一种电化学基因传感器法检测华法林敏感性基因的试剂盒的制作方法
【专利摘要】华法林敏感性基因检测试剂盒(电化学基因传感器法)是以一种电化学基因传感器技术快速检测人基因组中法林敏感性基因的试剂盒，该试剂盒适用于定性检测人外周血、各种组织和细胞等临床样本中细胞色素CYP2C9基因*2，*3，*5等位基因型和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)基因-1639G＞A、1173C＞T等位基因型，上述基因型有助于临床鉴别对华法林药物敏感性增加的患者，能够快速确定华法林剂量范围，保证疗效，减少出血风险。把华法林的基因检测结果和INR监控相结合，可以更有效、迅速地调整华法林维持剂量，从而在达到疗效的同时减少华法林的出血风险。
【专利说明】一种电化学基因传感器法检测华法林敏感性基因的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种电化学基因传感器法检测华法林敏感性基因的试剂盒，特别是涉及以一种电化学基因传感器技术快速检测人基因组中华法林敏感性基因的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性。通过本发明的试剂盒，实现对人体细胞、抗凝全血、或组织等样品中的人基因组中的法林敏感性基因进行快速检测和分析。
【背景技术】
[0002]1998年底美国科学促进会将电化学基因传感器技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。
[0003]生物芯片以其高通量、多靶位的检测模式正在被越来越多地应用于生物科学领域。以印刷电路板为载体的微阵列芯片，更以其高效、高通量、低价位等特点，已经广泛用于基础研究和临床筛查、辅助诊断。
[0004]微阵列芯片包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗体芯片等，电化学基因传感器芯片以特殊化学方法处理后的印刷电路板为载体，将各种探针或靶标片段以化学键结合的方式固定在印刷电路板表面，并 利用二茂铁衍生物作为电化学指示剂，形成可用于杂交反应或抗原抗体反应的微阵列芯片。
[0005]华法林(warfarin)是香豆素类口服抗凝药，是目前国内外最常用的长效抗凝药，多用于人工瓣膜置换、静脉血栓形成(肺栓塞)、房颤等的口服抗凝治疗。其抗凝效果常以凝血酶原时间(prothrombin time, PT)及国际标准化比率(international normalizedratio, INR)作为监测指标。目前临床上华法林的给药方案通常采用首先给予一定标准剂量，然后临床医生根据每个患者INR值的情况，增加或减少剂量直至INR达到靶标。但是在这样的抗凝疗法中，调整剂量的周期较长，患者发生血栓或出血的可能性较高。
[0006]造成华法林用量个体差异的原因很多，可分为非遗传因素和遗传因素。非遗传因素主要有年龄、性别、体表面积、药物的相互作用、饮食习惯和疾病状态等。然而，非遗传因素的影响程度较为有限，并非华法林用量个体差异的主要原因。近年来，随着药物基因组学的进展和华法林药理作用分子机制的阐明，遗传因素在华法林用量个体差异中的作用越来越受到人们的重视。目前，已知与华法林的药效学和药动学相关的基因达30余种，其中维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位I基因(VK0RC1)的基因多态性和细胞色素P4502C9基因(CYP2C9)是影响华法林用量个体差异最主要的两个遗传因素。
[0007]VK0RC1和CYP2C9是目前所知影响华法林用量个体差异最主要的遗传因素，已有学者对这两个基因在华法林个体差异中的贡献大小进行了研究。这些研究显示CYP2C9和VK0RC1的多态性对华法林用量个体差异的贡献比例分别5~22%和6~37%。将VK0RC1和CYP2C9的多态性与非遗传因素，如年龄、性别、体重、合用药物和治疗疾病等相结合，可解释华法林用量个体差异原因的33.3%~60.8%。在中国人群中，Veenstra等报道VK0RC1、CYP2C9、年龄、性别可解释香港中国人华法林用量个体差异原因的60.8%，其中VKORCl和CYP2C9的贡献是31%和7.9%。Miao等报道的另一组中国人中，VKORCl和CYP2C9对华法林用量个体差异的贡献分别是49.4%和1.7%。
【发明内容】
[0008]本发明涉及一种电化学基因传感器法检测华法林敏感性基因的试剂盒，特别是涉及以一种电化学基因传感器技术快速检测人基因组中法林敏感性基因的试剂盒。本试剂盒可以检测人体细胞、抗凝全血、或组织等样品中的人基因组中的法林敏感性基因。
[0009]本发明适用于定性检测人外周血、各种组织和细胞等临床样本中细胞色素CYP2C9基因*2，*3，*5等位基因型和维生素K环氧化物还原酶复合体I (VKORCl)基因-1639G >AU173C > T等位基因型共5个华法林敏感基因SNP位点。 [0010]本发明的目的是提供一种使用电化学基因传感器技术来定性检测样品中华法林敏感性基因的试剂盒，特别是涉及医生对患者的华法林用药量的判断应用。其基本原理是利用四对寡核苷酸的特异性引物在UNG酶、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Mg2+和PCR反应缓冲液中，通过ABI2700、ABI9700等市售的定性PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，获得多重扩增产物；设计的特异性捕获探针分别固定在特制的印刷电路板金电极表面，制备成电化学传感器(芯片)，用于捕获PCR多重扩增产物；特异性信号探针与已捕获的PCR产物特异结合。由于信号探针标记有二茂铁分子，通过夹心杂交产生电流的变化，应用电化学基因传感器分析系统检测出电流值(信号值)，并对各个SNP位点的碱基进行判定，从而达到快速检测靶多核苷酸的目的，用以指导临床用药。
[0011]本发明所提供的检测样品中华法林敏感性基因的试剂盒包括:⑴分别装有PCR扩增反应液、PCR扩增反应酶系、电化学杂交液、空白对照、华法林敏感性基因质控品和阳性参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的24条引物包括:
[0012]正向引物W*2-F1 的序列是:5' -GGATCTCCCTCCTAGTTTCG-3' (SEQ ID NO:1),
[0013]正向引物W*2-F2 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTT-3' (SEQ ID NO:2)，
[0014]正向引物W*2-F3的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTTTCTCT-3' (SEQ ID NO:3)，
[0015]反向引物W*2-R1 的序列是:5' -GTAAGGTCAGTGATATGGAGT-3' (SEQ ID NO:4)，
[0016]反向引物W*2-R2的序列是:5' -CCTTGGTTTTTCTCAACTCCTCC-3' (SEQ ID NO:5),
[0017]反向引物W*2-R3 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTT-3' (SEQ ID NO:6),
[0018]正向引物W*3/5-Fl 的序列是:5' -CAGGAAGAGATTGAACGTG-3' (SEQ ID NO:7)，
[0019]正向引物W*3/5-F2的序列是:5' -AGTTTTTACTTGTGTCTTATCAG-3' (SEQ ID NO:8),
[0020]正向引物肿3/5-F3 的序列是:5' -TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3; (SEQ ID NO:9)，
[0021]反向引物肿3/5-R1 的序列是:5' -AAACAAACTTACCTTGGGAAT-3; (SEQ ID NO: 10)，
[0022]反向引物肿 3/5-R2 的序列是:5' -CGAMACATGGAGTTGCAGTGTAG-3' (SEQ ID NO: 11),
[0023]反向引物肿3/5-R3的序列是:5, -GTTGCAGTGTAGGAGAAACAAACTT-3; (SEQ ID NO:12),
[0024]正向引物W1173F1 的序列是:5' -TGACATGGAATCCTGACGT-3' (SEQ ID NO: 13)，
[0025]正向引物W1173F2 的序列是:5' -ACATGGAATCCTGACGTGGC-3' (SEQ ID NO:14),
[0026]正向引物Wl 173F3 的序列是:5' -GTATGACATGGMTCCTGACGTG-3' (SEQ ID NO: 15)，[0027]反向引物W1173R1 的序列是:5' -GMCCAGGTTAGGACTGTCMC-3' (SEQ ID NO:16),
[0028]反向引物Wl 173R2 的序列是:5' -GTGGMCCAGGTTAGGACTGTC-3' (SEQ ID NO: 17)，
[0029]反向引物W1173R3 的序列是:5' -CTGTCAACCCAGTGCCTTGG-3' (SEQ ID NO:18),
[0030]正向引物W1639F1 的序列是:5' -AGGGTAGGTGCAACAGTAA-3' (SEQ ID NO: 19)，
[0031]正向引物 W1639F2 的序列是:5' -AGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA-3; (SEQ ID NO:20)，
[0032]正向引物 W1639F3 的序列是:5' -CAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAAG-3; (SEQ ID NO:21),
[0033]反向引物 W1639R1 的序列是:5' -CMGACGCTAGACCCMTGGTTATT-3' (SEQ ID NO:22)，
[0034]反向引物 W1639R2 的序列是:5' -CCTGACCTCMGTGATCCACCC-3' (SEQ ID NO:23)，
[0035]反向引物 W1639R3 的序列是:5' -CACCMGACGCTAGACCCMTG-3' (SEQ ID NO:24)。
[0036]根据本发明的一个优选实施方案，电化学杂交液中用于特异性结合PCR产物并指示各个SNP位点的碱基的寡核苷酸信号探针有27条包括:
[0037]2C9star2.WT.SPl 的序列是:5' -GAACACGGTCCT-3' (SEQ ID NO:25)，
[0038]2C9star2.WT.SP2 的序列是:5' -TGAACACGGTCCT-3' (SEQ ID NO:26)，
[0039]2C9star2.WT.SP3 的序列是:5' -AACACGGTCCT-3' (SEQ ID NO:27)，
[0040]2C9star2.MUT.SPl 的序列是:5' -GAACACAGTCCTCAA-3' (SEQ ID NO:28)，
[0041]2C9star2.MUT.SP2 的序列是:5' -TGAACACAGTCCTCAA-3' (SEQ ID NO:29)，
`[0042]2C9star2.MUT.SP3 的序列是:5' -TTGAACACAGTCCTCAA-3' (SEQ ID NO:30)，
[0043]2C9star3/5.WT.SPl 的序列是:5' -GAAGGTCAATGTAT-3' (SEQ ID NO:31)，
[0044]2C9star3/5.WT.SP2 的序列是:5' -GAAGGTCAATGTATC-3' (SEQ ID NO:32)，
[0045]2C9star3/5.WT.SP3 的序列是:5' -GAGAAGGTCAATGTATC-3' (SEQ ID NO:33)，
[0046]2C9star3.MUT.SPl 的序列是:5' -GAAGGTCAAGGTAT-3' (SEQ ID NO:34)，
[0047]2C9star3.MUT.SP2 的序列是:5' -GAGAAGGTCAAGGTATC-3' (SEQ ID NO:35)，
[0048]2C9star3.MUT.SP3 的序列是:5' -GAAGGTCAAGGTATC-3' (SEQ ID NO:36)，
[0049]VKORCl 1173C > T.WT.SPl 的序列是:5' -TCCAAGGGTCGAT-3' (SEQ ID NO:37)，
[0050]VKORCl 1173C>T.WT.SP2 的序列是:5' -AGTCCAAGGGTCG-3' (SEQ ID NO:38)，
[0051]VKORCl 1173C > T.WT.SP3 的序列是:5' -TCCAAGGGTCG-3' (SEQ ID NO:39)，
[0052]VKORCl 1173C > T.MT.SPl 的序列是:5' -TCCAAGAGTCG-3' (SEQ ID NO:40)，
[0053]VKORCl 1173C> T.MT.SP2 的序列是:5' -AGTCCMGAGTCGATG-3' (SEQ ID NO:41),
[0054]VKORCl 1173C> T.MT.SP3 的序列是:5' -TCCAAGAGTCGATG-3' (SEQ ID NO:42),
[0055]VK0RC1-1639G > A.WT.SPl 的序列是:5' -GCACCCGGCCA-3' (SEQ ID NO:43)，
[0056]VK0RC1-1639G>A.WT.SP2 的序列是:5' -CGCACCCGICCAAT-3' (SEQ ID NO:44),
[0057]VK0RC1-1639G>A.WT.SP3 的序列是:5' -GCACCCGACCAATG-3' (SEQ ID NO:45),
[0058]VK0RC1-1639G > A.MT.SPl 的序列是:5' -GCACCTGGCCA-3' (SEQ ID NO:46)，
[0059]VK0RC1-1639G > A.MT.SP2 的序列是:5' -GCACCTGGCCAA-3' (SEQ ID NO:47)，
[0060]VK0RC1-1639G > A.MT.SP3 的序列是:5' -GCACCTGGACMTGG-3' (SEQ ID NO:48)，
[0061]2C9star5.MUT.SPl 的序列是:5' -GAAGCTCAATGTAT-3' (SEQ ID NO:49),
[0062]2C9star5.MUT.SP2 的序列是:5' -GAGAAGCTCAATGTATCTCT-3' (SEQ ID NO:50)，
[0063]2C9star5.MUT.SP3 的序列是:5' -GAGAAGCTCAATGTATCT-3' (SEQ ID NO:51)。
[0064]根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶(Taq酶)、(b) UNG酶、(c)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、(d)能够分别与4条双链靶多核苷酸的第一条链结合的4条正向引物，(e)能够分别与双链靶多核苷酸的第二条链结合的4条反向引物。
[0065]根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的各引物的工作浓度分别为 0.1 μ mol/L W*2-F1、0.1 μ mol/L W*2_F2、0.1 μ mol/L W*2_F3、0.1 μ mol/LW*3/5-Fl、0.1 μ mol/L W*3/5_F2、0.1 μ mol/L W*3/5_F3、0.1 μ mol/L W1173FU0.1 μ mol/L W1173F2.0.1 μ mol/L W1173F3、0.1 μ mol/L W1639FU0.1 μ mol/L W1639F2、0.1 μ mol/L W1639F3.0.01ymol/L ff*2-RU0.01 μ mol/L W*2_R2、0.01 μ mol/L W*2_R3、0.02 μ mol/L W*3/5-Rl、0.02μmol/L W*3/5_R2、0.02 μmol/L W*3/5_R3、0.01 μmol/L W1173R1、0.01 μ mol/L W1173R2.0.01 μ mol/L W1173R3.0.01 μ mol/L W1639RU0.01 μ mol/LW1639R2.0.01 μ mol/L W1639R3。
[0066]根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应酶系由(a)耐热DNA聚合酶(Taq酶)、(b) UNG酶、(c)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)组成。
[0067]根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液及酶系中的镁离子最佳浓度为5mmol/L、耐热Taq酶最佳用量为8U/反应、UNG酶最佳用量为0.1U/反应、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳浓度为0.24mmol/Lo
[0068]根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为:50°C 3min ;然后 95°C 预变性 15min ;最后 94°C 30s, 56°C 35s, 72 °C 40s45 个循环；72 °C 7min。
[0069]根据本发明的另一个优选实施方案，其中电化学杂交液包括杂交液1、杂交液I1、杂交液III三种，杂交液I的主要成分为上述的9种信号探针(SEQ ID NO:25~SEQ IDNO:51)，每种信号探针的浓度均为0.175pmol/yL ;杂交液II的主要成分为蛋白质；杂交液III的主要成分为高氯酸钠，其浓度为0.8mol/L。
[0070]根据本发明的另一个优选实施方案，其中空白对照为灭菌纯化水。
[0071]根据本发明的另一个优选实施方案，其中华法林敏感性基因质控品为含有已扩增好的华法林敏感性基因常见型别片段的DNA，双链DNA浓度为30ng/ μ L。
[0072]本发明提供的检测试剂盒可以检测出人基因组DNA的最低浓度为IOng/μ L，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。
[0073]本发明针对人基因组中的法林敏感性基因片段设计特异引物和探针，可检测出人基因组中的法林敏感性基因,但不能检测出人基因组中的非法林敏感性基因片段,说明本试剂盒具有很好的特异性。
[0074]本发明提供的检测试剂盒可以灵敏、快速地检测人体细胞、抗凝全血、或组织等样品中的人基因组中的华法林敏感性基因的型别；可为华法林的临床用药量提供可靠的实验证据，有效降低华法林用药不当造成的患者出血风险，还可对疗效进行有效监测。
【专利附图】
【附图说明】
[0075]图1显示华法林敏感性基因检测结果
[0076]图2显示华法林敏感性基因检测结果【具体实施方式】
[0077]下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
[0078]实施例1:华法林敏感性基因检测试剂的研制
[0079]1、引物和探针的设计:通过对Genebank数据库已有的人基因组上的华法林敏感性基因序列以及国内外已发表文献中报导的相关核酸序列进行序列比对分析，以华法林敏感性基因的保守片段为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件，人工设计多对引物和探针。
[0080]2、样本的选择:根据国内外相关文献报道表明，可以选择人体细胞、抗凝全血、或组织等样品。
[0081]3、反应体系的建立与优化
[0082]样品的准备:以临床收集的经验证为华法林药物敏感性基因检测位点有突变的抗凝全血样本6例和体外培养的人细胞样本2例作为阳性参考品，用吸附法提取上述阳性参考品的人基因组DNA，待用。
[0083]引物探针的筛选:以上述I中设计的多组引物探针分别检测上述的由阳性参考品提取的人基因组DNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合:序列表中 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO:51。
[0084]引物浓度的优化:在反应体系中其他组分不变的情况下，上下游引物量比例由4/1至20/1的梯度，分别使用从0.05 μ mol/L至0.30 μ mol/L浓度梯度的上游引物进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的各引物的工作浓度分别为0.1 μ mol/L ff*2-FU0.1 μ mol/L W*2_F2、0.1 μ mol/L W*2_F3、0.1 μ mol/L W*3/5_F1、0.1 μ mol/LW*3/5-F2、0.1 μ mol/L W*3/5_F3、0.1 μ mol/Lffl 173FU0.1 μ mol/L W1173F2、0.1 μ mol/L W1173F3、0.1 μ mol/L W1639FU0.1 μ mol/LW1639F2、0.1，μ mol/L W1639F3、0.01 μ mol/L ff*2-RU0.01ymol/L W*2_R2、0.01 μ mol/LW*2_R3、0.02 μ mol/L ff*3/5-RU0.02 μ mol/L W*3/5-R2、0.02 μmol/L W*3/5_R3、0.01 μmol/LWl173R1、0.01 μmol/L W1173R2、0.01 μ mol/L W1173R3.0.01 μ mol/L W1639RU0.01 μ mol/LW1639R2、0.01 μ mol/LW1639R3。
[0085]热启动Taq酶用量的优化:在50 μ L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从4U (酶单位)至10U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的Taq酶用量为6U/反应。
[0086]UNG酶用量的优化:在50μ L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从
0.05U (酶单位)至0.2U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的UNG酶用量为0.1U/反应。
[0087]dNTPs浓度的优化:在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.lmmol/L至0.28mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为 0.24mmol/L0
[0088]加样量的优化:在反应体系中其他组分不变的情况下，分别测试从5 μ L至15 μ L梯度的加样量，进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳加样量为10 μ L。
[0089]反应温度的优化:根据酶的活性和寡多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为:50°C 3min，95°C预变性 15min ;然后 94°C 30s, 56°C 35s，72°C 40s, 40 个循环；最后 72°C延伸 7min。
[0090]杂交液I中信号探针浓度的优化:在杂交反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1Opmol/人份至0.20pmol/人份浓度梯度的信号探针进行杂交反应，经多次重复试验，最终确定最佳的每种信号探针的浓度均为0.175pmol/ μ L。
[0091]杂交液II量的优化:在杂交反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5 μ L至15 μ L梯度的杂交液II进行杂交反应，经多次重复试验，最终确定最佳的杂交液II量为10 μ Lo
[0092]杂交液III浓度的优化:在杂交反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从 0.4mol/L至1.5mol/L梯度的杂交液III进行杂交反应,经多次重复试验,最终确定最佳的杂交液III浓度为0.8mol/L。
[0093]4、最低检出量实验:将人基因组浓度为20ng/μ L的由人抗凝全血提取的DNA梯度稀释成IOng/ μ L，5ng/ μ L，2ng/ μ L，lng/ μ L，0.5ng/ μ L作为线性与最低检出量参考品，进行PCR检测分析，当DNA浓度为Ing/μ L时，检测样品在反应体系中的量为10ng，仍能检测到各位点有正常信号值，即最低检出量可达到10ng。
[0094]5、标本检测:以人体细胞、抗凝全血、或组织等样品作为待检标本，分别用吸附法提取标本的DNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明:本试剂盒可以很灵敏的检测出临床标本中的华法林药物敏感性基因位点。
[0095]实施例2:华法林敏感性基因检测试剂盒(电化学基因传感器法)及其使用
[0096]1、制备包括下列组成成分的试剂盒:华法林PCR反应液A(888 μ L/管)I管、华法林PCR反应液B (72 μ L/管)1管、华法林敏感性基因质控品(50 μ L/管)1管、空白对照(50 μ L/管)1管、杂交液I (1680 μ L/管)1管、杂交液II (240 μ L/管)I管、杂交液III (480 μ L/管)I管、电化学传感器(芯片)(8个/包)3包。
[0097]2、标本采集、运送和保存
[0098]2.1适用样本类型:抗凝全血等。
[0099]2.2样品采集与前处理(注意无菌操作):用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2mL,注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。
[0100]2.3保存与运送:标本可立即用于测试；在-20±5°c保存期为9个月；若要长期保存，需储存于_80±5°C ;标本应避免反复冻融。标本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封运输，运输时间不应超过7天。
[0101]3、检测步骤
[0102](I)基因组DNA提取
[0103]建议取200 μ L样本进行核酸提取。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的全血基因组提取试剂盒，该试剂盒可用于对人全血基因组DNA的提取，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。
[0104](2) PCR 扩增
[0105]取适量PCR反应管，每管加入华法林PCR反应液Α37μ L、华法林PCR反应液Β3 μ L (也可根据PCR反应用量，计算各组分所需总量，混匀后分装40 μ L于单个PCR反应管中)；于上述PCR反应管中分别加入提取后的样本核酸10 μ L，另取两管分别加入华法林敏感性基因质控品和空白对照各?ο μ L，8，OOOg离心数秒，放入PCR扩增仪。在适用的仪器上按照下列条件进行PCR循环程序的设置:50°C 3分钟，95°C预变性15分钟，然后按94°C 30秒一56 0C 35秒一72 0C 40秒扩增，45个循环，最后72°C延伸7分钟。
[0106](3)杂交操作
[0107]取一 0.2mL的离心管，依次加入70 μ L杂交液1,10 μ L杂交液II, 20 μ L杂交液III以及25 μ LPCR产物，充分混匀(注意尽量不要有气泡)，将混匀的液体移入电化学传感器(芯片)的管中，压紧管盖。在传感器插入DA9000仪器(由中山大学达安基因股份有限公司自主研发的与本试剂盒匹配的专用杂交检测仪)的检测模块前，检查是否已正确地标记，确认样本管的序列号与传感器是否匹配。然后选定与本试剂盒匹配的专用杂交检测程序，开始运行。大约30min后，杂交完成，输出报告单。
[0108](4)结果分析
【权利要求】
1.一种检测华法林敏感性基因的试剂盒，该试剂盒包括:(1)分别装有PCR扩增反应液、PCR扩增反应酶系、电化学杂交液、空白对照、华法林敏感性基因质控品和阳性参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的24条引物包括: 正向引物 W*2-F1 的序列是:5' -GGATCTCCCTCCTAGTTTCG-3'， 正向引物 W*2-F2 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTT-3'， 正向引物 W*2-F3 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTTTCTCT-3'， 反向引物 W*2-R1 的序列是:5' -GTAAGGTCAGTGATATGGAGT-3'， 反向引物 W*2-R2 的序列是:5' -CCTTGGTTTTTCTCAACTCCTCC-3'， 反向引物 W*2-R3 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTT-3'， 正向引物 W*3/5-Fl 的序列是:5' -CAGGAAGAGATTGAACGTG-3'， 正向引物 W*3/5-F2 的序列是:5' -AGTTTTTACTTGTGTCTTATCAG-3'， 正向引物 W*3/5-F3 的序列是:5' -TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3'， 反向引物 W*3/5-Rl 的序列是:5' -AAACAAACTTACCTTGGGAAT-3'， 反向引物 W*3/5-R2 的序列是:5' -CGAAAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3'， 反向引物 W*3/5-R3 的序列是:5' -GTTGCAGTGTAGGAGAAACAAACTT-3'， 正向引物 W1173F1 的序列是:5' -TGACATGGAATCCTGACGT-3'， 正向引物 W1173F2 的序列是:5' -ACATGGAATCCTGACGTGGC-3'， 正向引物 W1173F3 的序列是:5' -GTATGACATGGAATCCTGACGTG-3'， 反向引物 W1173R1 的序列是:5' -GAACCAGGTTAGGACTGTCAAC-3'， 反向引物 W1173R2 的序列是:5' -GTGGAACCAGGTTAGGACTGTC-3'， 反向引物 W1173R3 的序列是:5' -CTGTCAACCCAGTGCCTTGG-3'， 正向引物 W1639F1 的序列是:5' -AGGGTAGGTGCAACAGTAA-3'， 正向引物 W1639F2 的序列是:5' -AGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA-3'， 正向引物 W1639F3 的序列是:5' -CAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAAG-3'， 反向引物 W1639R1 的序列是:5' -CAAGACGCTAGACCCAATGGTTATT-3'， 反向引物 W1639R2 的序列是:5' -CCTGACCTCAAGTGATCCACCC-3'， 反向引物 W1639R3 的序列是:5' -CACCAAGACGCTAGACCCAATG-3'。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中的各引物的工作浓度分别为 0.1 μ mol/L W*2-F1、0.1 μ mol/L W*2_F2、0.1 μ mol/L W*2_F3、0.1 μ mol/LW*3/5-Fl、0.1 μ mol/L W*3/5_F2、0.1 μ mol/L W*3/5_F3、0.1 μ mol/L W1173FU0.1 μ mol/L W1173F2.0.1 μ mol/L W1173F3、0.1 μ mol/L W1639FU0.1 μ mol/L W1639F2、0.1 μ mol/L W1639F3.0.01ymol/L ff*2-RU0.01 μ mol/L W*2_R2、0.01 μ mol/L W*2_R3、0.02 μ mol/L W*3/5-Rl、0.02μ mol/L W*3/5_R2、0.02 μ mol/L W*3/5_R3、0.01 μ mol/L W1173RU0.01 μ mol/L W1173R2、0.01 μ mol/LW1173R3、0.01 μ mol/LW1639Rl、0.01 μ mol/LW1639R2、0.01ymol/LW1639R3。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中耐热DNA聚合酶的浓度为8U/反应。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中UNG酶的浓度为.0.1U/反应。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中dNTPs的浓度为.0.24mmol/L0
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于用于PCR扩增反应条件为:50°C3min ；.95°C 15min ；94°C 30s, 56°C 35s,72°C 40s, 45 个循环；72°C 7min。
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于电化学杂交液包括杂交液1、杂交液I1、杂交液III三种，杂交液I的主要成分为9种信号探针；杂交液II的主要成分为蛋白质；杂交液III的主要成分为高氯酸钠。
8.根据权利要求7所述的电化学杂交液，其特征还在于电化学杂交液I中用于特异性结合PCR产物并指示各个SNP位点的碱基的寡核苷酸信号探针有27条包括: 2C9star2.WT.SPl 的序列是:5' -GAACACGGTCCT-3'， 2C9star2.WT.SP2 的序列是:5' -TGAACACGGTCCT-3'， 2C9star2.WT.SP3 的序列是:5' -AACACGGTCCT-3'， 2C9star2.MUT.SPl 的序列是:5' -GAACACAGTCCTCAA-3'， 2C9star2.MUT.SP2 的序列是:5' -TGAACACAGTCCTCAA-3'， 2C9star2.MUT.SP3 的序列是:5' -TTGAACACAGTCCTCAA-3'， 2C9star3/5.WT.SPl 的序列是:5' -GAAGGTCAATGTAT-3'， 2C9star3/5.WT.SP2 的序列是:5' -GAAGGTCAATGTATC-3'， 2C9star3/5.WT.SP3 的序列是:5' -GAGAAGGTCAATGTATC-3'， 2C9star3.MUT.SPl 的序列是:5' -GAAGGTCAAGGTAT-3'， 2C9star3.MUT.SP2 的序列是:5' -GAGAAGGTCAAGGTATC-3'， 2C9star3.MUT.SP3 的序列是:5' -GAAGGTCAAGGTATC-3'， VKORCl 1173C > T.WT.SPl 的序列是:5' -TCCAAGGGTCGAT-3'， VKORCl 1173C > T.WT.SP2 的序列是:5' -AGTCCAAGGGTCG-3'， VKORCl 1173C > T.WT.SP3 的序列是:5' -TCCAAGGGTCG-3'， VKORCl 1173C > T.MT.SPl 的序列是:5' -TCCAAGAGTCG-3'， VKORCl 1173C > T.MT.SP2 的序列是:5' -AGTCCAAGAGTCGATG-3'， VKORCl 1173C > T.MT.SP3 的序列是:5' -TCCAAGAGTCGATG-3'， VK0RC1-1639G > A.WT.SPl 的序列是:5' -GCACCCGGCCA-3'， VK0RC1-1639G > A.W T.SP2 的序列是:5' -CGCACCCGICCAAT-3'， VK0RC1-1639G > A.WT.SP3 的序列是:5' -GCACCCGACCAATG-3'， VK0RC1-1639G > A.MT.SPl 的序列是:5' -GCACCTGGCCA-3'， VK0RC1-1639G > A.MT.SP2 的序列是:5' -GCACCTGGCCAA-3'， VK0RC1-1639G > A.MT.SP3 的序列是:5' -GCACCTGGACAATGG-3'， 2C9star5.MUT.SPl 的序列是:5' -GAAGCTCAATGTAT-3'， 2C9star5.MUT.SP2 的序列是:5' -GAGAAGCTCAATGTATCTCT-3'， 2C9star5.MUT.SP3 的序列是:5' -GAGAAGCTCAATGTATCT-3'。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所检测的样品可选自但不局限于人体细胞、抗凝全血、或组织等样品。
【文档编号】C12Q1/68GK103627789SQ201310366835
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年8月21日 优先权日:2013年8月21日
【发明者】陈华云, 李明, 肖湘文, 赵丽, 黄桃生 申请人:中山大学达安基因股份有限公司