, V86A，和 T87F ；D85I, V86A，和 T87M ；D85F, V86A，和 T87R ；D85F, V86A，和 T87V ；D85R, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87I ；D85I, V86A，和 T87I ；D85Y, V86A,和 T87K ；D85S，V86A，和 T87R ；D85Y, V86A,和 T87R ；D85G, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87W ；D85H, V86A，和 T87K ；D85F, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87V ；D85M, V86A，和 T87I ； D85H, V86A,和 T87M ；R338A 和 E410N ；R338A 和 E410Q ；(d) D85W, V86A, T87R,和 R338A ；D85F, V86A, T87I，和 R338A ；D85W, V86A, T87W,和 R338A ；D85R, V86A, T85R,和 R338A ；D85I，V86A, T87R,和 R338A ；D85Y, V86A, T87F,和 R338A ； D85I, V86A, T87M，和 R338A ；D85F, V86A, T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87V，和 R338A ；D85R, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87I，和 R338A ；D85I, V86A, T87I，和 R338A ；D85Y, V86A, T87K，和 R338A ；D85S, V86A, T87R，和 R338A ；D85Y, V86A, T87R，和 R338A ；D85G, V86A, T87K, 和 R338A ；D85H, V86A, T87W,和 R338A ；D85H, V86A, T87K,和 R338A ；D85F, V86A, T87K,和 R338A ；D85H,V86A,T87V,^P R338A ；D85M，V86A，T87I，和 R338A ；D85H，V86A，T87M，和 R338A ；(e) D85W, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85F, V86A, T87I，R338A,和 E410N ；D85W, V86A, T87W, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T85R, R338A，禾口 E410N ；D85I, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85Y, V86A, T87F, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87M, R338A,和 E410N ；D85F, V86A, T87R, R338A，禾口 E410N ；D85F, V86A, T87V, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T87K, R338A, 和 E410N ；D85H, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87K, R338A，禾口 E410N ；D85S, V86A, T87R, R338A，禾口 E410N ；D85Y, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85H, V86A, T87V, R338A, 和 E410N ；D85M, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87M, R338A,和 E410N ；D85W, V86A, T87R, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85W, V86A, T87W, R338A, 和 E410Q ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410Q ；D85I, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87F, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87R, R338A, 和 E410Q ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410Q ；D85R, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85Y, V86A, T87K, R338A, 和 E410Q ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87K, R338A，和 E410Q ；D85H, V86A, T87V, R338A，和 E410Q ；D85M, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；及其任意组合。本发明的又一个方面提供具有升高的比活性的FIX多肽。在一些实施方案中，多肽可具有至少约 200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1400，1600，1800， 2000，4000，6000，8000，或更多单位每mg多肽的比活性。比活性可如先前所述测定，诸如， 例如，使用APTT测定法。这些多肽可用作治疗剂，特别是在罹患血友病B的患者中。这些多肽可包含别的替代或修饰，诸如本文所述糖基化位点。本发明的一个方面提供经过修饰的因子IX多肽，其包含下述氨基酸序列YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGD
QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELX85X86X87CNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPffQ
VVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNS YVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLX338STKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQ⑶SGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKX410KTKLT(SEQ ID NO:2)；其中)(85选自 D，F，G，H，I，M，N，R，S，W，和 Y ；其中X86 选自 A，D，E，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，和 V ；其中)(87选自卩，1，1(，1，1 ，1^，和1;其中Xm8 选自 A，F，I，L，M，R，S，T，V，和 W;其中X410 选自 E，N，和 Q。引入至少一处氨基酸替代是至少一个X位置处的替代的结果。在一些实施方案中，经过修饰的多肽另外包含约1-30，1-20，或1-10个连续氨基酸变化且维持FIX活性。在一些实施方案中，经过修饰的多肽与SEQ ID NO :1至少约80，85，90，95，或99%相同(同一性)且维持FIX活性。经过修饰的FIX多Jft的生成氨基酸序列改变可通过多种技术来实现，诸如，例如，通过以位点特异性诱变修饰对应核酸序列。用于位点特异性诱变的技术是本领域公知的且记载于，例如，Zoller, et al.，(DNA3 :479-488,1984)或 Horton, et al.，(Gene 77 :61-68,1989，pp. 61-68)。如此， 使用FIX的核苷酸和氨基酸序列，可进入选定的改变。类似地，使用特异性引物通过聚合酶链式反应制备DNA构建物的规程是本领域技术人员公知的(参见，例如，PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA)。编码FIX多肽的核酸构建物也可通过已建立的标准方法合成制备，例如， Beaucage, et al.，(Gene Amplif. Anal. 3 :1-26,1983)记载的亚磷酰胺法。依照亚磷酰胺法，合成寡核苷酸(例如，在自动DNA合成仪中)，纯化，退火，连接，并在合适载体中克隆。 编码FIX多肽的DNA序列也可通过聚合酶链式反应使用特异性引物来制备，例如，记载于美国专利 No. 4，683，202 ；或 Saiki，et al.，(Science 239 :487-491,1988)。另外，核酸构建物可以是合成起源和基因组起源的混合，合成起源和cDNA起源的混合，或基因组起源和cDNA 起源的混合，通过依照标准技术连接与完整核酸构建物的各个部分对应的合成，基因组，或 cDNA起源的片段来制备(在恰当时)。编码FIX多肽的DNA序列可使用重组DNA规程插入重组载体中。载体的选择常常会依赖于载体要导入的宿主。载体可以是自主复制载体或整合载体。自主复制载体作为染色体外实体存在，而且它的复制不依赖染色体复制，例如，质粒。整合载体指整合入宿主细胞基因组中的载体，而且与它所整合的染色体一起复制。载体可以是表达载体，其中编码经过修饰的FIX的DNA序列与DNA的转录，翻译， 或加工所需别的区段，诸如启动子，终止子，和聚腺苷酸化位点可操作连接。一般地，表达载体可衍生自质粒或病毒DNA，或者可含有二者的元件。术语“可操作连接”指示各区段的排列使得它们协调发挥功能以实现它们的预定目的，例如，转录在启动子中启动并穿过编码多肽的DNA序列前进。表达FIX多肽中使用的表达载体可包含能够指导克隆的基因或cDNA转录的启动子。启动子可以是在选定的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，而且可以衍生自编码对宿主细胞而言同源或异源的蛋白质的基因。适合于在哺乳动物细胞中指导编码FIX多肽的DNA转录的启动子的例子是，例如， SV40 启动子(Subramani, et al.，Mol. Cell Biol. 1 :854-864,1981)，MT-I (金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter, et al.，Science 222 :809-814,1983), CMV 启动子(Boshart, et al.，Cell 41 :521_530，1985)，或腺病毒 2 主要晚期启动子(Kaufman et al.，，Mol. Cell Biol,2 :1304-1319,1982)。编码FIX多肽的DNA序列也可，在必要时，可操作连接合适的终止子，诸如人生长激素终止子(Palmiter，et al.，Science 222 :809-814,1983)或 TPIl(Alber et al.， J. Mol. Appl. Gen. 1 :419-434,1982)或 ADH3(McKnight, et al.，EMBO J. 4 :2093-2099, 1985)终止子。表达载体也可含有位于插入位点下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号，来自腺病毒5ΕΛ区的聚腺苷酸化信号，人生长激素基因终止子(DeNoto，et al.，Nucl. Acids Res. 9 :3719_3730，1981)，或来自人 FIX 基因的聚腺苷酸化信号。表达载体也可包括增强子序列，诸如SV40增强子。为了引导本发明的FIX多肽入宿主细胞的分泌途径，可使用天然FIX分泌信号序列。或者，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称作前导序列，前原序列，或前序列)。 分泌信号序列可以正确的读码框连接编码FIX类似物的DNA序列。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5’。例示性信号序列包括，例如，MPIF-I信号序列和司腺钙蛋白信号序列。用于连接编码FIX多肽的DNA序列，启动子，和任选的终止子和/或分泌信号序列及将它们插入含有复制必需信息的合适载体中的规程，是本领域技术人员公知的(参见， 例如，Sambrook et al. , Molecular Cloning :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York,1989)。转染哺乳动物细胞和表达导入细胞中的DNA序列的方法记载于，例如，Kaufman, et al. , (J. Mol. Biol. 159 :601-621,1982) ；Southern, et al. , (J. Mol. Appl. Genet. 1 327-341,1982) ；Loyter, et al.，(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 :422-426,1982) ；Wigler, et al. , (Cell 14:725-731,1978) ；Corsaro, et al. , (Somatic Cell Genetics 7: 603-616,1981),Graham,et al. ， (Virology 52 :456-467,1973)；禾口Neumann，et al. ， (ΕΜΒ0 J. 1 :841-845,1982)。克隆的DNA序列可通过，例如，脂转染，DEAE-右旋糖酐介导的转染，显微注射，原生质体融合，磷酸钙沉淀，逆转录病毒投递，电穿孔，声穿孔，激光辐照，磁转染， 天然转化，和生物射弹转化导入培养的哺乳动物细胞中(参见，例如，Mehier-Humbert, et al.，Adv. Drug Deliv. Rev. 57 =733-753, 2005) 为了鉴定和选择表达外源 DNA 的细胞，一般将赋予可选择表型的基因(选择标志)与感兴趣基因或cDNA—起导入细胞中。选择标志包括，例如，赋予对药物诸如新霉素，嘌呤霉素，潮霉素，和甲氨蝶呤的抗性的基因。选择标志可以是可扩增的选择标志，其允许标志和外源DNA在序列相连接时扩增。例示性可扩增选择标志包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和腺苷脱氨酶。选择合适的选择标志在本领域技术人员的见识之内(参见，例如，美国专利No. 5，238，820)。在细胞经DNA转染之后，在适宜的生长培养基培养细胞以表达感兴趣基因。如本文中使用的，术语“适宜的生长培养基”意指含有营养物和细胞生长和活性FIX多肽表达所需其它成分的培养基。培养基一般包括，例如，碳源，氮源，必需氨基酸，必需糖，维生素，盐，磷脂，蛋白质，和生长因子，而且在维生素K依赖性蛋白质诸如FIX的情况中，还可提供维生素K。然后应用药物选择来选择以稳定方式表达选择标志的细胞的生长。对于经可扩增选择标志转染的细胞，可提高药物浓度以选择克隆的序列的拷贝数的增多，由此提高表达水平。然后对稳定转染细胞的克隆筛选FIX多肽的表达。本发明中使用的哺乳动物细胞系的例子是C0S-1(ATCC CRL 1650)，幼仓鼠肾 (BHK)，HKBll 细胞(Cho, et al.，J. Biomed. Sci，9 :631_638，2002)，和 HEK-293 (ATCC CRL 1573 ；Graham, et al.，J. Gen. Virol. 36 =59-72,1977)细胞系。另外，多种其它细胞系可用于本发明之内，包括大鼠H印I (大鼠肝瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印II (大鼠肝瘤；ATCC CRL 1548)，TCMK-I(ATCC CCL 139)，H印-G2(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCC CCL 9. 1)， CHO-Kl (ATCC CCL 61)，和 CH0-DUKX 细胞(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220,1980)。FIX多肽可以自细胞培养液回收，而且然后可以通过本领域已知的多种规程来纯化，包括，但不限于，层析(例如，离子交换，亲和，疏水，层析聚焦，和大小排阻)，电泳规程(例如，制备性等电聚焦(IEF)，差异溶解性(例如，硫酸铵沉淀))，提取(参见，例如， Protein Purification， Janson and Lars Ryden, editors， VCH Publishers， New York， 1989)，或其各种组合。在一个例示性实施方案中，多肽可以通过抗FIX抗体柱上的亲和层析来纯化。别的纯化可以通过常规化学纯化手段来实现，诸如高效液相层析。其它纯化方法是本领域已知的，而且可以应用于经过修饰的FIX多肽的纯化(参见，例如，Scopes, R.， Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. ,1982)。一般地，“纯化的”应当指已经进行过分级以清除各种其它成分，而且基本上保留其表达的生物学活性的蛋白质或肽组合物。在使用术语“实质性纯化的”(substantially purified)的情况中，这种表述应当指如下的组合物，其中蛋白质或肽构成该组合物的主要成分，诸如占该组合物中蛋白质的约50 %，约60 %，约70 %，约80 %，约90 %，约95 %，约 99%，或更多。本领域技术人员知道用于定量多肽纯化程度的多种方法。这些包括，例如，测定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析来评估级分内多肽的量。用于评估级分纯度的一种例示性方法是计算级分的比活性，将该活性与初始提取物的比活性比较，并如此计算纯度， 本文中通过“纯化倍数”来评估。用于代表活性量的实际单位，当然，会依赖于特定测定技术。在一些实施方案中，在组织培养细胞中重组表达FIX多肽，而且糖基化是宿主细胞，诸如哺乳动物细胞的正常翻译后细胞功能的结果。在其它情况中，细胞经过遗传工程改造以表达酶和期望多肽的组合，使得细胞内发生期望糖模块添加至表达的多肽。或者，糖基化可经由化学或酶促修饰来实现(参见，例如，Lee, et al.，J. Biol. Chem. 264 13848-13855,1989)。本领域建议了多种方法来定制多肽的糖基化样式(参见，例如， WO 99/22764 ；W098/58964 ；WO 99/54342 ；美国公开 No. 2008/0050772 ；和美国专利 No. 5，047，335)。聚合物缀合
经过修饰的FIX多肽可进一步包含一或多个聚合物缀合位点，其可用于附着聚合物模块。在一些实施方案中，FIX多肽可缀合至生物相容的聚合物。可选择生物相容的聚合物来提供期望的药动学改善。例如，可选择聚合物的身份、大小、和结构以改善具有FIX活性的多肽的循环半衰期或降低多肽的抗原性且没有不可接受的活性降低。经过修饰的FIX多肽可包括一或多个糖模块，其天然地在哺乳动物中在 exoression期间附着至该肽。在一些实施方案中，糖模块可充当用于附着聚合物模块的缀合位点。在一些实施方案中，聚合物模块可使用各种接头或连接化学附着至糖模块。例如， 聚合物模块可通过腙连接或氨基-氧连接缀合至糖模块。在本发明中有用的聚合物的例子包括但不限于聚(烯二醇)(poly(alkylene glycols))诸如聚乙二醇(PEG)，聚(丙二醇)(“PPG”)，乙二醇和丙二醇的共聚物等等， 聚(乙氧基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟基烃基甲基丙烯酰胺)， 聚(羟基烃基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羟基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚P恶唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，聚唾液酸，羟乙基淀粉(HEQ，聚氧化乙烯，烃基-聚氧化乙烯，二聚氧化乙烯，聚氧化烯的共聚物或嵌段共聚物，聚(乙二醇-共-丙二醇)，聚(Ν-2-(羟基丙基)甲基丙烯酰胺)，和右旋糖酐(poly(propylene glycol) ( "PPG"), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol and the like, poly(oxyethylated polyol)， poly (olefinic alcohol)，poly (vinylpyrroIidone)，poly (hydroxyalkylmethacrylamide )，poly (hydroxyalkylmethacrylate), poly (saccharides), poly (alpha-hydroxy acid), poly (vinyl alcohol)，polyphosphazene,polyoxazoline,poly (N-acryIoylmorpholine)， polysialic acid,hydroxyethyl starch(HES),polyethylene oxide,alkyl-polyethylene oxides, bispolyethylene oxides, co-polymers or block co-polymers of polyalkyene oxides, poly(ethylene glycol-co-propylene glycol), poly (N-2- (hydroxyproply) methyacrylamide)，and dextran) 0聚合物不限于特定结构，而且可以是线性的(例如，烃氧基PEG或双功能PEG)，或非线性的诸如分支的，分叉的，多臂的(例如，附着至多元醇核心的PEG)，和树状的。此外， 聚合物的内部结构可以以任意数目的不同样式组织，而且可以选自下组均聚物，交替共聚物，随机共聚物，嵌段共聚物，交替三聚物，随机三聚物，和嵌段三聚物。PEG和其它水溶性聚合物(S卩，聚合试剂)可以用适合偶联至FIX多肽上期望位点的合适活化基团来活化。如此，聚合试剂会拥有用于与FIX多肽反应的反应性基团。代表性聚合试剂和用于将这些聚合物缀合至活性模块的方法是本领域已知，而且进一步记载于 Zalipsky,et al. ,("Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry :Biotechnical and Biomedical Applications, J.M.Harris, Plenus Press, New York(1992)), 及 Zalipsky(Adv. Drug Rev. 16 :157-182,1995)。聚合物的重量平均分子量可以为约100道尔顿至约150，000道尔顿。例示性范围，然而，包括大于约5，000道尔顿至约100，000道尔顿的范围中的，约6，000道尔顿至约90，000道尔顿的范围中的，约10，000道尔顿至约85，000道尔顿的范围中的，大于约 10，000道尔顿至约85，000道尔顿的范围中的，约20，000道尔顿至约85，000道尔顿的范围中的，约53，000道尔顿至约85，000道尔顿的范围中的，约25，000道尔顿至约120，000道尔顿的范围中的，约29，000道尔顿至约120，000道尔顿的范围中的，约35，000道尔顿至约 120，000道尔顿的范围中的，和约40，000道尔顿至约120，000道尔顿的范围中的重量平均
分子量。生物相容聚合物的例示性重量平均分子量包括约100道尔顿，约200道尔顿，约 300道尔顿，约400道尔顿，约500道尔顿，约600道尔顿，约700道尔顿，约750道尔顿，约 800道尔顿，约900道尔顿，约1，000道尔顿，约1，500道尔顿，约2，000道尔顿，约2，200道尔顿，约2，500道尔顿，约3，000道尔顿，约4，000道尔顿，约4，400道尔顿，约4，500道尔顿，约5，000道尔顿，约5，500道尔顿，约6，000道尔顿，约7，000道尔顿，约7，500道尔顿， 约8，000道尔顿，约9，000道尔顿，约10,000道尔顿，约11,000道尔顿，约12,000道尔顿， 约13,000道尔顿，约14，000道尔顿，约15,000道尔顿，约20,000道尔顿，约22，500道尔顿，约25，000道尔顿，约30，000道尔顿，约35，000道尔顿，约40，000道尔顿，约45，000道尔顿，约50，000道尔顿，约55，000道尔顿，约60，000道尔顿，约65，000道尔顿，约70，000 道尔顿，和约75，000道尔顿。也可使用具有任何前述总分子量的前述分支型式的生物相容聚合物(例如，由两个20，000道尔顿聚合物构成的分支40，000道尔顿聚合物)。在一些实施方案中，聚合物是PEG。PEG是公知的，水溶性聚合物，其是商品化的或可以依照本领域公知方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161)。术语"PEG，，广义用于涵盖任何聚乙二醇分子，不管大小或PEG末端处的修饰，而且可以以下式表示=X-O(CH2CH2O) P1CH2CH2OH,其中η是20至2300且X是H或末端修饰，例如，C^4烃基。PEG可含有别的化学基团，其是结合反应必需的，其源自该分子的化学合成，或起该分子各部分的最佳距离的间隔物的作用。另外，此类PEG可以由连接到一起的一或多个PEG侧链组成。具有超过一个 PEG链的PEG称作多臂或分支PEG。分支PEG可，例如，通过将聚氧化乙烯添加至各种多元醇包括甘油，季戊四醇，和山梨醇来制备。例如，四臂分支PEG可以自季戊四醇和氧化乙烯制备。分支PEG的例子记载于，例如，欧洲已公布申请No. 473084A和美国专利No. 5，932，462。 一种形式的PEG包括经赖氨酸的伯氨基连接的两个PEG侧链(PEG2) (Monfardini, et al.， Bioconjugate Chem. 6 :62-69,1995)。在一个实施方案中，聚合物可以是末端加帽聚合物，就是，具有至少一个用相对惰性基团，诸如低级Ch6烃氧基，尽管也可使用羟基加帽的末端的聚合物。当聚合物是PEG时， 例如，可使用甲氧基-PEG (通常称作mPEG)，其是PEG的一种线性形式，其中聚合物的一个末端具有甲氧基(一OCH3)，而另一个末端是羟基或可任选化学修饰的其它官能团。多臂或分支PEG分子，诸如美国专利No. 5，932，462中记载的那些，也可用作PEG 聚合物。另外，PEG可包含分叉PEG(参见，例如，PCT公开号W01999/45964，披露了能够用于本发明的一或多个实施方案的多种分叉PEG结构)。将Z官能团连接至分支碳原子的原子链充当系链基团，而且可以包含，例如，烃基链，醚链，酯链，酰胺链，及其组合。PEG聚合物也可含有沿着PEG的长度而非在PEG链的末端共价附着的悬挂PEG分子，其具有反应性基团，诸如羧基。悬挂的反应性基团可直接或经由间隔物模块，诸如亚烃基附着至PEG。为了实现聚合物分子对多肽的共价附着，聚合物分子的羟基端基必须以活化后的形式提供，就是，反应性官能团(其例子包括伯氨基，酰胼(HZ)，硫醇基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亚氨基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亚氨基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亚氨基丙酸酯(SPA)，琥珀酰亚氨基丁酸酯(SBA)，琥珀酰亚氨基羧甲酯(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羟基琥珀酰亚胺(MB)，醛，硝基苯基碳酸酯(NPC)，和tresylate (TRES))。适当活化的聚合物分子是商品化的，例如，NOF，Japan ；Nektar Therapeutics, Inc. ，Huntsville, Ala. ；PoIyMASC Pharmaceuticals pic, UK ；或 SunBio Corporation, Anyang City, South Korea。或者，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法来活化(参见，例如，WO 90/13540)。适合于在本发明中使用的活化后的线性或分支聚合物分子的具体例子是商品化的，例如，NOF, Japan ； Nektar Therapeutics, Inc.，Huntsville，Ala。活化后的PEG聚合物的具体例子包括下述线性 PEG NHS-PEG, SPA-PEG,SSPA-PEG,SBA-PEG,SS-PEG,SSA-PEG, SC-PEG,SG-PEG, SCM-PEG, NOR-PEG， BTC-PEG， EPOX-PEG, NC0-PEG， NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG， TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, 10D0-PEG,和 MAL-PEG，和分支 PEG，诸如 PEG2-NHS，PEG2-MAL，和，例如，美国专利 No. 5，932，462和美国专利No. 5，643，575中披露的那些，通过述及将二者收入本文。在一个实施方案中，聚合物具有硫氢基反应性模块，其可与FIX多肽上的游离半胱氨酸反应以形成共价连接。此类硫氢基反应性模块包括硫醇，triflate，tresylate，氮丙啶，环氧乙烷，S-吡啶基，或马来酰亚胺模块。另外，下述出版物，通过述及收入本文，披露了有用的聚合物分子和/或PEG化化学美国专利No. 6，113,906 ；7, 199，223 ；5，824，778 ； 5，476，653 ；4，902，502 ；5，281，698 ；5，122，614 ；5，219，564 ；5，736，625 ；5，473，034 ； 5,516,673 ；5,629, 384 ；5,382, 657 ；WO 97/32607 ；WO 92/16555 ；WO 94/04193 ；WO 94/14758 ；WO 94/17039 ；WO 94/18247 ；WO 94/28024 ；WO 95/00162 ；WO 95/11924 ； W095/13090 ；WO 95/33490 ；WO 96/00080 ；WO 97/18832 ；WO 98/41562 ；WO 98/48837 ； WO 99/32134；WO 99/32139 ；WO 99/32140 ；WO 96/40791 ；WO 98/32466 ；WO 95/06058 ； WO 97/03106 ；WO 96/21469 ；WO 95/13312 ；WO 98/05363 ；WO 96/41813 ；WO 96/07670 ； EP809996 ；EP921131 ；EP605963 ；EP510356 ；EP400472 ；EP183503 ；EP154316 ；EP229108 ； EP402378 ；和 EP439508。对于半胱氨酸残基的PEG化，可以在PEG化之前用还原剂，诸如二硫苏糖醇 (DDT)处理多肽。随后可以通过任何便利方法，诸如通过脱盐来清除还原剂。PEG对半胱氨酸残基的缀合通常在PH 6-9的合适缓冲液中于4°C至25°C变化的温度发生长至约16小时的时段。用于偶联至半胱氨酸残基的活化后的PEG聚合物的例子包括， 例如，下述线性和分支PEG 乙烯基砜-PEG (PEG-VS)，诸如乙烯基砜-mPEG (mPEG-VS)； 正吡啶基-二硫化物-PEG (PEG-OPSS)，诸如正吡啶基-二硫化物-mPEG (MPEG-0PSS)； 和马来酰亚胺-PEG (PEG-MAL)，诸如马来酰亚胺-mPEG (mPEG-MAL)和分支马来酰亚胺-mPEG2(mPEG2-MAL)。在一个实施方案中，具有一或多个引入的聚合物缀合位点的FIX多肽可在细胞中表达，细胞在含有半胱氨酸的细胞培养基中培养，半胱氨酸通过形成二硫键对该多肽的半胱氨酸残基“加帽”。为了将聚合物缀合物添加至FIX多肽，半胱氨酸帽可通过温和还原以释放该帽来消除，然后添加半胱氨酸特异性聚合物试剂。本申请还提供用于制备聚合物缀合的FIX多肽的方法，包括将聚合物缀合位点， 就是，半胱氨酸残基引入编码FIX多肽的核苷酸序列；表达该突变核苷酸序列以生成包含引入的聚合物缀合位点的多肽；纯化该多肽；使该多肽与已经活化以与多肽在还原的半胱氨酸残基处反应的生物相容聚合物反应，使得缀合物形成；并纯化该缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供用于FIX多肽突变蛋白的定点PEG化的方法，包括(a)表达包含引入的聚合物缀合位点，就是，在FIX多肽的暴露表面上引入的半胱氨酸残基的FIX多肽，其中该半胱氨酸是加帽的；(b)使该FIX多肽与还原剂在温和还原该引入的半胱氨酸并释放该帽的条件下接触；(c)自该FIX多肽消除该帽和该还原剂；并(d)在消除该还原剂后至少约 5，15，或30分钟之后，在使得PEG化FIX多肽生成的条件下用包含硫氢基偶联模块的PEG 处理该FIX多肽。PEG的硫氢基偶联模块选自下组硫醇，triflathtresylate，氮丙啶，环氧乙烷，S-吡啶基，和马来酰亚胺模块。下文描述一种生成PEG化FIX多肽的例示性方法。将约1 μ M纯化的包含引入的非天然半胱氨酸残基的FIX多肽用还原剂诸如0. 7mM Tris (2-羧乙基)膦(TCEP)或0. 07mM 二硫苏糖醇(DTT)于4°C温和还原30分钟以释放“帽”。通过大小排阻层析(SEC)法诸如穿过旋转柱运行样品与“帽”一起清除还原剂以容许二硫化物再形成同时留下引入的半胱氨酸处于游离和还原状态。清除还原剂之后至少30分钟，将FIX多肽用至少10倍摩尔过量的大小范围5至85kD的PEG-马来酰亚胺于4°C处理至少1小时。FIX的聚合物缀合可通过本领域技术人员知道的任何方法来评估。例如，聚合物缀合FIX可通过还原性6% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶上的电泳来分析。电泳后，凝胶可以用考马斯蓝以鉴定所有蛋白质或进行标准Western印迹方案，以鉴定与未缀合FIX 多肽相比的条带分子量位移。对PEG特异性的碘化钡染色可用于确认分子量有位移的条带包含PEG化蛋白质。聚合物缀合之前和之后的FIX多肽也可通过基质辅助激光解吸/电离 (MALDI)质谱术来分析，以测定聚合物缀合的程度和效率。在一些实施方案中，聚合物缀合可发生于通过糖基化附着的一或多个糖模块。此类聚合物缀合的方法是本领域已知的，而且记载于例如W094/05332，US2009/0081188和US 5，621，039，通过述及而收录它们。在聚合物是PEG的情况中，它通常也称作glycoPEG化。在一些实施方案中，通过US 5，621，039在提供的化学附着进行的聚合物缀合可通过添加催化剂来改善。在一些实施方案中，催化剂是化学催化剂。例如，化学催化剂可以是苯胺，其可用于提高糖上的游离醛和氨基之间的反应的效率。在其它实施方案中，其它合适的化学催化剂可以是苯胺衍生物诸如o-Cl-，p-Cl-，O-CH3O-, P-CH3O-,和p-CH3-苯胺。在一些实施方案中，聚合物缀合可发生于FIX中的天然发生糖基化位点。野生型因子IX具有两个N-连接糖基化位点，其含有因子IX的总唾液酸含量的约80%。这两个 N-连接位点(W57和N167)都位于活化肽内，活化肽在凝固级联的扩展期间在两个位点 (R145-Alal46)和(R180-V181)处切割以生成催化活性FMa分子。在FIX中的天然发生糖基化位点处的聚合物缀合之外，可能想要在位于FIX蛋白的不同域中的备选位点处缀合聚合物。这可如下来实现，首先消除位置m57和m67处的天然发生N-连接糖基化位点，通过例如将附57变成A157和将附67变成A167进行，其次在该分子中的别处引入新的功能性N-连接糖基化位点，例如在催化域或两个EGF域之一中。 此类新的功能性N-连接糖基化位点先前披露于PCT US2009/040813。药物组合物基于用于测定哺乳动物中上文鉴定的状况的治疗功效的公知测定法，及通过将这些结果与用于治疗这些状况的已知药物的结果比较，可容易地为每种期望适应证的治疗确定本发明多肽的有效剂量。这些状况之一的治疗中要施用的活性组分的量可依据诸如采用的特定多肽和剂量单位，施用的模式，治疗的时段，所治疗患者的年龄和性别，及所治疗状况的性质和程度等考量而广泛变化。本申请部分提供包含本文所述具有一或多处氨基酸替代的FIX多肽的组合物。该组合物可适合于体内施用，而且是没有热原的。该组合物还可包含药学可接受载体。短语 “药学或药理学可接受”指当施用于动物或人时不产生不利的，变应性的，或其它不良反应的分子实体和组合物。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，涂层，抗细菌和抗真菌剂，等张和吸收延迟剂，等等。此类介质和药剂对药学活性物质的使用是本领域公知的。也可将补充性活性组分掺入该组合物中。本发明的组合物包括经典药物制备物。依照本发明的这些组合物的施用可经由任何常规路径。药物组合物可通过任何常规方法导入受试者中，例如，通过静脉内，皮内，肌肉内，皮下，或经皮投递。治疗可以由单剂或一段时间里的多剂组成。活性化合物可制备成游离碱或药理学可接受盐在水中的溶液供施用。也可在液体聚乙二醇中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物的生长。适合于注射使用的药学形式包括无菌水溶液或分散体和用于临场制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。该形式应当是无菌的，而且流动性的程度应当容易进行注射。 它在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物，诸如细菌和真菌的污染作用进行防腐。载体可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇，等等)，蔗糖，L-组氨酸，聚山梨酯80，或其合适混合物。对微生物作用的预防可以由各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，山梨酸，硫柳萊， 等等产生。可注射组合物可包括等张剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂来产生。无菌可注射溶液可通过在根据需要具有上文所列各种其它组分的适宜溶剂中中掺入所需量的活性化合物(例如，FIX多肽)，接着过滤除菌来制备。一般地，分散体可通过将各种经过灭菌的活性组合掺入含有基础分散介质和来自上文所列的所需其它组分的无菌媒介中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况中，制备方法包括，例如，真空-干燥和冷冻-干燥技术，其自先前无菌过滤的溶液产生活性组分加任何别的期望组分的粉末。组合物也可包括抗微生物剂以防止或阻止微生物生长。适合于本发明的抗微生物剂的非限制性例子包括苯扎氯铵，苄索氯铵，苯甲醇，西吡氯铵，氯丁醇，酚，苯乙醇，硝酸苯汞，硫柳汞，及其组合。组合物中也可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可用于防止氧化，由此防止ζ制备物的变质。适合于在本发明中使用的抗氧化剂包括，例如，抗坏血酸棕榈酸酯，丁羟茴醚，丁羟甲苯，次磷酸，硫代甘油，没食子酸丙酯，亚硫酸氢钠，甲醛次硫酸钠，偏亚硫酸氢钠，及其组
I=I O表面活性剂可作为赋形剂存在。例示性表面活性剂包括聚山梨酯诸如Tween -20(聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯)和Tween _80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和 Pluronics诸如F68和F88 ( 二者均可购自BASF, Mount Olive, N. J.)；山梨聚糖酯；脂质诸如磷脂诸如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，脂肪酸和脂肪酯；类固醇诸如胆固醇；和螯合剂诸如EDTA，锌和其它此类合适阳离子。酸或碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可使用的酸的非限制性例子包括氢氯酸，乙酸，磷酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸，甲酸，三氯乙酸，硝酸，高氯酸，磷酸，硫酸，富马酸，及其组合。合适的碱的例子包括，但不限于，氢氧化钠，乙酸钠，氢氧化铵，氢氧化钾，乙酸铵， 乙酸钾，磷酸钠，磷酸钾，柠檬酸钠，甲酸钠，硫酸钠，硫酸钾，富马酸钾，及其组合。组合物中任何各种赋形剂的量可以随赋形剂的活性和组合物的具体需要而变化。 典型地，任何各赋形剂的最佳量可以经由例行实验来确定，就是，通过制备含有不同量的赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其它参数，然后确定获得最佳性能且没有显著不良效应的范围。一般地，赋形剂可以以约至约99% (以重量计)，约5%至约 98% (以重量计)，约15至约95% (以赋形剂的重量计)的量，以小于30% (以重量计) 的浓度存在于组合物中。这些前述制药学赋形剂连同其它赋形剂记载于“Remington =The Science&Practice of Pharmacy，，，19ed·，Wi 11 iams&Wi 11 iams, (1995) ；"Physician ' s Desk Reference”，52ed.，Medical Economics，Montvale，N. J. (1998)；及 Kibbe，A. H.， Handbook of Pharmaceutical Excipients,3 Edition， American Pharmaceutical Association，Washington, D.C.，2000。在配制后，可以以与剂量配制剂相容的方式及以诸如治疗有效量施用溶液。“治疗有效量”在本文中用于指在血流中或在靶组织中提供期望水平的多肽需要的多肽量。精确量会取决于众多因子，例如，具体的FIX多肽，治疗性组合物的成分和物理特征，预定的患者群体，投递的模式，患者个体考量，等等，而且可以由本领域技术人员基于本文中提供的信息容易地确定。可以以多种剂量形式容易地施用配制剂，诸如可注射溶液，等等。对于例如水溶液中的胃肠外施用，溶液应当在必要时适当缓冲，而且液体稀释剂应当首先用足够盐水或葡萄糖使得其等张。这些特定水溶液尤其适合于静脉内，肌肉内，皮下和腹膜内施用。FIX的剂量通常表述成单位。一个单位的FIX每kg体重可将血浆水平升高0. OlU/ !!^，就是，丨^。其它方面健康的患者具有一个单位的FIX每ml血浆，就是，100%。血友病B 的温和病例定义为FIX血浆浓度介于6-60%之间，中等病例介于1-5%之间，而严重病例， 其占血友病B病例的约一半，具有低于FIX。预防性处理或轻微出血的处理通常要求将 FIX水平提高至介于15-30%之间。中等出血的处理通常要求将水平提高至介于30-50% 之间，而严重外伤的处理可要求将水平提高至50至100%。提高患者的血液水平需要的总单位数可如下确定1.0U/kg χ体重(kg)x期望百分比升高(％正常)。胃肠外施用可用初始推注，接着连续输注以维持药物产品的治疗循环水平来进行。在一些实施方案中，可施用 15至150U/kg FIX多肽。本领域普通技术人员会容易地优化有效剂量和施用方案，如通过优良医学实践和患者个体的临床状况确定的。给药频率会取决于药剂的药动学参数和施用的路径。可以由本领域技术人员根据施用的路径和期望的剂量来确定最佳药物配制剂(参见，例如，Remington' s Pharmaceutical SciencesiMack Publishing Co. ,Easton,Pa. , 20thedition, 2000, Mii^ 及收入本文)。此类配制剂可影响物理状态，稳定性，体内释放速率，和施用的药剂的体内清除速率。根据施用的路径，可根据体重，体表面积，或器官大小来计算合适的剂量。由本领域普通技术人员在无需过度实验的情况中，尤其是根据本文中公开的剂量信息和测定法，以及在动物或人临床试验中观察到的药动学数据，例行进行确定适宜治疗剂量所必需的对计算的进一步改进。例示性给药进度表包括，但不限于，一天施用五次，一天四次，一天三次， 一天两次，一天一次，一周三次，一周两次，一周一次，一月两次，一月一次，及其任意组合。适宜剂量可经由使用用于测定血液凝固水平的已确立的测定法联合相关剂量响应数据来确定。最终剂量方案可以由主治医师考虑改变药物的作用的因素来确定，例如，药物的比活性，损害的严重性，和患者的响应性，患者的年龄，状况，体重，性别和食谱，任何感染的严重性，施用的时间，和其它临床因素。例示性用途本文所述组合物可用于治疗与FIX的功能缺陷或FIX的缺陷诸如FIX体内半衰期缩短，FIX结合特性改变，FIX的遗传缺陷，和FIX血浆浓度降低有关的任何出血病症。FIX 的遗传缺陷包括，例如，编码FIX的核苷酸序列中碱基的删除，添加，和/或替代。在一个实施方案中，出血病症可以是血友病B。此类出血病症的症状包括，例如，严重鼻衄，口粘膜出血，关节积血，血肿，持续血尿，胃肠出血，腹膜后出血，舌/咽后出血，颅内出血，和外伤相关出血。本发明的组合物可用于预防性应用。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽可施用于对疾病状态或损伤易感或以其它方式处于疾病状态或损伤风险的受试者以增强受试者自身的凝固能力。这样的量可定义为“预防有效剂量”。为预防而施用经过修饰的FIX 多肽包括如下的情况，其中罹患血友病B的患者将要经历手术，并且在手术前1至4个小时之间施用该多肽。另外，该多肽适合于用作针对不受控制的出血的预防剂，任选在没有罹患血友病的患者中。如此，例如，该多肽可在手术之前施用于处于不受控制的出血风险的患者ο本文所述多肽，材料，组合物，和方法旨在作为本发明的代表性实施例，而且会理解，本发明的方法不限于实施例的范围。本领域技术人员会认识到可以在所公开的多肽，材料，组合物和方法有变化的情况中实施本发明，而且认为此类变化在本发明的范围内。呈现下述实施例以例示本文所述发明，但是不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例为了能更好地理解本发明，列出下述实施例。这些实施例仅仅为了例示的目的，而且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。通过述及完整收录本文中提及的所有出版物。实施例1 人因子IXcDNA的克隆根据公开的cDNA序列(NM_000133)设计与人FIX cDNA编码区5，和3，端处的库列互补的一对 PCR 引物。5，引物(FIXF1 ；ATCATAAGCTTGCCACCATGCAGCGCGTGAACATG(SEQ ID NO 3)，FIX的起始密码子以粗体显示)含有FIX编码区的头18个核苷酸，包括共有Kozak 序列(标有下划线)后面的ATG起始密码子和HindIII限制性位点。3，引物(FIXR3, ATC ATAAGCTTGATTAGTTAGTGAGAGGCCCTG) (SEQ ID NO 4)含有 FIX 序列中位于 FIX 编码区末端 3’ 45个核苷酸的22个核苷酸，前面有HindIII位点。使用这些引物和高保真校正聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)自正常人肝(Stratagene，San Diego, CA)扩增 cDNA 第一条链导致人FIX cDNA预期大小(1464bp)的单一条带。用HindIII消化之后，将PCR产物凝胶纯化，然后克隆入质粒pEAKflcmv的HindIII位点中。通过限制性消化来鉴定其中FIX cDNA 以相对于载体中的CMV启动子正向取向插入的克隆。对数个克隆的插入物实施双链DNA测序，而且衍生序列与FIX序列的比对证明了 cDNA编码成熟蛋白的氨基酸148处为苏氨酸的人FIX。将此质粒命名为pEAKflcmv-FIX。实施例2 经过修饰的因子IX多肽的生成为了改变人FIX序列内的各个氨基酸，使用Quickchange 引物设计程序 (Stratagene, San Diego, CA)设计一对引物。采用Quickchange II XL定点诱变试剂盒 (Mratagene，San Diego, CA)依照制造商的指令使用这些引物在pEAKf lcmv-FIX质粒中生成突变。通过完整FIX编码区的DNA测序来鉴定含有期望突变的克隆。用于创建突变的有义链寡核苷酸的序列显示于表1。表 权利要求
1.一种因子IX多肽，其包含通过引入一或多处氨基酸替代经过修饰的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含残基86处的氨基酸替代。
3.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含选自氨基酸残基85，86，和87的一或多处氨基酸替代。
4.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含选自氨基酸残基85，86，87，338，和410的一或多处氨基酸替代。
5.权利要求4的多肽，其中该一或多处氨基酸替代选自D85F；D85G ；D85H ；D85I ；D85M ； D85N ；D85R ；D85S ；D85W ；D85Y ；V86A ；V86D ；V86E ；V86G ；V86H ；V86I ；V86L ；V86M ；V86N ； V86P ；V86Q ；V86R ；V86S ；V86T ；T87F ；T87I ；T87K ；T87M ；T87R ；T87V ；T87W ；R338A ；R338F ； R338I ；R338L ；R338M ；R338S ；R338T ；R338V ；R338W ；E410N ；E410Q ；D85W 禾口 T87R ；D85F 和 T87I ；D85W 和 T87W ；D85R 和 T85R ；D85I 和 T87R ；D85Y 和 T87F ；D85I 和 T87M ；D85F 和 T87R ； D85F 和 T87V ；D85R 和 T87K ；D85H 和 T87I ；D85I 和 T87I ；D85Y 和 T87K ；D85S 和 T87R ；D85Y 和 T87R ；D85G 禾口 T87K ；D85H 禾口 T87W ；D85H 禾口 T87K ；D85F 禾口 T87K ；D85H 禾口 T87V ；D85M 和 T87I ；D85H 和 T87M ；R338A 和 E410N ；R338A 和 E410Q ；D85W, V86A,和 T87R ；D85F, V86A,和 T87I ；D85W, V86A，和 T87W ；D85R, V86A，和 T85R ；D85I, V86A，和 T87R ；D85Y, V86A，和 T87F ； D85I, V86A，和 T87M ；D85F, V86A，和 T87R ；D85F, V86A，和 T87V ；D85R, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87I ；D85I, V86A，和 T87I ；D85Y, V86A，和 T87K ；D85S, V86A，和 T87R ；D85Y, V86A, 和 T87R ；D85G, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87W ；D85H, V86A,和 T87K ；D85F, V86A,和 T87K ；D85H, V86A，和 T87V ；D85M, V86A，和 T87I ；D85H, V86A，和 T87M ；D85W, V86A, T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87I，和 R338A ；D85W, V86A, T87W,和 R338A ；D85R, V86A, T85R,和 R338A ； D85I, V86A, T87R，和 R338A ；D85Y, V86A, T87F，和 R338A ；D85I, V86A, T87M，和 R338A ；D85F, V86A, T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87V，和 R338A ；D85R, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87I，和 R338A ；D85I, V86A, T87I，和 R338A ；D85Y, V86A, T87K，和 R338A ；D85S, V86A, T87R, 和 R338A ；D85Y, V86A, T87R,和 R338A ；D85G, V86A, T87K,和 R338A ；D85H, V86A, T87W,和 R338A ；D85H, V86A, T87K,和 R338A ；D85F, V86A, T87K,和 R338A ；D85H, V86A, T87V,和 R338A ； D85M, V86A, T87I，和 R338A ；D85H, V86A, T87M,和 R338A ；D85W, V86A, T87R, R338A,和 E410N ； D85F, V86A, T87I, R338A，禾口 E410N ；D85W, V86A, T87W, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87F, R338A,和 E410N ； D85I, V86A, T87M, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87R, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410N ；D85R, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87I, R338A,和 E410N ； D85I, V86A, T87I, R338A，和 E410N ；D85Y, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410N ； D85H, V86A, T87W, R338A，和 E410N ；D85H, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87V, R338A,和 E410N ；D85M, V86A, T87I, R338A,和 E410N ； D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410N ；D85W, V86A, T87R, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87I, R338A,和 E410Q ；D85W, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410Q ； D85I, V86A, T87R, R338A，和 E410Q ；D85Y, V86A, T87F, R338A，和 E410Q ；D85I, V86A, T87M, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410Q ； D85R, V86A, T87K, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87I,R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ； D85Y, V86A, T87R, R338A，和 E410Q ；D85G, V86A, T87K, R338A，和 E410Q ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ； D85H, V86A, T87V, R338A，禾口 E410Q ；D85M, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87M, R338A，和E410Q ；及其任意组合。
6.一种因子IX多肽，其包含氨基酸序列 YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGD QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELX85X86X87CNIKNGRC EQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTR AETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPffQ VVLNGKVDAF CGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTE QKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNS YVTPICIADKEYTNiflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclx338stkftiynNMFCAGFHEGGRDSCQ⑶SGGPHVTEVEGTSFLTGIISffGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKX410KTKLT (SEQ ID NO 2)；其中)(85 选自 D，F，G，H，I, Μ, N，R，S，W，和 Y;其中 X86 选自 A，D，E，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，和 V ;其中 A7 选自 F，I, K, Μ, R，T，V，和 W;其中 X338 选自 A，F，I，L，M，R，S，T，V，和 W ;其中)C41Q选自E，N，*Q。
7.权利要求1至6任一项的多肽，其进一步包含一或多个糖基化位点。
8.—种药物制备物，其包含权利要求1至7任一项的因子IX多肽和药学可接受载体。
9.一种治疗血友病B的方法，其包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的权利要求 8的药物制备物。
10.一种DNA序列，其编码权利要求1至7任一项的多肽。
11.一种真核宿主细胞，其用依照权利要求10的DNA序列转染，转染的方式容许该宿主细胞表达因子IX多肽。
12.一种用于生产因子IX多肽的方法，其包括(i)通过引入一或多处氨基酸替代修饰该多肽的氨基酸序列；(ii)在细胞系中表达该多肽；并(iii)纯化该多肽。
13.权利要求7的多肽，其进一步包含附着至所述一或多个糖基化位点的一或多个糖模块。114.权利要求13的多肽，其中该一或多个糖模块是唾液酸。
14.一种缀合物，其包含a)权利要求13或14的多肽，和b)共价附着至其的一或多个聚合物模块。
15.权利要求14的缀合物，其中该一或多个聚合物模块共价附着至一或多个糖模块。
16.权利要求15的缀合物，其中该一或多聚合物模块选自下组聚亚烷基二醇，聚(丙二醇)(“ppg”)，乙二醇和丙二醇的共聚物等等，聚(乙氧基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟基烃基甲基丙烯酰胺)，聚(羟基烃基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚 (0-羟基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚埸唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，聚唾液酸，羟乙基淀粉(HEQ，聚氧化乙烯，烃基-聚氧化乙烯，二聚氧化乙烯，聚氧化烯的共聚物或嵌段共聚物，聚(乙二醇-共-丙二醇)，聚(N-2_(羟基丙基)甲基丙烯酰胺)，和右旋糖酐。
17.该权利要求16的缀合物，其中该一或多个聚合物模块是聚亚烷基二醇。
18.权利要求17的缀合物，其中该聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
19.一种缀合物，其包含a)因子IX多肽，其包含通过引入一或多处氨基酸替代经过修饰的氨基酸序列，其中至少一处氨基酸替代位于残基338 ；b)附着至所述一或多个糖基化位点的一或多个糖模块；和c)共价附着至一或多个糖模块的一或多个聚合物模块。
20.权利要求19的缀合物，其中所述残基338处的替代选自下组R338A，R338F， R338I, R338L, R338M, R338S, R338T, R338V，和 R338W。
21.权利要求19或20的缀合物，其中所述多肽进一步包含选自氨基酸残基157和167 的一或多处氨基酸替代。
22.权利要求21的缀合物，其中所述残基157处的替代选自下组N157A和W57Q。
23.权利要求21的缀合物，其中所述残基167处的替代选自下组N167A和W67Q。
24.一种用于改善聚合物模块对多肽的缀合的方法，其包括a)提供具有一或多个糖基化位点的多肽，其中该糖基化位点包含一或多个唾液酸；b)氧化所述多肽的所述唾液酸；c)提供催化剂；并d)将包含氨基-氧官能团的聚合物模块共价附着至所述氧化后的唾液酸；由此缀合速率得到提高。
25.权利要求24的方法，其中所述催化剂选自下组苯胺和苯胺衍生物诸如o-Cl-， ρ-Cl-, O-CH3O-, P-CH3O-,和 P-CH3-苯胺。
26.权利要求对的方法，其中所述缀合速率相对于没有该催化剂的情况得到提高。
全文摘要
本发明涉及经过修饰的因子IX多肽诸如具有一或多处氨基酸替代的因子IX多肽。本发明还涉及用于生成经过修饰的因子IX多肽的方法，及使用经过修饰的因子IX多肽，例如，治疗罹患血友病B的患者的方法。
文档编号A61K38/36GK102573890SQ201080043135
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月2日 优先权日2009年7月31日
发明者A.布鲁克斯, C.帕特尔, H.阿佩勒, U.格里赞, 王俊, 蒋晓乔 申请人:拜耳医药保健有限公司